Pre'pa7'aUon des protéines du sérum. Le

sérum du sang de cheval ou de bœuf renferme de 7 à 8 **/ude protéines, dont 4,5 globidine et3 "/o d’al-

bumine environ. On prend lOÜ centimètres cubes de sérum de cheval, et on y ajoute, en remuant constamment, un volume égal de solution de sulfate d’ammonium saturée à une température de 50 à 00'’, filtrée et abandonnée ensuite au refroidissement. II se fait un abondant précipité blanc de sérum-globuline (pie l'on recueille sur un filtre. On égoutte, on lave avec un mélange à parties égales d’eau et de solution saturée de sulfate d’ammonium, puis on essore entre des doubles de papier à fillrer. La globuline, redissou te

PROTÉINES ANIMALES

dans le moins possible d’eau tiède, peut être isolée par dialyse, ou insolubilisée par cbaufl'age à l’ébullition. Dans ce dernier cas, on recueille sur un filtre, on lave à l’eau bouillante et on fait sécber.

Le liquide dont on a précipité la globuline, étant additionné de sulfate d’ammonium pulvérisé jusqu’à saturation, donne un nouveau précipité blanc, formé de sérum-albumine, que l’on peut recueillir et laver comme la globuline.

274. — Séparation des protéines du blanc d'œuf. Le blanc d’œuf de poule contient 10 à 13 de protéines. Pour en isoler la globuline, on divise un blanc d’œuf avec des ciseaux, aussi bien que possible, et on l’étend avec un volume à peu près égal d’eau, ce qui produit un léger trouble. On fait disparaître celui-ci par addition de quelques gouttes de solution de chlorure de sodium, puis on neutralise avec de l’acide acétique à 10 ‘’/o’ goutte à goutte, et enfin on passe à travers une toile. Le liquide est recueilli dans une éprouvette graduée ; on lui ajoute son volume de solution saturée de sulfate d'ammonium et on obtient par agitation un précipité blanc d’ovoglobuline que l’on recueille sur un filtre.

Le liquide filtré renferme l’ovalbumine et l’ovomucoïde. Par addition d’acide acétique à 10 “/„ il se produit un précipité blanc d’ovalbumine qui est recueilli sur un tiltre. On l’égoutte, on l’essore et on le redissout dans le moins possible d’eau tiède. La solution, saturée par agitation avecdu sulfate d’ammonium pulvérisé en léger excès, laisse de nouveau précipiter l’ovalbumine. On la recueille sur un filtre, et on la lave avec la solution saturée de sulfate d’ammonium,

228 SUBSTANCES PROTÉIQUES. PROTÉINES

Cristallisation de l’albumine

275. — Cristallisai ion de la sérum-albumine. L’albiiminedu séiTim peut, dans certaines conditions, donner des cristaux qui paraissent être une combinaison d’albnmine avec des quantités variables d’acide sulfurique.

Pour obtenir ces cristaux, on ajoute à 20 ccntimèlres cubes de sérum frais de cheval un égal volume de solution salni'ée de sulfate d'ammonium, afin de séparer la globuline. Le liquide filtré, limpide, est additionné goutte à goutte de sulfate d’ammonium jusqu'à commencement de précipitation, puis le louche redissous au moyen de quelques gouttes d’eau. On verse alors, en agitant, de l'acide sulfurique normal jusipi’à ce que le trouble formé ne se redissolve plus, et on abandonne au frais. 11 se produit peu à peu un précipité qui, après

Fig. 28. — Sérum-albumine cristallisée.

PnÉPAHATlON DU FIBRINOGÈNE

12 à 24 heures, se montre formé de cristaux caractéristiques, en forme de nacelles [fig. 28). Si l’addition d’acide sulfurique déterminait de suite un abondant précipité, on redissoudrait celui-ci avec quelques gouttes d’ammoniaque diluée, puis on ajouterait de nouveau l’acide normal jusqu’à trouble léger persistant.

276. — Crislallisation de l'ovalbumine. On peut faire cristalliser cette albumine de la manière suivante ; au liquide filtré après la précipitation de la globuline, on ajoute goutte à goutte de l’acide acétique à 10 avec précaution, jusqu’à ce que le précipité formé ne se redissolve plus par agitation ; on ajoute alors 0'=“^, 1 de solution acide par 10 centimètres cubes de liquide ; il se produit un abondant précipité, qui devient cristallin du jour au lendemain.

Ün doit examiner au microscope à un fort grossissement (obj. 8, ocul. 2).

Si on fait tomber quelques gouttes de cette suspension de cristaux dans une solution de chlorure mercuriqueà 1 les cristaux sont insolubilisés et gardent leur forme; on peut en faire des préparations stables, les colorer, etc.

Toutefois la cristallisation de l’ovalbumine ne réussit qu’à la condition d’opérer avec des œufs absolument frais.

Préparation du fibrinogène

277. — Le fibrinogène est une protéine du type des globulines, ({ui se trouve dans le plasma sanguin et se transforme en fibrine pendant la coagulation du sang.

SUBSTANCES PROTÉIQUES. PROTÉINES

Pour la préparer, on part du plasma fluoré. On recueille directement du sang de cheval, h la saignée, dansun flacon contenant autant de fois 100 centimètres cubes d’une solution de fluorure de sodium à 3 "/o que l’on veut recueillir de litres de sang.

Cette précaution a pour but de rendre le sang incoagulable. On laisse déposer les globules, ou mieux on centrifuge, on décante le plasma limpide coloré en jaune qui surnage les globules, et on l’additionne d’un volume de solution saturée de chlorure de sodium contenant 0,3 de Iluorure de sodium. Le fibrinogène se précipite en flocons qui se rassemblent en grumeaux gélatineux.

Pour le purifier, on exprime le précipité, recueilli sur une mousseline, puis on le redissout dans la plus petite quantité possible d’une solution contenant 1 ^ dechlorure desodium et0,3‘’/„ de fluorure et on filtre. Le filtrat est précipité à nouveau par un volume de solution saturée de sel. On recommence une ou deux fois cette purification, enfin on redissout le fibrinogène en le mettant en suspension dans un peu d’eau; il repasse en solution à la faveur de la petite quantité de sel qu'il renferme. Cette solution se coagule en flocons quand on chaufic vers 5o-56" ; d’autre part, elle coagule en un caillot gélatineux transparent et rétractile par le fibrine-ferment (voir § 423).

Protéines végétales

278. — La plupart des protéines végétales, extraites desgraines, ressemblent aux globulines animales; elles

PRÉl'AHATION DE l'ÉDESTINE

S6 dissolvent en général dans les solutions de chlorure de sodium à 10 V„, et en sont précipitées soit par dilution, soit par dialyse. Elles diffèrent des globulines animales en ce c[ue la plupart d entre elles ne précipitent pas par saturation avec le sulfate de magnésium ou par demi-saturation avec le sulfated’ammonium ; de plus elles coagulent très incomplètement ou ne coagulent pas du tout par le chauffage de leur solution.

Un certain nombre de protéines végétales se distinguent par leur solubilité dans l’alcool éthylique à 70-80 Vo> soit à chaud, soit à la température ordinaire, et doivent être groupées à part.

Préparation de l’édestine

279. — Les graines de chanvre ou chènevis renferment, à côté d’une certaine quantité de matière grasse, environ 13 ‘’/o d’une globuline insoluble dans l’eau, mais soluble dans les solutions salines étendues, l’édestine (Ritthausen, Osborne).

Pour préparer l’édestine, on triture au mortier 100 grammes de chènevis, de manière à le broyer aussi bien que possible, et on introduit la masse dans une allonge de verre fermée à sa partie inférieure par un robinet, au-dessus duquel est un tampon de coton hydrophile. On verse assez d’éther de pétrole pour recouvrir le chènevis et on laisse en contact une demi-heure.

On ouvre alors le robinet pour laisser couler le liquide qui s’est chargé de graisse; on le referme ensuite, on remet une nouvelle fiuanti té d’éther de pétrole

TS'I SUBSTANCES PUOTÉigUES. PROTEINES

el on recommence l’épuisemenL. Après cinq ou six opérations semblables, on fait tomber lesgrainesdégraissées sur une feuille de papier, on les sèche à l’éluve à 35“ et on les broie de nouveau, ün peut alor^, au moyen d'un tamis, séparer la farine des fragments d’enveloppe.

ün prend 3Ü grammes de farine et on les introduit dans un flacon avec 140 centimètres cubes de solution de chlorure de sodium à 10 "/„ et 10 centimètres cubes d’eau de baryte saturée à froid ; on agite bien, et on laisse en contact pendant deux heures en remuant de temps à autre.

On essore ensuite à la trompe, en repassant les premières parties troubles, et on a un liquide limpide, légèrement acide, coloré en jaune brun, qui renferme rédestine. Le résidu resté sur le filtre est détaché et broyé avec 30 centimètres cubes de chlorure de sodium à 10 on essore à nouveau et on réunit le liquide filtré au précédent.

Pour séparer l’édestine, on dialyse le liquide, placé dans un tube de papier parchemin, ou dans un sac de papier parchemin que l’on fait facilement en relevant les bords d’une feuille carrée d'environ 40 centimètres de côté, et en les attachant au moyen d’une ligature solide, sur un gros tube de 3 à 4 centimètres de diamètre. On suspend le dialyseur dans un cristallisoir, de manière que le niveau du liquide intérieur corresponde à celui du bord du cristallisoir, et on fait couler dans ce dernier un (ilet d’eau continu ; l’eau qui déborde du cristallisoir s’écoule ensuite dans l’évier.

Après trois à quatre jours, la totalité du chlorure de sodium est enlevée par dialyse et on trouve l’édestine, sous forme d’un précipité cristallin, au fond du dialyseur.

PRÉPARATION DE l’ÉDESTINE

On essore, on lave à l'eau disLillée, el on sèche à basse lerapérature.

280. — Cristallisation de Védestine. Pour faire cristalliser ledesLine, on délaie la masse encore humide dans une quantité convenable de solution de chlorure de sodium à 10 ‘*/o> concentration en édes-

tine soit d’environ H 7^ (soit à peu près 80 centimètres

cubes pour les quantités indiquées). La solution est filtrée, chauffée à 60“ et additionnée peu à peu, en agitant, de 2 fois son volume d’eau chauffée à la même température. On laisse refroidir le liquide, puis on le maintient pendant quelques heures à la glacière; l’édestine se dépose peu à peu en cristaux.

Lors([ue l’on veut simplement observer des cristaux d’édestine, on broie au mortier o grammes de chènevis et on les fait macérer pendant une demi-heure dans un bain-marie réglé à 60“, avec 25 à 30 centimètres cubes

Fig. 29. — Edesline crislallisée.

SUBSTANCES PROTÉIQUES. PROTEINES

de chlorure de sodium à 5 *’/o- On filtre et on abandonne à un refroidissement très lent. L’édestine se dépose en octaèdres facilement reconnaissables au microscope {fig. 29).

Extraction du gluten Séparation de la gliadine et de la gluténine

281. — La farine de blé est formée essentiellement d’amidon (70 •’/y) et d’une matière azotée qui constitue le gluten (8 à 12 ‘7„1. Celui-ci est un mélange de deux protéines, la gliadine, caractérisée par sa solubilité dans l'alcool, et la gluténine insoluble dans l’eau et dans l’alcool froids, mais soluble dans les solutions alcalines très diluées.

282. — Extraction du gluten. On mélange dans un mortier 50 grammes de farine avec juste assez d’eau froide pour faire une pâle très consistante (jue l’on pétrit en forme de boule. Celle-ci est malaxée dans les mains, sous un mince filet d’eau ; le liquide se trouble en entraînant l’amidon qui disparaît peu à peu. Lorsque l’eau qui s’écoule est à peine trouble, on divise et on malaxe la pâte élaslicjue, en continuant le lavage jusqu’à entraînement aussi complet que possible de l’amidon. Le résidu, qui constitue le gluten humide, forme une ma.sse grisâtre, molle et élastique, que l’on peut sécher.

283. — Préparation de la gliadine. Le gluten encore humide est essuyé avec du papier à fdlrcr et divisé en petits fragments que l’on fait tomber dans de l’alcool. La concentration la plus convenable de l’alcool j)our

RECIIERCIIE DE l’aLBUMINE DANS l’uRINE 235

dissoudre la gliadine est 70 V„ ; pour 10 grammes de gluten humide, qui contiennent environ 6 à 7 grammes d’eau (soit les 2/3), on prendra donc 30 centimètres cubes d’alcool à 96° et 5 centimètres cubes d’eau. On chauffe dans un petit ballon muni d’un réfrigérant ascendant, sur le bain-marie, en agitant souvent, et on laisse digérer dans l’alcool chaud pendant vingt-quatre heures. L’alcool est alors décanté et remplacé par de l’alcool à 70° ; on laisse de nouveau digérer et on recommence le traitement aussi longtemps que l’alcool dissout une quantité notable de substance. Les solutions alcooliques réunies et filtrées sont concentrées dans le vide ; à la fin, on ajoute un peu d’alcool pour redissoudre le trouble formé, et on verse le liquide en mince filet, en agitant, dans 8 fois son volume d’eau froide. La gliadine précipitée est recueillie, lavée à l’eau et séchée. Elle forme de 60 à 80 “/y du gluten.

284. — Préparation de la gluténine. Le résidu de l’extraction par l’alcool à 70° constitue la gluténine. Pour la purifier, on sèche ce résidu, on le pulvérise et on l’épuise par l’alcool. La poudre est alors agitée avec 30 à 50 centimètres cubes de solution de potasse à 2 grammes par litre ; après dissolution complète, on (iltre et on neutralise par l’acide chlorhydrique très dilué. La gluténine qui se précipite est recueillie sur un filtre, lavée et séchée.

Recherche de l’albumine dans l’urine

285. — Faire bouillir 10 centimètres cubes d’urine (iltréeet claire dans un tube à essai. Si le liquide reste

23G SUBSTANCüS PROTÉIOUES. PROTÉINES

limpide, il n’y a pas d’albumine. S’il se produit un trouble ou un précipité lloconneux, cela peut être dû à la présence d’albumine coagulée ou de phosphates alcalino-terreux. Ces derniers, solubles dans l’eau chargée d’acide carbonique, se précipitent, en elîet, quand on chasse le gaz par ébullition.

Pour établir la distinction, on ajoute une seule goutte d’acide acétique, qui redissout instantanément les phosphates, mais laisse subsister le trouble ou le précipité d’albumine.

286. — Dans certains cas, l’iirine, de laible densité, est trop pauvre en sels pour que la coagulation de l’albumine se produise ou, si elle se produit, le coagulum peut se redissoudre dans l’acide acétique. Il faut alors ajouter, avant de poursuivre la recherche, environ 1 “/(, de chlorure de sodium et filtrer s’il est nécessaire. En règle générale, il serait donc préférable d’ajouter toujours à l’urine cette proportion de chlorure de sodium avant de procéder à la recherche.

287. — On complétera cet essai par la recherche de l’albumine au moyen de l’acide nitrique, à froid, comme il est indiqué au § 264. Certaines urines, riches en urates et ne renfermant pas d’albumine, peuvent donner, avec l’acide nitrique, une zone trouble qui pourrait faire croire à la présence d'une trace d’albumine. On éliminera cette cause d'erreur en diluant au préalable l’urine de son volume d’eau. De celte manière, on n’a plus à craindre la précipitation de l’acide urique. S’il se produit un trouble, il sera certainement dû à de l’albumine.

DOSAGE DE l’aLBUMINE DANS l'uRINE

Dosage de l’albumine dans l’urine

288. On effecluera ce dosage sur 23 à 100 cenlimèlres cubes d’urine filtrée, suivant la richesse présumée, d’après l'essai qualitatif ci-dessus.

A ce volume de liquide, placé dans un vase de Bohême, on ajoute 1 "/„ de sel marin, puis de 1 à 4 gouttes d’acide acétique, et on chauffe au bain-marie jusqu’à coagulation, que l’on complète en portant le liquide à l’ébullition pendant un instant. On laisse déposer le précipité, on décante le liquide surnageant sur un filtre sans plis, on délaie le précipité dans 50 centimètres cubes d’eau bouillante, on laisse déposer à nouveau, on décante, on jette le précipité sur le filtre, et on le lave à fond avec de l’eau chaude jusqu’à ce que le liquide filtré ne se trouble plus par le nitrate d’argent i').

Avec le jet de la pissette, on rassemble avec soin tout le précipité au fond du filtre; on enlève ce dernier de l’entonnoir et on le pose sur un peu de papier à filtrer pour absorber l’excès d’eau.

Quand le filtre et le précipité sont bien essorés, on peut facilement, avec une spatule, les séparer l’un de l’autre. On place alors le petit bloc d’albumine dans une capsule tarée, on sèche à l’étuve et on pèse. Ce précipité renferme une très petite quantité de matières minérales (luel'on peut déduire après calcination.

(') On peut utiliser la centrifugalion pour recueillir et laver le précipité d'albuiiiiiie.

238 SUBSTANCES PBOTÉIQUES. PROTÉINES

On rapporte liahilueHcmenL le résullaL trouvé au litre.

289. — Lorsque le précipité est minime, on peut, au lien de le peser, y doser l’azote par la méthode de Kjeldahl (§ 37) et multiplier le résultat obtenu par le coefficient 6,25. Il est inutile, si on a opéré par filtration, de séparer le précipité du filtre; on attaque le tout ensemble par l’acide sulfurique. Pour le titrage, prendre de l’acide décinormal.