II. — La méthode

Le principe de la méthode qui dirigera tout ceci, c'est la constitution de milieux où puissent pousser les bactéries, milieux additionnés de sels, et cela de façon telle qu'on puisse en connaître et faire varier, suivant les besoins, le degré de concentration saline.

Les milieux employés ont été le plus ordinairement des milieux liquides, (bouillon de bœuf ordinaire) : toutefois les milieux solides (gélose non glycérinée) l'étaient aussi facilement et là, comme ailleurs, ils ont produit des formes plus belles. Directement pour les premiers, ou après fusion préalable pour les autres, ils étaient, au moyen d'une pipette graduée^ répartis dans des tubes en quantités égales et connues (soit iO c. cubes) : Stérilisation immédiate à l'autoclave ; et, jusqu'au moment d'être employés, ils étaient préservés de l'évaporation par séjour à une température basse et par des capuchons de caoutchouc.

Au moment de s'en servir, ils étaient additionnés de sels. Préalablement on avait préparé les solutions salines, faites de sels purs ] elles étaient saturées à 35** environ, puis laissées lentement revenir à la température ordinaire du laboratoire (i6<'-i7'>); la saturation en était ultérieurement assurée par une certaine quantité de cristaux salins^ constamment tenus au fond du flacon. Les sels choisis ont été de préférence des sels très solubles, pour éviter la cause d'erreur apportée par l'eau servant de véhicule. Une pipette, toujours la même^ bien lavée et stérilisée entre chaque série de tubes préparés^ laissait alors à volonté tomber dans le tube de milieu nutritif, un nombre connu de gouttes. Mais on sait la difficulté à avoir des gouttes toujours bien égales (Y von, thèse Paris, 1903) : On a du moins le soin de se placer dans des conditions toujours identiques; le poids de la goutte donnée par la pipette, variable pour chaque sel, était le poids moyen obtenu par la pesée d'un grand nombre de gouttes. Le chiffre de solubilité du sel à 17» dans le dissolvant, d'une part, et, de l'autre, le poids d'une goutte obtenu comme il est dît cidessus, permettaient de savoir le poids de sel contenu dans une goutte, donc dans chaque tube une fois préparé. Cette manœuvre exécutée sous la protection de la flanmie, les tubes étaient alors agités à la main pour assurer la parfaite diffusion du sel et une égale concentration du milieu, puis portés à l'étuve dans les mêmes conditions que ceux ensemencés^ conditions qui seront identifiées plus loin : séjour, quarante-huit heures à 38^ Si au bout de ce temps, leur stérilité était parfaite et aucun trouble ne s'était produit, alors seu-

870 6. PËJU ET H. BÀJAT

lement ils étaient aptes à servir et ensemeDcés : dans le cas contraire, rejetés.

Les cultures bactériennes qui ont servi alors étaient, pour chaque bactérie, multiples {Coli bacille i% B. subtilis 4, B. paratyphiques 8, etc.), d'origines toujours très différentes, et si possible yériflées par leurs caractères et réactions classiques. Nous n'avons d'ailleurs étudié que les espèces bactériennes les plus communément répandues dans les laboratoires. Ces bactéries, d'abord cultivées sur gélose non glycérinée normale durant vingt-quatre heures, étaient de là transportées dans les milieux salins, à sec avec TaiguiUe de platine^ de façon à n'en pas changer la concentration connue.

Les tubes ensemencés en série contenaient chacun une quantité de sel différente. Un tube normal sans sel et ensemencé de même est joint & chaque série, servant de témoin. Séjour à l'étuve à 38* pendant vingt-quatre ou quarantehuit heures : les tubes revêtus de capuchons de caoutchouc y sont en outre placés sous une cloche où un réservoir d'eau entretient une atmosphère saturée et empêche Tévaporation de leur contenu.

Fixation des préparations à la chaleur ou mieux au Lenossék ou au picroformol. Coloration suivant les méthodes ordinaires. Dans certaines de ces préparations^ il est possible qu'on rencontre de petits cristaux d'aspect variable : ceux du sel employé non dissous. Toute préparation semblable devra être rejetée comme présentant une saturation incomplète et de degré inconnu.

III. — Étude générale des variations morphologiques et biologiques chez

LES bactéries. Évolution*

Dans les conditions que nous venons d'indiquer voici ce que l'on observe : A vue d'œil et dès vingt-quatre heures de séjour à l'étuve, les tubes contenant des doses variables d'un sel, ont notablement moins bien poussé que le tube témoin ; dans les tubes où il n'y a que peu de sel, la culture présente à peu de choses près l'apparence du tube témoin ; mais bientôt, à mesure que la concentration saline augmente, les bactéries poussent plus mal; en bouillon, le trouble devient de moins en moins marqué, et quand la culture produit normalement un pigment (b. de la diarrhée verte, b. pyocyaniqui) on voit la coloration peu à peu disparattre; sur gélose quelques rares colonies apparaissent seules; avec une saturation plus forte, toute végétation devient impossible et dès lors le milieu reste complètement stérile.

Au microscope, on voit apparaître des modifications parallèles ; aux cultures d'aspect à peu près normal, correspondent des bacilles normaux parfois un peu grossis et cela d'ordinaire dans tous leurs diamètres ; aux cultures poussant mal, avec quelques bacilles normaux se faisant progressivement plus rares, des formes modifiées dont les caractères s'accentuent et atteignent leur maximum au moment où les cultures achèvent de disparattre dans des milieux trop concentrés. Ces formes modifiées sont : a) des filaments ; b) des éléments renflés, piriformes le plus souvent.

A) Filaments. — Ce sont de très longs éléments pas ou peu mobiles,

ayant, à l'état de développement maximum observé, 150 et jusqu'à 250 et 300 fx de longueur ; le plus fréquemment ce qu'on observe ce sont des formes un peu plus courtes : En largeur, elles atteignent à peine le double de celle d'un bacille normal. A part un petit nombre de bacilles^ d'ordinaire appartenant au groupe des acido-résistants^ le filament ne présente pas de ramifications. Sur son trajet on peut voir apparaître, de façon inconstante d'ailleurs, un renflement le plus souvent unique, mais pouvant être double ou triple, ovalaife ou piriforme; en longueur, sur le filament^ ce renflement ne dépasse pas iO (a ; en largeur ses dimensions sont à peine moindres : à sa périphérie, aux deux pôles opposés, le filament reprend d'emblée très grêle.

B) Renflements pirif ormes, formes renflées. — Ce deuxième type de modifications obtenues est un peu différent du précédent : c'est une forme longue encore, quoique beaucoup moindre (50 à 70 [jl environ). Mais la majeure partie de son trajet est le siège d'un très gros renflement ayant jusqu'à 20 (A. et plus de largeur; d'ordinaire fusiforme^ piriforme ou lancéolé, il peut revêtir les formes les plus diverses (en M, en S, en estomac, etc.). On peut aussi le voir situé à l'extrémité d'un filament auquel il paraît comme appendu.

On ne doit point séparer cette deuxième forme de la précédente filamenteuse ; elle n'en constitue sans doute que l'exagération du renflement piriforme médian; entre eUes, il n'y a d'ailleurs qu'une différence de concentration saline; aux doses moyennes,

^ celles indiquées plus loin pour

• quelques espèces de bacilles, cor-

> respond une égale proportion de

' filaments et d'éléments renflés ;

' avec une dose légèrement moin-

^ dre, on verrait prédominer les

' filaments; avec une autre un peu

fJplus forte, se montreraient sur-

>tout des formes élargies.

i Étudiées au point de vue cytologique, ces formes géantes pren-

^nent bien les colorants de la bactérie qui leur a donné naissance,

:i^Ziehl ou couleurs basiques d'ani-

:^line et rouge neutre, etc., suivant

:>Ie cas. C'est là un fait constant,

iDau moins quand il s'agit de formes jeunes, ce sont alors des éléments

I pleins, formés d'un protoplasme dense, sans vacuoles. Les cils, s'il s'agit d'un bacille normalement cilié, ont absolument disparu. Vieillies, c'est-à-dire ayant séjourné un temps plus ou moins long dans les milieux salins, la colo-

FiG. 1. — Bac. d'Eberth. Varialiong morphologiques dans les sels (filaments et formes renflées).

Note. — Les petiU bacillei courts représentés ici sont déjà proportionneUemtBt fort grossis par le séjour dans le milieu salin.

JOURNAL DE PRTSIOL. ET DB PATHOL. GBNBR., 1906.

872 G. PËJU ET H. RAJAT

ration devient plus difficile; lesB. acido-résistants se laissent plus facilement décolorer par Tacide azotique. Chez tous^ apparaissent des vacuoles de plus en plus nombreuses.

A côté de ces deux catégories de variations morphologiques on peut voir apparaître, quand on fait pousser certaines bactéries dans les sels, des chatnettes de bacilles, streptobacilles souvent très longs. C'est là un fait dès longtemps connu et qu'ont signalé notamment MM. Yersin pour le microc. prodigiosusy et Wasserzùg pour le B. subtilis. S'agit-il bien là du mftme phénomène que celui dont nous nous occupons où, au lieu de chatnes de bacilles nettement séparés, on a affaire toujours à un filament vrai^ à contours pleins^ et ininterrompu dans toute sa longueur? Avec les divers sels que nous avons employés et en particulier avec l'iodure de potassium nous avons vu des chaînes strepto-bacillaires à des doses variables, mais généralement plus faibles que celles nécessaires à produire les filaments avec B. suUili9n B. mesentericus^ B. lactis niger^ plus rarement avec B, atUhracis^ toutes bactéries d'ailleurs avec lesquelles nous n'avons jamais pu obtenir les formes filamenteuses ou renflées qui nous occupent aujourd'hui.

L'évolution ultérieure de ces formes géantes va nous montrer encore quelques faits singuliers.

Si l'on réensemence ces formes nouvelles, filaments ou renflements, dans un milieu normal, sans sel, on obtient, en vingt-quatre heures, une culture poussant abondamment; mais les formes géantes ont disparu^ et à leur place ce sont des bacilles courts normaux, ciliés comme précédemment. En somme, au moins avec les espèces microbiennes polymorphes et à développement rapide, on peut, à volonté et en vingt-quatre heures, transformer les bacilles normaux en formes géantes et en, vingt-quatre heures encore, ramener ces dernières à la forme de bacilles normaux.

Si maintenant, on laisse évoluer ces formes nouvelles spontanément dans le milieu qui les a produites, on se rend compte qu'elles ne sont ni stables, ni définitives. Dès le 3«.ou 4* jour, avec le b. d'Ëberth on voit diminuer le nombre des filaments qui se brisent, se disloquent, en même temps qu'apparaissent des bacilles courts de plus en plus nombreux; le plus souvent ils sont libres et sans ordre dans le champ de la préparation : par endroits, ils se voient disposés à la suite aux extrémités des filaments; ailleurs, ils revêtent l'aspect de chaînettes de bacilles gardant les contours mêmes et les inflexions des filaments^ en sorte qu'ils semblent résulter de la division de ces filaments eux-mêmes; ces nouveaux bacilles formés ont d'abord un aspect cocobacillaire, ce n'est que peu à peu seulement et lentement qu'ils reprennent leur forme normale, et pour le b. d'Ëberth cinq ou six semaines sont nécessaires pour ce retour complet.

Avec les bacilles à développement plus lent^ ce retour est identique, mais au bout d'un temps infiniment plus considérable. Enfin pour les uns et pour les autres, ce retour spontané des formes modifiées par les sels à la forme courte normale^ est d'autant plus lent à se produire que la concentration saline du milieu était plus considérable.

Au milieu de ces variations morphologiques, les caractères biologiques du bacille ne demeurent point indifférents. Le bacille était-il mobile t

Modifié, il devient immobile. Sécrétait-il du pigment? il n'en sécrète plus (b. pyocyanique et b. de la diarrhée verte).

S'agit-il de TËberth ? modifié, il n'est plus agglutiné par un sérum typhique. Mais quand le bacille revient à la forme courte normale, tous ses caractères réapparaissent et, l'Eberth notamment, est de nouveau agglutiné au degré exact de dilution qu'il atteignait avant d'être modifié. Nous en pouvons conclure à un étroit parallélisme entre les variations morphologiques des bacilles et celles de leurs caractères biologiques. Peut-être même leur virulence, dans ce nouvel état se trouve-t-elle modifiée ? Les difficultés de semblables recherches nous en ont éloignés jusqu'ici.

IV. — Classification des bactéries au point de vue de leur aptitude au