HISTORIQUE

La protéinase. La digestion des matières protéiques par les purées de fruits du Papayer (Carica papaya L.) était bien connue dans la zone intertropicale de l’Afrique, de l'Amérique et des Indes quand WürTz a consacré en 1879 la première étude au ferment protéolytique extrait du latex de ce fruit. Un très grand nombre de recherches a été fait sur ce ferment extraordinairement actif et facile à manier. On le connaît actuellement sous forme cristallisée ; il se comporte comme une protéine (BALLS, LINEWEAVER et THOMPSON, 1937). Le latex contient un système polyfermentaire, dans lequel BERGMANN et ses collaborateurs ont pu séparer deux peptidases ; DAMODARAN et ANANTA-NARAYANAN Ont mis en évidence une activité désamidasique se manifestant sur la caséine après une première attaque hydrolytique (1). L’optimum de température de lactivité protéolytique se trouve aux environs de 90°, mais la destruction du ferment est très rapide à cette température. En pratique, et pour des actions un peu prolongées on a intérêt à se placer à 50° environ (EFFRONT). L’optimum de pH dépend du substratum : il est généralement près

(1) Les dosages d’ammoniaque que nous avons effectués dans certaines de nos expériences ne fournissent aucune indication d’une désamination dans nos

conditions expérimentales.

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du point isoélectrique de celui-ci. Ainsi WILLSTAETTER, GRASS- MANN €l AMBROS trouvent un optimum à pH 5,5 en utilisant

comme substratum la gélatine (pH; — 4,8), à DH95,9 avec de la peptone d’albumine (pH, — 4,8) et à 7,2 avec de la fibrine (PH, — 7,2).

Activation. La papaine a ceci de particulier qu’elle est activable par le cyanure. D’après WizLsTAETTER el GRASSMANN, la présence de cyanure peut multiplier l’activité par 2 ou 3 et élargir en même temps la spécificité. Les protéines natives et les peptones ne sont lysées qu’en présence de cyanure, alors que pour l'attaque de la gélatine cette substance n’est pas indispensable. GRASSMANN, DYCKERHOFr et SCHOENEBECK notent que la même activation peut être obtenue également par la cystéine ou par SH?, mais non par la cystine. Il semble donc Y avoir un certain rapport avec l’action des réducteurs que nous avons signalée dans l'introduction. Nos expériences ont confirmé le parallélisme des deux actions et, faisant intervenir des milieux réducteurs, nous avons pu dans certaines expériences nous passer de l’action du cyanure. Il nous paraissait préférable de ne pas introduire du KCy comme activaleur d'autant plus que ce corps n’est ni l’activateur naturel ni même un agent indispensable quand on utilise des préparations fraîches complètes de papaine. FRANKEL, MAIMIN et SHAPIRO signalent en effet que te latex frais du fruit de Carica papaya a une activité protéolytique qui n’est pas augmentée par le cyanure, celui-ci ne joue un rôle qu'après les premières interventions de purification (dégraissage, centrifugation, etc.). D'autre part, les solutions brutes de papaine qui seraient activables, mais qu’on abandonne simplement un certain temps, se comportent — à légal des préparations fraichement extraites des fruits — comme si elles étaient activées (GRASSMANN, DYCKERHOFF et SCHOENEBECK) .

L’activation die la papaine par les réducteurs apparaît par contre Comme un mécanisme essentiel et indispensable. On signale ainsi l’action du Slutathion, de l'acide ascorbique et des sels de fer bivalent dans certaines conditions (MASCHMANN (1934), de la cystéine, des acides citrique et pyruvique et du ferrocyanure (MASsCHMANN ei HELMERT, 1935), de Phydrogène sulfuré et du thioglucose (BERGMANN et Ross, 1935) ainsi que celle des acides thioglycolique, thiohydracrylique et dithioldiglycolique (SCHOEBERL et FIscHER, 1939). Même le sérum ou le sang total activent la papaïine, cette action étant due aux groupements -SH des protéines (WALDSCHMIDT-LEITZ, CON- RATH €@t GLOEDITSCH, 1937). Le mécanisme de l'activation par

l’acide ascorbique est étudié par MAscHMANN et HELMERT (1934) qui mettent en évidence son caractère complexe sans arriver à lélucider. Parallèlement on a cherché à connaître la nature de l’activateur existant, spontanément dans le latex frais: GRASSMANN (1935) extrait par l’éthanol! à 70% une substance aclivante qui ne serait pas le glutathion (impossibilité de préparer le sel cuivreux) mais dont l’hydrolyse imet en évidence de grandes quantités de cystéine et d'acide glutamique. Cependant pour FRANKEL et MArImIN (1937) ainsi que pour GANAPATHY et SASTRI (1938) le glulathion, présent dans le latex, serait l’activateur naturel de la papaïne. La coagulation du lait par la papaïine bénéficie des mêmes activations que la protéolyse (Bazzs et Hoover, 1937).

Très en avance sur ces données et ayant constaté que l’activation de la papaine par SH?, le glutathion ou le sulfite est réversible et peut être annulée par des oxydants, BERSIN propose dès 1933 l’hypothèse de la structure thiolique de la papaïne. Cet auteur, en désignant la molécule de papaine active par Pa-SH, admet la réaction réversible

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qui aboutit par oxydation à La forme inactive Pa —S --S — Pa, le groupement SH libre étant indispensable pour l’activité protéolytique du ferment. Le caractère réversible de l’inactivation par H?20? est démontré en premier par BERSIN et LOGE- MANN qui chiffrent l’activité d’une préparation de papaine avant tout traitement par 0,53; l’action de H?20? 0,002 m pendant 5 minutes à 400 la fait tomber à 0,02 et SH? la ramène à la valeur de 0,19. À part l’activation par les réducteurs et linhibition par les oxydants certains faits expérimentaux militent en faveur de l’hypothèse de BERSIN. MORGAN et FRIEDMANN (1938) signalent l’inactivation de la papaïne par Pacide maléique qui bloque d’une façon générale les groupements —SH libres. La fixation d’un métal lourd tel que Zn sur —SH supprime lactivité de la papaine et rend la préparation insensible à l’action éventuelle des réducteurs (SCHOEBERL et Fis- CHER, 1939). Les complexes de Cu et Hg se comportent de même (HELLERMAN et PErkINs, 1934). La constitution de la papaine permet effectivement d'envisager l’hypothèse de BERsiN: alors qu'une préparation purifiée de papaine ne contient ni cystéine ni cystine libre, son hydrolyse libère de la cystine et un peu de méthionine. Des recherches récentes (GREENBERG et Winnick, 1940) montrent que d’autres enzymes protéolytiques d’origine végétale, telles la broméline et lasclépaine, extraite de l’Asclepias mexicana, se comportent comme la

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papaine alors que la solanaïne provenant de Solanum élaegnifolium est insensible aux oxydants et réducteurs et peut par contre être inactivée par. l'acide nitreux et le kétène ; l’activité de la solanaïne exigerait donc la présence d’un groupement phénolique libre au, lieu du groupement —SH libre nécessaire pour l’activité des papainases.

Si l’on admet l’inactivation réversible par! les oxydants d’après un mécanisme tel que celui proposé par BERSIN, la nature des oxydants employés ne doit avoir qu’une importance secondaire. De notre point de vue cependant, à savoir la détermination des potentiels d’oxydation-réduction des milieux correspondant à l’activation et le bloquage de l’activité protéolytique, il y a intérêt à dresser une liste des oxydants utilisés.

Dans leur travail de 1933 BERsIN et LOGEMANN obtiennent l’inactivalion par H20?2, la quinone, l’iode et les séléniates. A cette liste HELLERMAN et PERkINS (1934) et MASCHMANN et HELMERT (1934) ajoutent le ferricyanure et JOERGENSEN (1935 et 1938) le bromate, l’iodate, le perborate de soude et le persulfate d’ammoniaque. BERGMANN et Ross (1935) et BERGMANN et LERVAS (1936) montrent que l’inactivation par l’iode est réversible au moins pour la peptidase II alors que l’autre consliluant de la papaiïne, la peptidase I, peut se trouver détruite irréversiblement.

Déjà en 1931, GRASSMANN, SCHOENEBECK et EIBELER avaient envisagé la possibilité que le potentiel d’oxydation-réduction du milieu pouvait intervenir dans l'activation de la papaine, mais aucune mesure n’a été faite. Un certain nombre d’expériences montre ensuite que la simple addition de substances activantes ou inhibitrices ne donne pas toujours le résultat escompté. Nous relevons à ce sujet les résultats complexes obtenus par MASCHMANN et HELMERT (1935) avec le ferricyanure et la discussion entre MASCHMANN et BERSIN(1935) sur ces expériences : il en résulte apparemment que le ferricyanure pouvant être réduit par le milieu dans certaines condilions n'intervient évidemment plus comme oxydant sur lactivité de la papaine. Les expériences signalées par GANAPATHY et SAsTRI (1939) comportant une inhibition de la papaine par H?0? vis-à-vis de certains substrats et non vis-à-vis d’autres exigeraient également pour leur interprétation un complément d’information portant sur la persistance de IH?20?2 au moment de l’action du ferment ou sur le niveau de potentiel réalisé dans le milieu.

Les expériences que nous avons publiées dès 1935 et 1936 montrent en effet une très grande simplification des conclusions dès qu’on introduit comme variable le potentiel doxydation-réduction du milieu. Les réducteurs agissent en amenant

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le système enzymatique dans la zone d'activité, les oxydants le placent à un potentiel en dehors de cette zone quand nous envisageons lactivité lytique. En réalisant, au contraire, au moyen d'’oxydants quelconques en quantité convenable un potentiel élevé compris entre des limites bien définies, on met en évidence une activité condensatrice du ferment.

Pour terminer cette revue bibliographique, nous signalerons qu'il doit y avoir d’autres mécanismes d'activation et d’inhibition que ceux qui interviennent sur la réaction Pa-SH $$ Pa — S — S — Pa. Il faut probablement interpréter ainsi l’inactivation par l’acide iodacétique (MASCHMANN, 1935) et celle par l’acide diméthylbarbiturique (MAEDA, 1937) qui montre que la présence d’un groupement aldéhydique est également indispensable pour l’activité de la papaine.

Un certain nombre d'auteurs (MENDEL et BLoop, MAUTHNER, FRUTON et BERGMANN) s'élèvent contre la théorie de BERSIN en apportant des arguments tendant à montrer que les activateurs agissent à la façon: de coferments et non pas en transformant une forme inactive de la papaïne en une forme active. Leurs expériences pourraient être interprétées plus facilement en envisageant les variations de potentiel du milieu dans les conditions réalisées ; cependant aucune mesure de potentiel n’a été effectuée.