o) +100 300 mV

F1G. 14. — Expérience analogue à celle de la fig. 12, pH du milieu = 8.

Nous avons fait trois séries d'expériences à pH 5, 6,7 et 8. Les résultats sont rapportés dans les graphiques 12, 13 et 14. Malgré les variations d’amplitude qui sont frappantes, on note toujours l’existence d’un optimum de potentiel. Ce potentiel est plus bas que dans les lots réalisés sans intervention spéciale. Dans ces lots, l’hydrolyse est notable, mais se trouve augmentée, dans toutes nos séries, par un abaissement de potentiel, que celui-ci soit obtenu par introduction de réactifs chimiques ou par une mise en expérience anaérobie. Aux environs de +500 mV, l’activité lytique est complètement arrêtée, l’optimum se trouve à +200 mV pour pH 5, à +200 mV pour pH 6,7 et au-dessus de 0 mV pour pH 8. Les niveaux de potentiel s’installant spontanément se trouvent à +350 mV pour pH 5, à +310 mV pour pH 6,7, à +295 mV pour pH 8. Quand les milieux sont suffisamment réducteurs pour atteindre — 350 mV, l’activité est nulle.

Paroi musculaire d’Arenicola marina L.

Pour des raisons analogues à celles qui nous avaient fait. choisir l’Actinie, nous avons abordé l’étude de l’autolyse tissulaire chez un Ver polychète Arenicola marina L. — Arenicola piscatorum Audouin. Bonn a décrit l’histolyse saisonnière qui, en automne, réduit les branchies et les téguments de l’Arénicole ; le rôle respectif de l’autolyse tissulaire et de la

phagocytose n’a pas été démêlé. Nous avons supposé que le déclenchement physiologique de l’autolyse dans certaines conditions n’est pas dû à l'apparition de ferments appropriés, mais à une modification des conditions physico-chimiques qui règlent l’activité des ferments existants. Nous n'avons pas trouvé l'indication qu’on ait mis en évidence des ferments protéolytiques chez l’Arénicole ; OGATA, MoRIMOTO et Mori en ont étudié chez le Ver de terre : . l’autolyse protéique présente un optimum entre pH 8,0 et 8,2. Quoi qu’il en soit l’Arénicole s’est révélé favorable à l'étude de l’autolyse. Soit spontanément après la mort, soit in vitro en présence d’antiseptiques, la lyse des tissus peut atteindre une grande intensité et être facilement mise en évidence par le dosage des groupements aminés libérés.

Les tissus ont été préparés de la façon suivante : après avoir sectionné la tête et la queue d’Arénicoles fraîchement ramassés sur la grève nous avons fendu le corps longitudinalement, enlevé l'intestin et raclé la face interne de la paroi musculaire. Cette paroi a été ensuite lavée à l’eau de mer, découpée aux ciseaux, broyée au sable et additionnée de 3 à 5 fois son volume d’eau de mer ; après décantation on obtient une suspension trouble qui est répartie en tubes à essai, additionnée d’une goutte de chloroforme et, éventuellement, de réactifs destinés à modifier les conditions physico-chimiques du milieu. Sur un témoin on dose immédiatement à la formoltitration les groupements aminés libres, les autres sont abandonnés 24 heures à la température du laboratoire (environ 20°) pour être titrés ensuite. L’autolyse est loin d’être complète après ce délai. Voici un exemple: dans un lot la formoltitration exige au départ 2,3 cm° de NaOH n/25 par cm° de milieu, 4,9 cmÿ après 24 heures, 5,15 cm? après 48 heures et 5,5 cmÿ après 96 heures. Nos expériences ont été cependant arrêtées après 24 heures pour des raisons de commodité et pour diminuer lintervention éventuelle des réactions secondaires.

Nous avons d’abord examiné l'influence de l'acidité du milieu sur la protéolyse du système ainsi préparé. Les points expérimentaux obtenus mettent en évidence un optimum d'action aux environs de pH 7,3. L’activité protéolytique diminue très rapidement vers les pif bas et elle est très faible aux pH réalisés normalement dans les tissus de l'animal vivant (approximativement pH 6). À pH 5, les suspensions floculent et leur activité lytique est pratiquement nulle.

Dans une seconde série d’expériences nous nous sommes placé dans les conditions de pH optimales pour étudier l’influence des variations du potentiel d’oxydation-réduction du

pie Par

milieu. Celui-ci semble très peu tamponné du point de vue des potentiels d’oxydation-réduction. Au moins interprétonsnous dans ce sens, d’une part, les écarts considérables des potentiels qui s'installent spontanément dans les lots témoins et, d'autre part, la difficulté de réaliser des potentiels déterminés. Les suspen$ions réalisées comme précédemment ont été amenées à pH 7,3 et additionnées soit de perhydrol neutralisé ou de ferricyanure de K, soit d’hydrosulfite en solution alcaline, ou encore de divers colorants qui, plus ou moins réduits à l’hydrosulfite, servaient de tampons d’oxydation-réduction. Les milieux sont placés dans des tubes fermés comportant dans le bouchon une électrode de platine. Au bout de 24 heures

100 [e) +100 200 300 400 mV 500

F1G. 15. — Activité autolytique d’un extrait aqueux de paroi musculaire d’Arénicole (Arenicola marina L.), en fonction du potentiel d’oxydation-réduction du milieu, (Voir note p. 47).

on détermine l’augmentation des groupements aminés libres et formoltitrables par rapport au milieu initial. Le rendement de la digestion dépend du potentiel d’oxydationréduction du milieu. La courbe traduisant les résultats expérimentaux (fig. 15) montre que la digestion à pH 7,3 se fait le mieux dans une zone de potentiel comprise entre 0 et +150 mV par rapport à l’électrode à hydrogène normale, c’est-àdire dans un milieu faiblement réducteur. La digestion est moins intense aussi bien dans les milieux plus réducteurs que dans les milieux indifférents ou oxydants. Les lots préparés sans addition d’oxydants ni de réducteurs se placent entre 245 et +385 mV et se trouvent sur une pente de la courbe.

Gr

Nous avons vérifié que l’arrêt de la protéolyse dans les milieux réducteurs est réversible. Ainsi un lot qui au départ exige 1,70 em de la NaOH n/25 pour doser l’azote formoltitrable et qui, amené par une trace d’hydrosulfite à —76 mV, arrive au bout de 24 heures à 1,75 cm est ensuite réoxydé à l’air. On partage en deux lots et on maintient encore 24 heures dans les mêmes conditions. Un lot se trouve à +299 mV et exige 1,95 cm de soude, pour l’autre les valeurs trouvées sont +305 mV et 1,93 éms. L’autolyse qui avait été inhibée dans le premier milieu trop réducteur reprend donc après réoxydation.

Substance musculaire de la Tanche.

Contrairement aux matériaux précédents, la musculature de la Tanche (Tinca vulgaris Cuv.) se présente histologiquement comme assez homogène. La technique est simple: sur des tanches fraîchement tuées, on prélève de la substance musculaire

2 3 & 5 6 7 BUT SE 10 F1G. 16. — Activité autolytique d’un extrait aqueux de muscle de Tanche (Tinca vulgaris Cuv.), en fonction du pH du milieu. En abscisses le pH, en ordonnées Paugmentation de l’azote formoltitrable en p. cent de la valeur initiale. Les points correspondent à plusieurs expériences.

Ve

[0] # 200 mV 400

FIG. 17. — Activité autolytique d’un extrait aqueux de muscle de Tanche, en fonction du potentiel d’oxydation-réduction du milieu, pH — 4,3. (Voir note p. 47).

-100 (0) +100 300 nv 500

Fi. 18. — Expérience analogue à celle de la fig. 17, pH = 5,5.

na

qu'on réduit facilement en purée. 10 gr. de muscle sont amenés à une suspension très fine dans du sérum physiologique et éventuellement additionnés de tampon phosphaté. L’autolyse se fait pendant 65 heures à 37°. En absence de phosphates, la protéolyse des lots amenés à des pH différents peut être représentée par une courbe à maximum (fig. 16). La lyse est nulle au-dessous de pH 3 et au-dessus de pH 9. Elle atteint son optimum aux environs de pH 4,3. L'influence du potentiel d’oxydation-réduction a été explorée dans deux séries d'expériences exécutées à pH 4,3 et 5,5. Dans la série dont les lots ont été amenés à pH 4,3 toute protéolyse se trouve arrêtée quand on dépasse +400 mV, elle semble également diminuer quand le potentiel tombe aux environs de 0 mvV. L’optimum se trouve autour de +150 mV (fig. 17). A pH 5,5, on note également un accroissement de l’activité quand le potentiel diminue de +350 mV, valeur qui représente la limite supérieure de l’autolyse, jusqu'aux environs de +50 mV, le potentiel le plus favorable (fig. 18).

Dans les lots amenés par introduction d’oxydants, H20?2 surtout, à des potentiels élevés (+500 mV p. e.), on note une diminution de l’azote formoltitrable sur laquelle nous reviendrons.

Pulpe de la rate de veau.

La rate subit dans des conditions favorables une protéolyse intense. ROSENBOHM étudie comparativement la lyse protidique de divers tissus de Rat au bout de 24 heures et il trouve qu’elle atteint 90% des protéines dans le rein, 80% dans la rate, 70% dans le foie et le sarcome de JENSEN greffé sur le Rat, 30% dans le cerveau et 0% dans le sérum. Le foie et la rate semblent donc indiqués pour nos expériences et la rate d'autant plus que dans cet organe, même adulte, des constructions protidiques se font normalement et que nous pouvions de ce fait espérer tirer profit du même matériel pour l'étude de la synthèse protidique aussi bien que pour celle de la lyse.

Le système protéolytique du foie et de la rate avaient été étudiés par KLEINMANN et WErR (1931), d’une part, par ANSON (1937), d’autre part, qui avaient conclu qu’il ne nécessitait pas la présence dun activateur. Cependant, pour FRUTON et

Pr 0

BERGMANN l’enzyme protéolytique de la rate de Bœuf est susceptible d’être activé. Ainsi la présence de 0,004 millimol de cystéiné par cm de miliéu intensifie l’action de l’enzyme sur tous les substrats étudiés, l’acide ascorbique magit que pour des substrats ayant un groupement %—aminé libre. Dans une nouvelle ‘étude (1940) de la catepsine extraite de la rate, ANSON examine l’action de la cystéine qui augmente de 54% l’activité du ferment. Cette activation est plus faible que celle signalée précédemment par MAvER dans un extrait de foie. ANSON explique cette différence par une purification insuffisante de l'extrait de MAVER qui contiendrait, outre la catepsine, des poly- et des dipeptidases qui seraient plus sensibles à l’action de la cystéine que la catepsine. Cette discussion est sans importance pour nos expériences, car intentionnellement nous gardons l’ensemble du système protéolytique du tissu et nous étudions son activité globale.

La technique employée dans nos expériences est la suivante : la rate de veau est pulpée en raclant des tranches avec un couteau, la pulpe est broyée au mortier avec du sable, mise en suspension dans quatre fois son volume de sérum physiologique, additionnée de chloroforme et ensuite centrifugée. Le liquide trouble ainsi obtenu a un pH de 6,35 (valeurs extrêmes notées: 6,2 et 6,5). L’enzyme protéolytique qu'il contient est très résistant et son action est lente et prolongée. Ainsi après huit jours d’autolyse à l’étuve dans des conditions optimales de pH on peut faire une expérience établissant l'influence du potentiel d’oxydation-réduction sur le liquide autolysé et on constate que la protéolyse continue encore dans les lots comportant des conditions physico-chimiques favorables et que le potentiel exerce la même influence qu'avec de la pulpe fraîche, Même après quinze jours d’étuve, l’enzyme proléolytique est encore actif, alors que la catalase par exemple disparaît en quelques heures d’étuve. La catalase disparaît d’ailleurs également par un séjour à la glacière qui laisse intact le système protéolytique. Nous avons profité de cette circonstance pour nous débarrasser de la catalase et pour pouvoir ainsi introduire comme oxydant dans certains lots expérimentaux de l’eau oxygénée (perhydrol neutralisé) sans assister à sa décomposition immédiate.

Nous avons d’abord établi l’optimum de pH de l’hydrolyse des protéines de lextrait de rate par l’ensemble des ferments qu’il contient. Dans ce but, des échantillons sont amenés à des pH allant de 3 à 9,5 par addition de CIH ou de HONa sous le contrôle de l’électrode à antimoine. Ces échantillons sont abandonnés à 37° pendant 24 heures et l’azote aminé est dosé par formoltitration et comparé avec celui du liquide

initial. L'influence du pH peut être analysée avec une bonne précision, car ses variations en cours d’autolyse sont relativement faibles. Les résultats de trois expériences sont reproduits dans le graphique 19 ; il en résulte qu’il y a deux optima