GS D 4 CRE

30 rH

autolyse protéique p. cent du maxide rH optimum auche le nombre

mum. En bas de la figure polygone de fréquence des valeurs (voir tableau IV, p. 119); l'échelle des ordonnées exprime à g

en p. cent du nombre total, à droite en valeur absolue.

ele

les valeurs de la variable correspondant à la réduction de moitié de l’activité maximale. Ces valeurs, portées dans notre tableau d'ensemble, sont plus dispersées que les optima, mais semblent se grouper autour de quelques chiffres moyens, à Savoir rH 7 et 10 du côté réducteur et 21 et 27,5 du côté oxydant.

On peut chercher pourquoi, après élimination du flottement signalé des points expérimentaux par l’utilisation des moyennes, de grands écarts apparaissent dans la superposition des résultats obtenus avec des matériaux divers. S’agit-il de différences dues à ce que chaque système étudié présente ses caractéristiques propres ou s’agit-il d’écarts accidentels par rapport à une courbe théorique ? Assez d'arguments permettraient de justifier les écarts dans la seconde hypothèse: le manque de précision des chiffres utilisés pour l'établissement des moyennes peut encore retentir sur leur valeur. En plus les différents systèmes n’ont pas qualitativement et surtout quantitativement les mêmes causes d'erreur : l’évolution spontanée du potentiel au cours du séjour à l’étuve, très variable d’un cas à l’autre, fausse plus ou moins les valeurs de potentiel données. Les systèmes se modifient en cours de lyse par des réactions fermentaires ou autres concomitantes, libération ou destruction d’activateurs par digestion, etc... ; l’ensemble de ces réactions n’a pas la même importance quantitative, peut-être même n’agit-il pas toujours dans le même sens sur la protéolyse dans les différents systèmes étudiés ; les réactions parasites peuvent dépendre elles-mêmes du potentiel : l’activité de la protéolyse peut donc être modifiée et présenter ainsi des écarts par rapport à ce qu’elle serait si elle évoluait seule. Nous sommes ainsi tenté de considérer que toutes les autolyses protéiques étudiées, malgré la diversité de leur provenance, corresporident à un même mécanisme caractérisé notamment par un optimum à rH 14.

Un autre raisonnement encore nous conduit vers un résultat semblable. Les méthodes d’analyse spectrale mises au point par VLÈs permettent d'utiliser les pK (en rH) des courbes d’activité dans l’échelle d’oxydation-réduction en passant par les bandes d'absorption infra-rouge (pK—21,2) pour interpréter la nature des fonctions organiques en jeu. Les points d’inflexion (pK) des courbes que nous donnons se groupent autour de rH 7; 10; 21 et 27,5. Les longueurs d'onde correspondantes calculées ‘d'après la formule de VIrÈs sont de 3,03; 2,12; 1,0 et 0,77y . Du tableau de VLÈS, nous ex- {rayons ‘les longueurs d'onde les plus rapprochées avec les groupements dont elles sont indicatrices: 2,98 um —N— ;

ep pee:

8,2u =C=Q 12,0 à =C-O SLA LEE NE OM N— Nous désignons ainsi les fonctions intéressées par l'hydrolyse des protéines. Ce résultat nous fait conclure que les interventions étudiées touchent les liaisons peptidiques hydrolysables du substratum plutôt que des fonctions inconnues des enzymes ou des activateurs et expliquent de ce fait l’homogénéité relative de nos résultats. Il n’y a pas lieu de s'étonner que le potentiel d’oxydation-réduction intervienne sur les caractéristiques physicochimiques des liaisons peptidiques. FRIEDENWALD et STIEHLER ont développé une théorie de l’action du potentiel du milieu sur le point isoélectrique des ampholytes et VLÈS a concrétisé par une formule les interactions possibles du pH, du rH et de la massivité.

Les conclusions que nous venons de tirer ne s'appliquent évidemment pas à la pepsine qui est insensible au potentiel du milieu et probablement pas à la papaïne qui ne présente pas d’optimum, mais un potentiel d'arrêt. Celui-ci, établi entre pH 4,8 et 6,8, définit la valeur de rH = 23,3 + 0,5 qui correspond à x — 0,91 p. Cette longueur d’onde pourrait représenter le deuxième terme de la série du soufre (x = 0,956 uw). L'arrêt de la digestion papainique serait donc plutôt le fait de l’enzyme que celui du substrat étant donné l'importance du groupement —SH pour l’activité de la papaine. On confirmerait ainsi l'hypothèse de BERSIN qui, en 1936, interprétait le potentiel d'arrêt que nous avions déterminé comme potentiel caractéristique de l’équilibre thiol-disulfure de la papaine.

Nous voudrions encore relever la signification d’une de nos expériences que nous n'avons pas approfondie, mais qui permel d’entrevoir que le problème que nous avons abordé n’est pas entièrement résolu par les séries que nous avons faites à des pH déterminés. Ces pH correspondent à l’optimum de lyse dans des milieux réalisés sans oxydants ni réducteurs. Or une expérience faite sur la pulpe de rate et que nous avons relatée (p. 61, fig. 20) met en évidence un décalage considérable de l’oplimum de pH en présence d’un réducteur : le pH des deux sommets de la courbe d’activité en fonction du pH monte d’une demi-unité de pH en présence de sulfate ferreux qui abaisse le potentiel de 10 à 50 mV. Notons que pour la traduction des résultats en rH une augmentation de pH de 0,5 est balancée par un abaissement de potentiel de 29 mV : il semble donc que, dans l’expérience citée, l’optimum d'action se trouve à rH fixe. En dépouillant la Titlérature, on trouve quelques indications portant à croire que l'influence du potentiel du milieu sur l’optimum de pH est un phénomène général. Ainsi GANAPATHY et SAsTRI montrent que la papaine

por

oxydée, c’est-à-dire privée des réducteurs habituellement introduits comme activateurs, a un optimum d'action à pH 3, alors qu’en présence de réducteurs les mêmes auteurs trouvent pH 4,5 à 5,0. FRuTON et BERGMANN étudient l’action d’un enzyme protéolytique extrait de la rate de Bœuf sur divers substrats synthétiques : dans deux cas et en présence de cystéine, l’optimum de pH est au-dessous de 5, dans un autre, en absence de réducteur, on trouve pH 5,5 ; cependant, le même substrat n'ayant pas été utilisé en présence et en absence de réducteur, il n’est pas certain qu’on puisse attribuer ‘le décalage à une variation de potentiel. En tout état de cause, il faudrait représenter les résultats dans un système à trois dimensions : pH, potentiel et rendement, dans lequel nous trouverions une surface gauche. À défaut de données expérimentales permettant de définir cette surface, la représentation des résultats en fonctions du rH est certainement plus adéquate que celle en fonction du potentiel.

Discussion de la signification biologique de nos résultats.

Tous les enzymes protéolytiques intracellulaires que nous avons examinés, s'étant montrés sensibles à l'influence du potentiel d’oxydation-réduction du milieu, nous pouvons nous demander jusqu’à quel point ce résultat peut s'étendre à d’autres enzymes. Nous avons vu qu'il n’en est rien pour la pepsine, ferment agissant normalement en dehors des cellules. Quelques essais que nous n’exposerons pas en détail ici, nous ont montré que l’amylase de la salive humaine, ainsi que Pinvertine de la levure, sont également insensibles à l’action d’oxydants et de réducteurs. Des protéinases, bactériennes se comporteraient de même (MASCHMANN). Par ailleurs, toute donnée précise manque. Nous pouvons cependant interpréter dans le sens d’une influence du potentiel, les expériences montrant l'activation d’enzymes par des réducteurs. Nous relevons l’uréase (SUMNER el PoLAND et Tono, cependant contredilts par FiscHGoLp), l’amylase pancréalique et une amylase d'origine végétale (PRINGSHEIM, BORCHADT et HUPFER), l’arginase (EpL- BACHER @t LEUTHARDT), la glyoxalase (JOWETT et QUASTEL), l’'apocymase (WAGNER-JAUREGG et MOLLER), certaines phosphatases (RocnE, del REGNO), la lipase du Ricin (Iron), une déhydrogénase (RAPKINE et TRPINAC) et d’autres. Des toxines

ET Lee

d'origine microbienne sont également inhibées réversiblement par oxydation (GUILLAUMIE, FABRE et CHARLES), de même une hémolysine pneumococcique (SHWACHMAN, HELLERMAN et COHEN) et les bactériophages (Lominskr). Les études que nous avons faites pour des systèmes protéolytiques devraient donc être étendues à d’autres systèmes.

Récemment, l’uréase a élé étudiée de notre point de vue par SIZER et TYTELL qui ont examiné l’activité de cet enzyme cristallisé entre +540 et —260 mV : les résultats se traduisent par une courbe en cloche avec un maximum à 150 mV ; l’uréase non purifiée ne s’est pas montrée sensible au potentiel dumilieu de la même facon.

Pour nous rendre compte de la signification biologique de nos résultats, il faut d’abord situer les valeurs critiques de potentiel et de rH de nos systèmes fermentaires par rapport aux potentiels d’oxydation-réduction existant dans les cellules ou tissus dont ils proviennent. Le rH intérieur cellulaire est de l’ordre de 19 dans les ceïlules normales et peut descendre dans certaines conditions à 12 dans les mêmes cellules (Wurm- SER). Des mesures directes dans le foie (KUEHNAU), dans la rate (BiericH et LANG), dans Je muscle (AUBEL et MAURIAC, UcHiIMaARA), dans les tissus végétaux (KRASSINSKY) confirment suffisamment ces données pour les matériaux que nous avons utilisés. Les conditions de rH sont donc telles que les systèmes protéolytiques ne sont pas inhibés dans la cellule du fait du potentiel actuel.

On doit alors se demander pourquoi les ferments protéolytiques existant dans la cellule n’y entament pas l'intégrité des protéines constitutives du protoplasme. Une première série de faits que nous appellerons des facteurs structuraux peut rendre compte de cette inactivité Il peut y avoir une séparation spatiale du ferment et de son substrat éventuel ou encore du ferment et de son activateur obligatoire ; le ferment peut être adsorbé sur un support non protéique ; il peut être fixé chimiquement sur un substrat inattaquable comme l’a vu VELLUZ pour les toxines tétanique et diphtérique qui se combinent avec la papaïne sans être digérées.

On peut, d’autre part, envisager des facteurs physico-chimiques: les conditions du milieu peuvent s’opposer à l’activité des ferments. Les données de la littérature montrent que le pH cytoplasmique peut ne pas être identique avec le pH correspondant à l’optimum de l’action du ferment. Il est cependant rare que le pH de l’intérieur cellulaire tombe tout-à-fait en dehors de la zone de PH permettant une activité de l’enzyme. Les données que nous venons dapporter pour l'influence du potentiel d’oxydation-réduction sur l’activité des ferments mon-

trent que là encore l’optimum ne coïncide pas avec les caractéristiques de lintérieur cellulaire à l’état normal, mais que celles-ci ne bloqueront en aucun cas toute l’activité du ferment. La massivité qu’on sait ne pas être indifférente pour les activités enzymatiques n’a cependant pas été suffisamment mise en jeu expérimentalement pour que nous puissions la faire intervenir dans nos discussions. Il se peut que les trois facteurs physico-chimiques se combinent (VLÈS) et interviennent alors d’une façon différente, comme permet de l’entrevoir l'influence du potentiel d’oxydation-réduction sur l’optimum de pH que nous venons de signaler.

Il se peut, d'autre part, que les conditions d’une activité lytique réduite et par conséquent réglable par les caractéristiques physico-chimiques du milieu soient réalisées dans la cellule vivante, mais que cette activité soit compensée par une autre, synthétique, s’exerçant d’une façon analogue dans les mêmes conditions de milieu. Nous reviendrons sur ce problème.

Nous pouvons en tout cas envisager des phénomènes biologiques retentissant éventuellement sur l’activité des systèmes protéolytiques par les mécanismes que nous venons d'étudier. C’est dans ces raisonnements qu'apparaît l'intérêt de notre technique d’autolyse. Les enzymes agissant sur leur substrat naturel, nous réalisons in vitro le système lytique du tissu normal dans des conditions aussi voisines que possible de celles existant dans les cellules. Nous pourrons donc comparer nos résultats aux phénomènes de la vie cellulaire ce qui serait certainement moins correct pour des résultats obtenus avec des enzymes purifiés et des substrats étrangers (voir introduction).

On sait que les phénomènes de dégénérescence et de dénaturation protéique libèrent des groupements —SH. Ces mêmes groupements étant des activateurs des enzymes protéolytiques, on peut penser qu’une telle dénaturation intracellulaire, si elle existe, sera suivie de lyse plus ou moins localisée jusqu’à ce que Pélimination (par diffusion, par exemple) des produits réducteurs libérés rétablisse le potentiel normal.

Pour l’Arénicole dont nous avons étudié un système protéolytique, on a décrit une « histolyse saisonnière » (Bonn), c’està-dire une fonte des tissus en hiver quand l’animal reste enfoui dans le sable. Des mesures de potentiel effectuées dans la cavité cœlomique d’animaux normaux y décèlent un potentiel voisin de celui des témoins de nos digestions réalisés par simple broyage de tissus sans addition d'aucun réactif. Le potentiel mesuré, pouvant varier entre +50 mV et +300 mV, se place sur la pente de la courbe de l’activité de la protéolyse (voir fig. 15) et peut ne pas être très loin du potentiel

Race

inhibant pratiquement celle-ci. Les conditions ainsi réalisées dans les tissus ne seraient donc pas favorables à une autolyse ; mais il suffit de réaliser une légère asphyxie de l’animal, par exemple en le couvrant d’une couche de sable, pour voir le potentiel dans la cavité coelomique descendre plus où moins bas, quelquefois jusqu'à —50 mV. On obtient ainsi des condilions qui, d’après les expériences in vitro, doivent favoriser l’autolyse. Nous avons suggéré que la variation d’aclivité des ferments protéolytiques contenus dans la paroi de lPArénicole avec les conditions de pH et d’oxydation-réduction du milieu que nous avons décelée peut intervenir dans la vie de l’animal. Des conditions de vie défectueuses et notamment une asphyxie partielle doivent activer la protéolyse.

Des variations fonctionnelles de l’activité des enzymes protéolytiques intracellulaires semblent fréquentes et si rien n’empêche de les attribuer dans notre sens à des variations de potenliel le manque de données expérimentales ne permet pas d’affirmer un tel mécanisme. Nous sommes cependant tenté d’envisager sous ce jour des observations comme celles de SIMON qui voit l’autolyse des tissus du rein inhibée dans la néphrite par intoxication au chrome (agent oxydant), ou encore celles d'ORECHOWITSCH qui compare l’action de la cystéine sur les tissus normaux et en régénération: l’action est nulle dans le second cas bien que l’activité soit plus forte que dans le premier ; nous pensons que les systèmes fermentaires dans le tissu en régénération sont déjà activés au maximum par les conditions physico-chimiques du milieu. Morse a étudié le conditionnement de l’atrophie de la queue du Tétard et a confirmé que l’occlusion des vaisseaux sanguins à la base de la queue (BATAILLON) est le premier phénomène observable: l’ischémie ainsi créée doit aboutir à un abaissement du rH tissulaire et favoriser ainsi l’autolyse. Nous citerons encore certains procédés de conservation de la viande qui utilisent des oxydants (nitrates par exemple) ; ceux-ci n’agiraient-ils pas en entravant la protéolyse ? On a interprété par une inhibition de la protéolyse l’action de certains oxydants introduits dans la farine comme améliorants de la panification (JOERGENSEN).

Pour savoir si les phénomènes que nous avons étudiés dans des extraits de graines d’Orge interviennent dans la mobilisation de l’azote au moment de la germination, nous avons fait des mesures de potentiel d’une électrode de platine dans la graine. Nous avons exploré systématiquement différents points de graines soumises à une imbibition de 48 heures à température ordinaire. La topographie des potentiels est assez constante. Le potentiel le plus élevé se trouve au centre de la graine: + 370 mV en moyenne. Vers les deux pôles les valeurs moyen-

se

nes sont plus basses (+325 mV). Le potentiel nettement le plus bas se trouve toujours au contact de la base de la jeune racine (+215 mV). Ces valeurs ne montrent pas d'évolution importante entre la Première et la cinquième journée de la germination. Au bout de 5 jours, l’électrode introduite dans le Dareichyine des jeunes feuilles (en lumière diffuse) prend des potentiels bas (+190 mV) alors que les tissus des racines se fixent aux environs de +365 mV. Une différence de potentiel entre les racines et le sommet d’une même plante avait déjà été vue par d’autres auteurs. Toutes ces valeurs de potentiel sont très élevées par rapport à l'optimum de l’activité hydrolytique des protéinases de la graine. D’après les courbes d’activité que nous avons données celle-ci serait réduite de moftié environ aux potentiels mesurés dans la graine. JANICKI a montré que le potentiel d’oxydation-réduction diminue dans la graine au cours de la germination, résultat que nous n’avons pas confirmé entre le premier et le cinquième jour, mais qui rendrait bien compte de la mobilisation de l’azote par accentuation de l’activité lytique des enzymes protéolytiques. D'autre part, il est peut-être intéressant de rappeler que la papaiïine a un domaine d'activité condensatrice dans les potentiels élevés (+ 450 à +570 mV à pH 6,5) au-dessus de la zone de potentiel compatible avec son fonctionnement hydrolytique (voir plus loin l'exposé de nos expériences). Si l'extrait d'Orge se comportait de la même façon on aurait dans la graine un équilibre entre les phénomènes de lyse et de synthèse dirigé par le potentiel actuel. Nous reviendrons plus loin sur cet important problème.

Nous avons pensé pouvoir analyser la signification des potentiels mesurés en modifiant l’activité physiologique de la plantule. Pour le moment nous avons étudié l'influence du froid et des vapeurs de toluène. Le froid (séjour de 2 heures à — 30 environ) modifie très peu les potentiels ; à peine sont-ils légèrement diminués. D’après BurkewiTscH les vapeurs de de toluène diminuent les processus de synthèse sans entraver l’hydrolyse protéique ; dès le premier quart d'heure de séjour dans les vapeurs de toluène tous les potentiels de la graine baissent considérablement pour atteindre après une heure environ des valeurs minimales situées de 50 à 80 mV au-dessous des valeurs normales ; les écarts relatifs entre les divers points de la graine subsistent. Ensuite les potentiels montent; au cours de 24 heures, pendant que la plantule meurt, les valeurs se rapprochent d’un niveau commun vers +350 mV. La chute initiale de potentiel dans les vapeurs de toluène en rapprochant les potentiels de l’optimum de la protéolyse semble corroborer les conclusions de BUTKEWITSCH.