ESSAIS DE SYNTHÈSE PROTÉIQUE IN VITRO

Historique.

Faits expérimentaux.

L’explorateur de la littérature enzymologique — et spécialement quand il s’agit de substrats protidiques — est amené à faire une constatation curieuse : à l'énorme masse des données sur l’hydrolyse des matières azotées par des enzymes variés ne fait face qu’une documentation extrêmement fragmentaire sur les possibilités de synthèse. Et pourtant si l'organisme vivant réalise l’hydrolyse des matières azotées alimentaires c’est le plus souvent un processus se passant dans le milieu extérieur et qui ne saurait être considéré comme une mahifestatjom intégrante de la matière vivante. La synthèse, par contre, de cette matière même, à partir de constituants élémentaires pris dans le milieu, et tous les remaniements fonctionnels de l’intérieur de la cellule exigent l’intervention de catalyseurs dont le rôle s'oppose en quelque sorte aux ferments digestifs et qui, eux, nous semblent l’apanage exclusif de la matière vivante au moins quant à leur origine. Pour le biologiste, ces phénomènes de condensation et de synthèse paraissent autrement importants que les processus de digestion alimentaïre. Mais si ceux-ci frappent l’observateur le plus superficiel et, dironsnous, le moins philosophique, et lui offrent des matériaux d’étude bien accessibles par la! spécialisation des appareils digestifs chez les animaux quelque peu évolués, les processus de synthèse, en raison même de leur ubiquité dans la matière vivante, ne disposent ni d'appareil différencié ni même de localisation bien précise. Ils n’attirent pas l’attention du cher-. cheur. C’est dans ce sens que Maurice NiICOLLE pouvait dire que dans l’organisme tous les processus de construction sont

silencieux.

toire

La relative indifférence du chercheur vis-à-vis du processus de construction organique intracellulaïire a même abouti à ce paradoxe que les enzymes extrañts de tissus ou de cellules n’ont été le plus souvent éprouvés que quant à leurs capacités de lyse alors qu’un raisonnement bien simple devait les faire considérer (au moins en tant qu'hypothèse de travail) comme les agents des constructions dont les, cellules sont le lieu.

Il est, en effet, probable (la preuve est faite sans discussion ppssible pour certains enzymes s'adressant à des substrats autres que les protides) que les mêmes enzymes réalisent suivant les conditions du milieu l’hydrolyse ou la condensation. Ayant exploré et démontré l’action du potentiel d’oxydationréduction du milieu sur l’activité lytique de protéinases, nous devions faire le pendant de cette investigation pour les activités synthétisantes. Mais, tandis que l’activité lytique est bien étudiée pour un grand nombre d’enzymes extraits de tissus vivants et nous offre par conséquent un point de départ solide, les condensations protidiques in vitro sont encore contestées. Non pas qu’on puisse, à notre avis, nier théoriquement leur existence dans la cellule vivante, mais leur reproduction possible in vitro par des enzymes extraits est discutée. Nous allons donc d’abord faire un rapide exposé des essais de synthèse enzymatique in vitro de protides plus ou moins complexes à partir d'éléments plus simples (1):

Un grand nombre de tentatives, et historiquement les premières, ont porté sur une action condensante éventuelle du suc gastrique. Etant donné qu’il s’agit là de ferments digestifs qui n'ont peut-être aucune fonction intracellulaire, on ne saurait faire à priori lhypothèse d’une activité synthétisante à moins d'admettre la réversibilité de tous les processus enzymatiques. Déjà, en 1894, DaniLEwsxr a fait l’observation, confirmée par OKUNEw en 1907, que la présure détermine dans une solution de peptone un coagulum qui présente le caractère d’une globuline; il s’agirait donc d’une synthèse. D’autres chercheurs de l’école russe (LAwrow. SAWJALOW, KURAJEW notamment) étudient ce phénomène et montrent finalement qu’il peut être obtenu également avec d’autres ferments protéolytiques et NUERENBERG le reproduit avec des extraits d'organes. On appelle coagulose la substance condensée précipitée en présence de papaïne et plastéines celles obtenues par des enzymes d’origine animale. Voici comment se réalise l'expérience fondamentale de DANILEwWSkI1: 10 cm? d’une solution de pep-

(1) Nous n’envisageons pas ici les synthèses de polypeptides qui ont été réalisées, par FiSCHER par exemple, par des mécanismes chimiques qui ne sauraient se produire dans la cellule vivante (voir aussi BorsooKk).

tones à 400% sont additionnés de 0,7% de CIH et de 0,12 g. de pepsine ; le tout porté à 65° se transforme peu à peu en une gelée qu’on dilue à l’eau et qu’on filtre. Sur le filtre reste un précipité insoluble qui représente jusqu’à 10% des peptones employées : la plastéine. La vitesse de gélification augmente rapidement avec la température : il faut L jours à 5°, "26 heures à 400, 35 minutes à 60° et 20 minutes à 70°, mais, la destruction de la pepsine s’accélérant également à température croissante, le maximum de précipité est obtenu entre 37 et 40. Une réaction légèrement acide (au-dessus du virage du papier Congo, c’est-à-dire pH > 4) est favorable (Lawrow), on reste loin de l'acidité nécessaire pour la digestion pépsique, acidité qui inhibe toute production de plastéine. Nous trouvons donc là Pindication d’un enzyme fonctionnant dans un sens ou dans Pautre suivant les propriétés physico-chimiques du milieu.

En 1904, Bayriss note que l’action de la trypsine aboutit à une diminution de la conductivité électrique d’une solution concentrée de produits de digestion trypsique: il interprète cette diminution des ions libres comme étant due à une disparition de groupements ionisables, à une condensation. En 1907, RoBErTSON obtient par action de la pepsine et TayLor par action de la trypsine sur des produits de digestion de la caséine une substance assez mal caractérisée, la paranucléine, qui serait le résultat d’une synthèse.

La production de plastéine semble bien être due à une attivité enzymatique: une anti-protéinase, l’anti-trypsine ‘du sérum, empêche également la formation de plastéine (JaAcoBy). Seuls les produits d’une hydrolyse pepsique ou chimique peuvent être utilisés ; les produits d’une hydrolyse trypsique ne fournissent pas de plastéine (HENRIQUEZ et GJIALDBAEK). La plastéine ne semble pas résulter d’une insolubilisation de peptones ; sa composition en acides aminés est, d’après LEVENE et VAN SLYKE, assez différente de celle des peptones de WiTTE ayant servi de matériel de départ ; elle est plus pauvre en glycocolle et alanine, plus riche en acide glutamique, acide aspartique, etc... HENRIQUEZ et GIALDBAEK montrent qu'il s’agit bien d’un processus de condensation : dans une solution à ovalbumine de 30 % fortement peptonisée, la pepsine agissant à 37° pendant 11 jours fait baïsser l’azote formoltitrable de 42,3 à 38,3 p. cent de N total pendant qu'apparaît un précipfité abondant. Quand on sépare le précipité formé, son azote formoltitrable ne représente que 13,4 p. cent de son azote total, ce qui traduit une disparition considérable de groupements aminés libres par condensation par rapport au filtrat dans lequel l'azote formoltitrable représente 39,5 p. cent. La dimi-

nution de l’azote formoltitrable avait déjà été vue antérieurement par GLAGOLEW, elle sera encore confirmée, en même temps que la disparition de groupements carboxylés libres, par - COLLIER. Parallèlement, les réactifs précipitant les protéines (tanin et autres) donnent un précipité progressivement plus abondant au cours de la condensation. D’après les expériences de HERRMANN et CHAIN une plastéine de peptone de fibrine inoculée au Lapin aboutit à un antisérum actif vis-à-vis de différentes plastéines, mais inactif sur la peptone de départ ainsi que sur d’autres matières albuminoïdes naturelles. La plastéine semble donc bien être une substance définie.

Les modalités de production de la plastéine ont été étudiées de plus près par Borsook, Mc FADYEN et WASTENEYS ; ils utilisent les produits de digestion pepsique amenés à DHEA ou des peptones. La synthèse leur paraît indiscutable et d’un rendement d'autant plus. fort que la dégradation préalable avait été poussée moins loin. Malgré ces recherches nombreuses apportant des précisions fort poussées sur la production des plastéines, leur caractère de produit de synthèse est mis en doute principalement par Bayer qui les considère dès 1903 comme polypeptides à propriétés modifiées mais pas nécessairement condensés, et surtout en 1940 par LiNDbEr- STROEM-LANG qui est frappé par le poids moléculaire bas des précipités recueillis (environ 1200 d’après FoLLey) et par la nécessité d’une nouvelle addition de pepsine après le premier temps de digestion : LINDERSTROEM-LANG se demande s’il ne s’agit pas d’un produit de combinaison de la pepsine ou de ses impuretés avec des Produits de digestion. Nous verrons plus loin que cette hypothèse ne saurait s'appliquer à d’autres condensations observées ; mais elle paraît être une sérieuse critique pour des expériences telles que celles de ROBERTSON et BRAILSFORD ou certains essais de Borsook et WASTENEYS qui concentrent au bain-marie le produit de digestion pepsique avant d'ajouter une nouvelle quantité de pepsine. Cette concentration préalable peut modifier complètement les conditions de solubilité de certains complexes d’origine physico-chimique pure (ViÈs) et un précipité éventuel ne saurait plus être attribué à Coup sûr aux actions enzymatiques. RONA et CHROMETzKA, opérant également sur des produits de digestion pepsique concentrés après la digestion en vue de l’essai de synthèse, observent l'augmentation du précipité par l'acide trichloracétique et la diminution de l'azote aminé, mais pas de variation des groupements carboxyles libres ; ils se demandent s’il ne s'agit pas d’une désamination.

Signalons encore que certains auteurs ont étendu le terme

de plastéine à des produits de condensation par des mécanismes autres que l’action de la pepsine. Nous sommes ainsi conduits à relever dans la littérature et à discuter un ensemble de faits très variés pouvant être considérés comme des condensations protidiques par action d’enzymes spécifiques.

Nous passerons d’abord en revue les tentatives faites avec des enzymes d'origine végétale. ZALEskI constate que dans des petits Pois non murs sortis de la cosse, l’azote protéique augmente aux dépens de l’asparagine. Cette constatation l’amène à faire l’expérience suivante : des petits Pois non murs sont broyés au sable et portés dans une solution d’asparagine à 0,75% en présence de toluène ; des dosages effectués à des intervalles réguliers montrent que pendant 21 jours l’azote protéique diminue pour augmenter ensuite, il y aurait donc resynthèse partielle. D'autre part, il utilise un extrait de peüts Pois qu’il fait agir sur la peptone de Wirre: il conclut à une condensation lente mais nette.

L'école russe a étendu ses expériences à d’autres enzymes que la pepsine. KURAJEW a fait agir la papaïne sur le produit de digestion de la fibrine après concentration par évaporation ; il observe la formation de corps analogies aux plastéines et qu’il appelle coaguloses. IWANOFF fail agir un ferment protéolytique de levure en milieu alcalin sur des peptides : l’azote précipitable à l’acétate de plomb augmente aux dépens de celui des peptides qui ne précipite pas ; ceux-ci se sont donc condensés en molécules plus grosses. Enfin BLAGo- WESTSCHENSKI expose en 1926 l’action synthétisante des protéinases végétales. i

Plus récemment, VOoEGTLiIN, MAVER et JoHNsoN obtiennent une resynthèse partielle par passage d'oxygène dans le produit de digestion de la fibrine par la papaine activée. BERsiN et KozsrTEer observent une inversion de l’action hydrolytique de la papaïne en la faisant agir sur les hydrolysats au contact de l’air «et en présence d’ascorbinate de Cu. Cest au moyen de la papaine que nous avons pu mettre en évidence une condensation de produits de digestion et signaler en 1936 les conditions d’oxydation- réduction du milieu permettant à ce processus de se faire. Cependant, STRAIN et LINDERSTROEM-LANG reprennent des essais de synthèse de protéides par aération de produits de digestion, mais avec des résultats négatifs. En partant de produits de l’hydrolyse de différents substrats par la papaine une aération intense amène bien une augmentation du précipité trichloracétique, mais le dosage des groupements aminés et carboxylés libres n’accuse aucune diminution. Il s'agirait plutôt d’une formation de ponts -S-S- entre des chaînes de "peptides par oxydation des groupements -SH.

Il faut en plus considérer les critiques que LINDERSTROEM- LanG adresse à l'interprétation des résultats expérimentaux. La principale à trait à la possibilité de réactions autres que la condensation peptidique et qui aboutiraient également à une disparition de groupements aminés libres. Ainsi -NH? peut réagir avec les aldéhydes et Spécialèment avec le glyoxal. La technique de van SLYkE comporterait des possibilités d’erreur qui n'existent pas avec d’autres Procédés de dosage. Les molécules ainsi formées atteindraient éventuellement la limite de précipitabilité par l'acide trichloracétique (1). De même, STRAIN €@t LINDERSTROEM-LANG ont des résultats négatifs en partant de lPautolyse de levure. Enfin des transmutations dans les chaînes peptidiques pourraient créer des peptides plus volumineux et insolubles (2). Mais les dosages de -NH? et -CO2H n’accuseraient dans ce sens aucune variation.

Parallèlement à ce qu’on avait fait pour l’hydrolyse, CoLLiEr recherche en 1940 pour la condensation par la papaine les conditions d'activation et d’inhibition. La papaine activée par CNH, la cystéine ou SH2 produit une plastéine à partir des produits de digestion Papainique où pepsique d’ovalbumine. L’optimum est à pH 4,8. L’ébullition, la présence d’iodacétate ou d’oxydants tels que H20°, l’alloxane ou simplement une large aération inhibent le processus. La plastéine formée peut être hydrolysée à son tour par la papaine (optimum de pit: 43) qui libère les groupements aminés et carboxylés comme on le sait pour l’hydrolyse de protéines naturelles. L'auteur conclut que les conditions de pH et d’oxydation-réduction sont approximativement les mêmes Pour l’hydrolyse et la synthèse qui coexisieraient dans le même milieu et aboutiraient à un équilibre de sorte que seules les concentrations des termes de la réaction détermineraient le sens de Paction enzymalique. Cette conclusion est, pour les enzymes protéolytiques, en contradiction avec d’autres faits expérimentaux et ne s'applique d’ailleurs pas aux expériences du même auteur avec la pepsine cristallisée : celle-ci exige des conditions physico-chimiques parti- Culières pour la production de plastéines. Nous exposerons plus

(1) On peut se demander si une telle réaction ne pourrait pas être considérée comme une condensation au même titre que la production de liaisons peptidiques, bien que son importance quantitative doive forcément rester limitée.

(2) Même réflexion que dans la note précédente : là encore nous nous demandons si un tel processus ne pourrait pas être considéré comme un des mécanismes aboutissant à la production de grosses molécules.

Pour ce qui est des critiques d'ordre technique, nous pensons qu’elles ne sau-

raient intervenir dans interprétation des expériences personnelles que nous allons exposer,

RO

loin les expériences fui ont conduit à la synthèse de peptides par action de la papaine sur des mélanges d’acides aminés €t de corps simples divers n’existant pas dans l’organisme.

Les observations de synthèses avec des enzymes d’origine animale et intracellulaire sont nombreuses, mais souvent Dan fragmentaires. Après les recherches sur les plastéines que nous avons signalées, DE BRUYNE étudie en 1924 l’azote précipitable par a chaleur dans les autolysats de foie ; cette forme d'azote peut augmenter, témoignage de phénomènes de synthèse, si la réaction. du milieu est faiblement alcaline. HAAR- MANN confirme cette possibilité de synthèse dans les autolysats de foie et de rein faiblement alcalinisés en étudiant Îles complexes et précipités cuivriques. Ayant étudié la biochimie de la métamorphose des Lépidoptères et ayant suivi les remaniements importants des matières azotées, Mme CourToIs- DRILHON pense disposer chez les larves de Lépidoptères de systèmes enzymatiques puissants ; elle fait agir pendant 4 à 12 jours à 38° du sang de larve en crise histogénétique sur de l’hydrolysat de éhair de poisson exempt de substances précipitables par l'acide trichloracétique : effectivement, les acides aminés disparaissent du mélange sans qu'il y ail formation d’ammoniaque.

Dans les recherches de VOEGTLIN, MAVER et JOHNSON apparaît un essai de modifier les conditions de milieu en vue de favoriser la synthèse: le passage d'oxygène dans les autolvsats de tissus donne des résultats positifs à ces auteurs: l’azote coagulable augmente. RoNDont et Pozzr observent avec un matériel semblable une augmentation des fractions précipitables par l’acide trichloracétique après introduction d’eau oxygénée dans l’autolysat. MyYsrkowsxi étudie la catepsine de l'embryon de Poulet ; il dit avoir échoué dans ses essais de synthèse. Nous relevons cependant dans son mémoire une expérience ayant abouti à une condensation probable: de la gélatine ou de l’ovalbumine est digérée à pH 4,7 par un extrait du jaune d’œufs en incubation ; après 4 à 5 jours, on concentre, on amène à un pH compris entre 6 et 7,2, on réajoute de l'extrait frais et éventuellement du glycogène, H?0? où SO!Cu et, dans un certain nombre de lots, on assiste à une diminution de l'azote aminé libre. Dans une recherche de MAvER, nous notons également la réalisation d’une synthèse qui, cependant, n’a pas été relevée par l’auteur : il s agit de l’action d’une catepsine purifiée sur la globuline du foie de Rat. On mesure pour différents pH les variations de l’azote protéique. Entre pH 3et 6, il y a digestion avec un optimum à pH 4; mais à pH 8, on note une augmentation de l’azote précipitable, augmentation équivalente à un cinquième de la di-

gestion à pH 4.

PAU CT ee

La disparition de l’azote aminé dans des extraits de foie est étudiée de plus près par AGREN et HAMMARSTEN. Dans des extrails soigneusement déprotéinés amenés à pH 6,7 et additionnés de tricrésol apparaît lentement (en 3 à 60 jours) une fraction précipitable par l’acide sulfosalicylique ou trichloracétique. En même temps, Fazote aminé libre diminue de 7 p. cent. Le corps précipitable à un point isoélectrique entre pH 5 et 7 et peut être hydrolysé par des polypeptidases.

Dans d’autres recherches, les auteurs ont fait agir des en- Zymes soit sur des acides aminés purs tels qu’ils existent dans les organismes, soit sur des corps chimiques présentant des: fonctions acides et aminées se prêtant éventuellement à une condensation. On peut dans ces conditions opérer avec des enzymes purifiés agissant sur des substrats rigoureusement connus. Dans une expérience inédite datant de 1920, VLÈs fait agir un extrait glycériné d’intestin de Sélaciens sur du glycocolle ; il pratique la réaction du biuret et l'analyse spectrophotométrique de la couleur développée permet de déceler une réaction du biuret Positive à côté du spectre du glycinate de Cu. #BLAGOWESTSCHENSKI (1926) fait agir une protéinase de Phaseolus Mungo sur une solution de leucine et de glycine en présence de glycérol: des polypeptides se forment.

BERGMANX et FRAENKEL-CONRAT font agir de la papaïne sur un mélange de carbobenzoxyglycine et d’aniline, il se forme un anilide peu soluble qui cristallise. Le rendement peut atteindre 80 p. cent en quelques jours. On obtient de même un anilide de benzoyl-/-leucine. La papaine doit être activée par la Cystéine, le glutathion ou CNH ; l’optimum de pH est, 1,6: la papaine opère donc cette synthèse dans les mêmes conditions physico-chimiques que les hydrolyses. Mais ces mêmes conditions ne permettent pas de synthèse avec des acides aminés non substitués. Il s’agit donc d’un cas particulier ; néanmoins il démontre sans discussion possible la catalyse d’une condensation de type peptidique par une protéinase, Les auteurs ont également utilisé la broméline et Ja catepsine du foie; les mêmes réactions se produisent. mais avec un rendement moindre. En étendant ces recherches BERGMANN et FRUTON montrent que la chymotrypsine Calalyse la synthèse de ls benzoyl-l-{yrosylglycine à partir de benzoyl-l-{yrosine et de glycylanilide. BERGMANN et BEHRENS font agir la papaïne sur un mélange d’aniline et d'acétyl-d-l-phénylalanyiglycine : ce n’est que l’anilide gauche qui se forme. La synthèse enzymatique est donc asymétrique comme dans l'organisme.

Borsook et Dugnorr étudient la synthèse de l'acide hippurique. Les données thermochimiques montrent que léquilibre entre les produits d’hydrolyse d’une part et l’acide hippurique

d'autre part se trouve réalisé, en absence d’enzymes, par une hydrolyse presque complète dans les conditions de concentration (0,1 m) et de température (25°) choisies par les auteurs. La synthèse absorbe de lénergie qui doit éventuellement être fournie par une réaction couplée. En présence de tranches de rein ou de foie la synthèse atteint un taux élévé (jusqu’à 76% de l’acide benzoïque fourni), variable d'ailleurs suivant les tissus utilisés et les espèces animales sur lesquels ils ont été prélevés. Les synthèses ainsi obtenues en présence de protéinases peuvent éventuellement être réalisées sans leur intervention, mais alors dans des conditions qui semblent être très différentes de celles réalisées dans une cellule vivante. Nous rappelons à ce sujet que HENNIGER en 1878, HOFMEISTER en 1878 et plus tard SCHUETZENBERGER ont réussi à condenser des peptones en corps plus complexes par l'intervention d'agents déshydratants et de températures élevées. La condensation en milieu glycériné est spécialement étudiée par BaL- BIANO et TRASCIATTI et par MarzrArD. À la surface de solutions de peptones les rayons ultraviolets produisent une membrane de constitution analogue à celle des plastéines (LIEBEN et JESSERER).

Influence de l’équilibre d’oxydation-réduction du milieu.

Dans un grand nombre de techniques ferméntaires l’adjonction d’oxydants et de réducteurs joue un rôle important. Les lyses exigent souvent la réalisation d’un milieu réducteur et dans la première partie de notre exposé nous avons pu préciser les conditions de potentiel dans ce sens. D'autre part, dans les essais de synthèse que nous venons de résumer, l’aération des milieux et éventuellement l’addition d’oxydants sont. presque toujours considérées par les auteurs comme moyens de favoriser la condensation. Cette action directrice de l’équilibre d’oxydation-réduction du milieu, c’est-à-dire l’orientation de l’activité enzymatique vers l’hydrolyse en milieu réducteur, vers la synthèse en milieu oxydant, semble avoir été entrevue pour la première fois par WaLDscHMmiDTr-LEirTz et PurR en 1931 ; ces auteurs disent : « Eher scheint uns die Vorstellung einer Steuerung des intrazellularen Eiweissumsatzes durch das Oxydo-Reduktionspotential im Sinne der Hydrolyse einerseits,

der Synthese andererseits physiologischen Sinn zu besitzen» (1). Dans le même ordre d'idées ces auteurs envisagent avec WEIL l'influence du sulfhydryl sur les échanges intracellulaires des protides et des glucides. En étudiant la signification biologique des potentiels d’oxydation-réduction WURMSER admet également que les réactions enzymatiques dans la cellule vivante et notamment l’équilibre entre les synthèses et les Iyses sont sous le contrôle de ces potentiels. MoTHEs a apporté des arguments expérimentaux que nous avons exposés dans lintroduction en faveur de cette conception.

L'idée générale de l'orientation d’une même réaction d’équilibre vers la lyse, d’une part, vers la condensation, d'autre part, suivant les conditions ambiantes est plus ancienne. Elle a été nettement formulée par Maurice NicozcE en 1908. En élaborant une conception générale des anticorps cet auteur considère l’hypersensibilité, phénomène bruyant, comme traduisant une hétérolyse et l’immunité, phénomène silencieux, une hétérocoagulation (2). « La substance vivante, préalablement impressionnée par les antigènes, réagit donc vis-à-vis d’eux, tantôt d’un sens, tantôt de l’autre, comme on vient de voir qu’elle le fait pour ses propres éléments ; tout dépend des circonslances en jeu, plus précisément, du «signe » de leur résultante ».

(1) Traduction : L’idée d’une orientation du métabolisme intracellulaire des protides par le potentiel d’oxydation-réduction, dans le sens d’une hydrolyse d’une part, de la synthèse d’autre part, nous semble plutôt avoir une signification physiologique.

. (2) Nous appellerions aujourd’hui condensation ce que M. Nicozre désigne ici par le terme de coagulation.

Expériences personnelles

Technique générale.

Les auteurs qui ont essayé d’obtenir une synthèse protéique in vitro pont procédé le plus souvent par concentration des produits d’une hydrolyse préalable en pensant déplacer ainsi vers une condensation l’équilibre basé sur la loi des masses. Des objections ont été faites contre les résultats obtenus de ‘cette facon: les milieux réalisés par la protéolyse initiale sont trop complexes pour qu’on n'ait pas à craindre des. causes d'erreur. Au cours de la concentration de nouveaux complexes pourraient se former ou certains constituants atteindraient la limite de solubilité, bref des modifications des équilibres physico-chimiques pourraient être prises pour des actions enzymatiques.

Nous avons donc utilisé pour nos essais de condensation les milieux tels qu’ils résultaient de l’hydrolyse préalable sans les concentrer ni chercher à isoler des fractions, ni introduire des ferments purs. Après avoir laissé évoluer un système assez loin dans le sens de la lyse nous modifions les conditons physico-chimiques dans l'intention de déterminer un renversement du sens de l'action enzymatique. Les recherches exposées dans la première partie de notre travail ayant montré qu'un milieu faiblement réducteur accentue Pactivité lytique, de nombreuses expériences que nous venons de rappeler ayant mis en évidence l’action favorisante des milieux oxydants pour les ccndensations, nous avons été amené à mettre en œuvre une augmentation du potentiel d’oxydation-réduction du milieu pour essayer d'obtenir les résultats cherchés. Dans certains cas et en nous basant sur des indications de la littérature nous avons modifié en même temps le pH. Etant donné aussi que les pH optima pour la lyse sont généralement inférieurs au pH intérieur des cellules ou tissus d’origine des enzymes et que nous voulions reproduire in vitro l’activité synthétisante de ces tissus nous avons généralement élevé le pH du milieu après

la lyse dans l'intention de nous rapprocher des conditions existant in vivo. Dans le même souci nous mavons pas opéré sur des substrats purs, mais sur des produits complexes d’une aulolyse, pensant respecter ainsi des spécificités éventuelles des enzymes el l'activation possible par des corps existant dans le milieu. En plus il se pourrait que des réactions secondaires! se passant dans le milieu complexe soient utiles pour l’accomplissement des condensations protidiques (constitution de réactions couplées, sources d'énergie, etc...). Un exemple d’une telle intervention est donné dans une recherche de KOSTYTCHEVW ; cet auteur reprend les expériences d’IwaNoFF sur la synthèse qui peul se produire dans un aulolysat de levure et il montre que la présence de glucides est indispensable pour que le résultat soit obtenu. Une dérogation à notre technique a été faite pour la papaine et la pepsine pour lesquels la gélatine et quelquefois la caséine ont fourni le substrat.

Voici la technique globale résultant de ees considérations : dans un premier temps on opère une lyse avec la technique fixée au début de ce travail. Le même matériel de départ a servi le plus souvent aux expériences de lyse et de condensation. La lyse est poussée plus loïn que dans les expériences que nous avons rapportées ; elle m'est cependant pas complète, surtout parce que généralement nous n'avons pas ajouté de réducteurs. Le milieu ainsi obtenu est amené à un pH différent et réparti en lots. Les uns restent à la glacière avec ou Sans addition de réactifs, les autres sont placés à l’étuve après différentes additions. Les potentiels sont mesurés après 1-2 jours d'étuve et différents dosages sont opérés.

Expériences avec la papaïne.

Nous avons examiné l’action de la papaïne sur le produit d'hydrolyse de la gélatine, cette hydrolyse étant effectuée par la papaine même. La digestion de la gélatine se fail à 37° pendant 24 heures en Présence d'un tampon de citrate ou de phosphate m/10, de Papaine brute acüivée, de toluène et. pour certaines séries, d’un tiers du volume de glycérine. L'hydrolvse, dans ces conditions, est très avancée sans être complète. Dans différents échantillons de ce mélange, on introduit divers oxydants en proportion va-