ANDRE

riable. Comme tels, nous avons utilisé l’eau oxygénée, le ferricyanure, l’iodate, le bichromate et le persulfate de K et le perborate de Na. Les échantillons sont encore portés à 370 et le potentiel d’une électrode de platine plongeant dans les mélanges est mesuré à intervalles réguliers ; pour la plupart des oxydants, un plateau s’installe, ce qui permet de réduire le nombre des mesures de potentiel pour un échantillon et de rapporter le résultat du dosage au potentiel final. On dose l'azote formoltitrable de la gélatine avant et après digestion, celui du lysat immédiatement après introduction des oxydants

+300 +400 +500 mV +600

F1G. 33. — Variation, en fonction du potentiel d’oxydation-réduction du milieu, de l’azote formoltitrable exprimé en p. cent de l’azote libéré par digestion préalable de gélatine par la papaïne à pH 6,5.

Lots réalisés en présence de glycérine par addition d’eau oxygénée (0), de ferricyanure de K (B), d’iodate (+), de perborate (A), de bichromate (y), de persulfate + bichromate (X) ; lots sans addition d’oxydant (.).

Lots réalisés en absence de glycérine avec addition d’eau oxygénée (|), de bichromate (Y), sans addition (—-).

et après 24 heures d'action des oxydants à 379 ; on conserve également dans l’étuve des lots sans addition d’oxydants. Dans certains échantillons additionnés d’oxydants, on observe une diminution de l’azote formoltitrable traduisant une condensation des groupements aminés. Nous rapportons cette .condensation (différence de l’azote formoltitrable avant et après action des oxydants) à l’hydrolyse obtenue dans le premier temps de l'expérience (différence avant et après digestion) . 3

Dans un graphique (fig. 33), nous résumons les résultats de deux séries d'expériences effectuées l’une en présence, l’'autre en absence de glycérine, sur de la gélatine à 20% à pH 6,5

(tampon citrate). En accord avec les expériences rapportées précédemment, la digestion continue dans les lots qui, placés à l’éluve sans addition d’oxydants, ont des potentiels de platine rapportés à l’électrode à H? inférieurs à +300 mV environ ; elle se traduit par des augmentations de l’azote formoltitrable atteignant 15% de l’azote qui avait été libéré par la digestion préalable. Pour de faibles additions d’oxydants portant le potentiel jusqu'aux environs de 400 mV, la formollitration n'accuse aucune variation : la protéolyse est arrêtée. Dans les lots amenés au-dessus de +410 mV, l’azote formoltitrable diminue, quel que soit l’oxydant utilisé. La condensation augmente entre +410 et +450 mV et reste approximativement constante jusqu'à +570 mV. Ce plateau correspond à une condensaüon de 15% des groupements aminés libérés par la digestion préalable. Au-delà de +570 mV, l'effet diminue sans que nous puissions affirmer qu’il ne s’agit pas d’une action spécifique de H?0*, seul oxydant qui nous à permis d'atteindre ces potentiels sans que les quantités utilisées risquent de détruire les constituants des systèmes mis en œuvre.

Dans d’autres expériences dans lesquelles les proportions des matériaux de départ étaient différentes, le rendement de la condensation atteint des valeurs plus élevées. En partant de gélatine à 10 p. cent additionnée de tampon au citrate à pH 6, de 0,8 p. cent de papaine et de ferrocyanure un séjour de 72 heures à létuve à un potentiel de 291 mV porte l’azote formoltitrable de 6,2 à 8,0 (en em° NaOH n/25 par cm de milieu). On ajoute ensuite 8 gouttes de H?202 pour 100 cm5, ce qui fait monter le potentiel progressivement à +560 mV et, après 48 heures d’étuve, l’azote aminé retombe à 6,3 (condensation de 94% de l'azote aminé libéré dans le premier temps). Dans une expérience analogue, l’hydrolyse porte cet azote de 6,4 à 9,1 et l'addition d’oxydants le fait revenir à 7.1 (condensation de 740).

Nous avons fait un certain nombre d'expériences destinées à vérifier que des causes d'erreur éventuelles ne viennent pas annuler ou diminuer les conclusions à tirer de ces expériences. Nous avons d’abord établi que la papaine purifiée d'après WILLSTAETTER €@t GRASSMANN donne les mêmes résultats.

Le gros écueil de dosages au formol est l'existence éventuelle de processus de désamination avec production d’ammoniaque. Nous avons dosé l’ammoniaque par addition de borate de Na ou de lithine et entraînement à la vapeur d’eau dans l'appareil de PARNAS et WAGNER. Voici un exemple des résultats obtenus :

Expérience 154. — Digestion de gélatine à 5% dans un tampon

au citrate à pH 6 par 0,2 g. de papaïne p. cent en présence de ferrocyanure pendant 48 heures (— 1 temps). Ensuite, préparation de lots variés, placés encore 48 heures à l’étuve (— 2° temps).

Potentiel | N formolti- NH3 en

final trable en | NaOH n /25 en mV NaOHn /25 | pour 3 cm3 pour 3 cm Témoin glacière initial. . 1,5 0,7 A la fin de la digestion CS TEMPS) ME ere - 8,5 0,7 A la fin de l’expérience (2€ temps) :

Etuve sans addition. . .. 522 3,6 0,8 + H207 (1 goutte sur 10 0 ES PURES PC + 568 BI 0,5 Idèém-{8 gouttes)... 4e + 581 3,0 0,7 Idém(Sgouttes): 7.4 3,2 0,9 Cette expérience montre donc — et d’autres que nous citons

plus loin confirmeront — que l’ammoniaque ne varie pratiquement pas (0,7) avec des doses de H?0? qui réalisent la condensation de 3,5 à 3,0 d’azote formoltitrable à la limite supérieure de potentiel permettant cette condensation. Ce ne sont que des doses bien plus fortes (8 gouttes pour 30 cm), et pour lesquelles la condensation diminue, qui réalisent peutêtre la désamination avec production d’ammoniaque qu’on a pu signaler pour laction de H?0? sur les protides.

Nous avions à cœur de confirmer par d’autres investigations la condensation apparue dans les résultats de la formoltitration. Nous avons examiné dans ce but les précipitations par l’acide trichloracétique, par la chaleur en milieu acétique, par le sulfate d’ammoniaque et par le sulfate de magnésie, qui sont susceptibles de mettre en évidence des molécules condensées, alors que les peptides résultant de la lyse initiale sont peu ou pas précipitables.

Quelquefois, nous nous sommes contenté de noter l'intensité du trouble produit, dans d’autres cas, nous l’avons mesuré par opacimétrie ou ‘encore nous avons dosé au micro-Kjeldahl l'azote du précipité recueilli. Dans tous les cas, Ia diminution de l’azote aminé libre va de pair avec l’augmentation des corps précipitables, donc condensés. Le protocole de l'expérience 152 illustre ce que nous venons de dire.

Exp. 152. — Gélatine 5 p. cent dans tampon de phosphates à PH 6,8 + 0,4 p. cent de papaïne + ferrocyanure, 56 heures d’étuve (— 1 temps), ensuite répartition en lots, 48 heures d’étuve (— 2e temps).

N formolti- | NH3 en Trouble | Opacimétrie Potentiel! trable en | NaOH par relative final NaOH n /25 Am 2S0 4 du trouble en mV | n/25 pour pour à par MgSO 4 3 cm3 3 Cn13 saturation | à saturation Fin d’hydrolyse (1er CPS) 6,3 0,4 (+) Fin d'expérience (2e temps) :

Etuve,sans addition. | 6,3 0,5 (+) — +H202 1 gtie | + 445 5,4 0,4 se OP ES ste 606 5,2 0,45 ARE ER PP At 5,5 0,6 de

Dans une autre expérience, on dose l’azote du précipité trichloracétique de ‘35 cm$ de milieu: on trouve 80 1aR En du premier temps d’hydrolyse ; l’action de H202 pendant 48 heures à 37° amenant le potentiel à +583 mV fait monter la valeur de l’azote précipitable à 14,3.

Les résultats d’une précipitation par la chaleur peuvent être faussés en présence de ferricyanure qui agit comme déféquant bien que nous ayons tout lieu de croire que les quantités mises en jeu dans nos expériences sont trop faibles pour agir ainsi. Néanmoins, nous avons fait des essais en activant la papaïne par CNK au lieu de ferrocyanure. Le protocole 157 a trait à une telle expérience.

Expérience 157. — Même technique que pour l'expérience 154, mais activation par CNK.

N formolti- | Précipité

Potentiel trable en par la N total final cm3 NaOH | chaleur de ce en mV n/25 pour | en milieu précipité 3 CM3 acétique Fin d’hydrolyse (pre- RL ge es niertemps) CEE 6,2 0 Fin d'expérience (deuxième:temps). 1° Etuve, sans addition. . + 270 7,2 0 + H2021/1001 goutte | -L 260 6,3 0 Idem. 3 gouttes + 364 6,0 tai 1,6 H202 pure 3 gouttes + 475 6,1 ++ (+) 0,9

Nous rapportons également un essai (No 158) dans lequel la caséine a servi de “substrat et CNK d’activateur.

Expérience 158. — Caséine solubilisée à la soude, 5 p. cent, papaïne 0,4 p. cent, CNK, tampon de phosphates à pH 6,2, hydrolyse 3 jours,

puis mise en expérience en lots restant 48 heures à l’étuve.

N total N formolti- du précipité Potentiel trable en par la final cm3 NaOH | Aspect chaleur en mV n /25 pour final en milieu 3 Cm acétique Témoin glacière initial. 4,5 me Fin d’hydrolyse (pre- HHGPATETAPS)) EE à 7,45 limpide 9,1 Fin d'expérience (deuième temps). -—.

Etuve, sans addition... F60 » 5,8 + H20:1/5° 1 goutte. L 348 7,0 » 12,0 — ee 1,52 3 gouttes + 388 LL léger trouble 22,6 — 1, 1 goutte. + 374 721 limpide 19,3 — 1, 5 gouttes + 495 hs trouble 25,4

Toutes nos investigations confirment donc la condensation des produits d’hydrolyse de la gélatine par la papaïne dans un milieu oxydant à condition que le potentiel du milieu se trouve entre les limites fixées précédemment : l’azote formoltitrable baisse sans que l’ammoniaque augmente (sauf en forçant les doses de H?202 bien au-delà de la quantité utile) ; des substances précipitables par Am? SO# apparaissent alors qu’il n’y en avait plus dans l’hydrolysat et il en est de même pour la précipitation par la chaleur en milieu acétique ; les fractions précipitables par Mg SO* augmentent. Avec la caséine comme substrat, l'azote précipitable par la chaleur n’a pas complètement disparu à la fin de la lyse, maïs en présence d’oxydants, il augmente dans le rapport de 25 à 9. Notons encore que dans le deuxième temps de nos expériences (voir fig. 33 et les expériences 154, 157 et 158), la lyse peut encore continuer si l’on n’ajoute pas d’oxydant, le potentiel restant alors au-dessous d’une certaine limite.

Nous pouvons donc conclure que le même enzyme peut réaliser la condensation ou la lyse dans les mêmes conditions de concentration du substrat et des activateurs suivant les conditions de potentiel d'oxydation-réduction du milieu. Pour l’action condensante de la papaïne sur l’hydrolysat de gélatine à pH 6,5 l’optimum de potentiel se trouve entre +450 et +570 mV (entre rH 28,5 et 33,3).

UC

Expériences avec d’autres enzymes.

Nous avons fait de nombreuses expériences avec La pepsine (préparation HELLBORN-GRUEBLER purissimum, titre 1:5000). De la gélatine ou du blanc d’œuf séché ont été digérés à pH 2 environ. L’hydrolysat a été amené ensuite à différents pH et à différents potentiels et remis à l’étuve. Mais aucune condensation nette n’a été observée. Nous n'avons pas eu davantage de résultats positifs en faisant agir die la pepsine sur des peptones de WiTrE à pH 6 et à différents potentiels.

Nous avons également fait des essais de condensation avec des extraits d’Orge. Sur dix séries, trois seulement ont donné des résultats positifs. Nous citons une expérience à titre d'exemple. Un extrait d’Orge, préparé comme dans les expériences d’autolyse (voir p. 45), a été maintenu 4 jours à 370, adiditionné d’un tiers du volume de glycérine et laissé encore un jour à létuve. Nous avions, en effet, vu que la glycérine

N aminé | Variation Potentiel libre par rapport LOTS final en cm3 au témoin en mV | NaOH n/25 SA Témoin glacière. ....... 0,76 Etuve sans addition. . .. + 268 0,77 + — ‘agité Lin .uu ACTA + 272 0,74 — 8 — fermé sans air... + 108 0,76 0 Etuve, + bleu de méthylène, réduit à l’hydro- SUIS ON GR EE = D 0,75 — ] IÉtuvVeIdenm MER ne 0,75 er | Etuve, + persulfate Na, HEC US SANS + 852 0,75 SE Etuve, idem, quantité plus forte :. . 214. MR + 440 0,70 — 8 Etuve, + ferricyanure, ÉPACOR CEE E CU ere + 290 0,76 0 Etuve, idem., quantité plus fonte uenete. + 837 0,70 — 8 Etuve, + H202 neutra- HiSAe NRA. LESC L 290 0,70 A Etuve, idem, quantité DIS MOTO RER ES + 825 0,64 16

Etuve, idem, quantité plus forte ST UNE — 530 0,67 — 12

ne gène pas lhydrolyse et sa présence nous paraissait pouvoir favoriser une condensation avec élimination d’eau. Dans ces conditions, l’hydrolyse semble avoir atteint son maximum. Le milieu est ensuite réparti en lots additionnés ou non de différents réactifs et remis à l’étuve pour 24 heures avec un témoin gardé à la glacière. Le tableau de la page précédente donne le résultat de la formoltitration.

Il résulte de cette expérience qu’une condensation èst possible au-dessus de +300 mV, mais l’inconstance des résultats montre que nous n’avons pas saisi tous les facteurs nécessaires.

Nous avons faits différents essais avec des extraits d’hépatopancréas agissant sur la gélatine. Nous reproduisons le protocole 146 comme exemple d’une technique qui a donné des résultats positifs :

Expérience 146. — Un extrait glycériné d’hépatopancréas de Crabe (Carcinus maenas), agit pendant huit jours à l’étuve sur de la gélatine à 2,5% en présence de phosphates à pH 9. Le milieu est ensuite. réparti.en lots, additionné de réactifs et encore laissé trois jours à l’étuve.

Potentiel N formoltitrable | Variation LOTS final : en cm$ NaOH n /25 en en mV sur 3 cm3 D

Témoin glacière. (fin du pre-

DRE POTTER EC ARRETE a Fin d’expérience (2€ temps) :

Etuve sans addition. . ...... + 250 9,3 2700. — + ferricyanure de K.. 845 9,6 EG Idem, quantité plus forte. . + 435 9,1 0 — + perborate de Na ... — 292 8,0 1 RS EL O RP NE ANNE 5 8,2 A1 Idem, quantité plus forte... . —+ 426 #20 ns

Les potentiels élevés peuvent donc déterminer une condensation qui n’existe pas aux potentiels bas. Les mêmes séries réalisées à pH plus bas donnent des résultats négatifs.

La paroi musculaire de lArénicole a été utilisée dans sept séries d'expériences réalisant des conditions variées. L’hydrolyse se fait à pH 7 pendant 3-4 jours. Ensuite, le pH est ajusté à 7,0, 6,0 ou 5,5 et dis lots sont confectionnés par adgition de divers réactifs oxydants ou réducteurs. On conserve encore pendant 48 heures et on dose lazote formoltitrable de même qu’on mesure le potentiel de platine. Dans les lots amenés à pH 7,0 ou 6,0, nous n'avons eu aucun résultat positif de condensation. Dans les lots à pH 5,5 par contre, on observe des variations de N formoltitrable changeant de signe suivant le potentiel. Les lots sans addition se placent près