NS

de +350 mV. Le dosage montre que les groupements aminés libres s’y maintiennent au niveau atteint à la fin du premier temps d’hydrolyse, ils peuvent encore augmenter dans les lots réduits. Aux environs de +450 mV on note des diminutions notables, mais aussi quelques augmentations (à la limite die la précision de dosage: 1 à 2%). Entre +500 et 600 mV, tous les lots présentent une diminution de l'azote aminé libre atteignant 70. Au-delà de 600 mV, les valeurs semblent se maintenir au niveau de départ de la fin de l’hydrolyse.

Quelques essais avec le muscle de Tanche ont abouti à des condensations que nous n'avons toutefois pas réussi à reproduire dans toutes les séries. Aux environs de +500 mV, la condensation atteint 6 p. cent, elle ne se produit jamais aux potentiels plus bas. Nous donnons un protocole à l'appui (exp. lat

Expérience 12. — Muscle de poisson d’eau douce (Tanche).

Purée amenée à pH 5,57, 6 jours à 370, addition de 1 /10e de volume de purée fraîche, 4 jours à 370 (fin du 17 temps), répartition en lots, 4 jours d’étuve.

N formoltitrable en Variation Potentiel | em3 NaOH par LOTS final n /25 pour rapport en mV 3 cm3 au témoin de milieu (Es EU À Fin du 17 temps. .…. .... 6,25 Fin du 2€ temps :

Etuve, sans addition. .. + 306 6,37 + 2 — fermé sans air ... — ]30 6,48 + Etuve + bleu de méthy- | lène, fermé sans air. .. — 30 6,38 + 2 Etuve + bleu de méthy- Énéréit. Tee — 66 6,68 Sd LP Lt Se UC TS 6,40 +2 Etuve, + ascorbate Na. 5 6,45 + 8 Et. + H2021 /10€ goutte + 305 6,26 2ENEVA gouttes NES 6,36 EE

D — 1/2 goutte. . + 490 5,93 — — Kpoutte + 527 5,98 4

Nous attirons à ce sujet l’attention sur quelques points de nos expériences d’autolyse consignées dans la figure 18. L’autolyse du muscle de Tanche baissant avec l’élévation de potentiel s’annule aux environs de +500 mV. Mais dans les lots où le potentiel dépasse cette valeur, on trouve une condensation qui se fait donc, même en l’absence d’hydrolyse préalable. Elle se fait peut-être sur des constituants protidiques plus lourds que dans l’expérience ci-dessus, mais dans les mêmes conditions de potentiel.

Nous relevons également une technique qui nous a donné des résultats positifs avec la pulpe de rate (voir un exemple : Expr196):

Expérience 198. -— De la pulpe de rate de veau est préparée comme dans les expériences de lyse (p. 59) et amenée à pH 4,9. Après 15 jours de séjour à l’étuve, on ajoute 1/10€ de volume de pulpe ayant subi un jour d’hydrolyse (en vue de renouveler le stock d’enzymes) (fin du 1e7 temps). On amène à pH 6 et on répartit en lots qu’on maintient 24 heures à l’étuve.

N formoltitrable en | Variation Potentiel | cm3 NaOH par final n /25 pour rapport LOTS en mV 1 cm3 au témoin de milieu en % Fin de l’hydrolyse (premier temps) :

Conservé glacière avant ajustement du pH.... 8,02 Idem., après ajustement Pédio en 2 8,07 Fin du 2€ temps :

SANS AddiTON rer ee — 812 7,80 — 8 + ferricyanure de K. … + 816 7,95 == il + persulfate de Na..... + 315 7,60 — 5 Idem., quantité plus forte | + 550 (1) 7,62 — 5 IL H202 (2).....: A 11500 7,72 ro + ferricyanure et H202.. + 421 7,33 — 9

(1) Dans ce lot le pH est descendu à 5,2. (2) H202 est partiellement décomposé dès l’addition.

Il en résulte qu’il doit y avoir à pH 6 un optimum de condensation au-dessus de +421 mV.

Avec le cristallin de Bœuf et de veau, 12 séries d’expériences ont été faites en vue d’une condensation. La technique est la suivante: les cristallins sont préparés comme pour les expériences d’hydrolyse ; la suspension amenée à pH 6 et addi-

ULOE

tionnée de toluène est maintenue à l’étuve à 38° pendant 4 à 8 jours. Dans ces conditions, lazote formoltitrable augmente dans des proportions variables d’une expérience à l’autre, de moitié environ. La digestion se trouve pratiquement arrêtée au bout de quelques jours, mais il ne s’agit pas d’une destruction des enzymes, car en plaçant des échantillons prélevés après 9 jours dans des conditions plus favorables, c’est-à-dire en abaissant le potentiel, la digestion reprend. Âu cours du séjour à l’étuve, il se forme quelquefois un précipité: dans ce cas, nous décantons ou filtrons. Le liquide obtenu est amené à pH 7,5 à 8 et réparti en plusieurs lots. Un lot est placé à la glacière comme témoin, d’autres, additionnés de divers réactifs, sont placés à létuve pour 48 heures. Ensuite, on y mesure le potentiel et on dose l'azote aminé. Dans les lots à potentiel bas la digestion continue ; dans le lot placé à l’étuve sans addition il n’y a le plus souvent pas de variation par rapport au témoin refroidi. Dans les lots contenant des oxydants, on observe avec le veau (et aussi le Mouton) des troubles allant jusqu'à la prise en masse caséeuse. Avec du cristallin .de Bœuf, nous n'avons pas observé de phénomène analogue. Les oxydants employés sont leau oxygénée neutralisée, Je ferricyanure de K et lhypochlorite de Na en solution pure très diluée. Les concentrations intéressantes sont de l’ordre de 1-2. gouttes de H202 à 100 volumes pour 5 cm? de milieu, de 0,1-0,5 mg de ferricyanure et de 1-3 gouttes d’une solution d’hypochlorite de 100 chlorométriques diluée au 25e. On note des diminutions de l'azote formoltitrable atteignant 16 p. cent de la valeur de départ après hydrolÿyse. Quant aux potentiels mesurés, voici comment se répartissent les lots dans lesquels on a observé des diminutions indiscutables de l’azote formoltitrable (dépassant 6 p. cent) (ig. 34). Il n’y en a pas dans la

-100 (9) +200 400 mV

F1G. 34. — Variation, en fonction du potentiel d’oxydation-réduction du milieu de l’azote formoltitrable d’une suspension de matière cristallinienne, en p. cent de la valeur atteinte par une autolyse préalable.

Lots réalisés sans addition BB, lots réalisés par addition d’eau oxygénée 0, de ferricyanure +,

AU

zone des potentiels bas. Tous les résultats nets correspondent à des potentiels supérieurs à +200 mV. Dans la zone autour de +300 mV, 14 p. cent des expériences montrent des condensations dépassant 8 p. cent de l’azote aminé ; autour de +490 mV, on trouve ce résultat dans 40 p. cent des lots, autour de +500 mV dans 36 p. cent des lots. Autour de +600 mV, on n’observe plus de condensation. Ni dans cette statistique ni dans la fig. 34 nous n'avons pu tenir compte des lots réalisés avec de Phypochlorite en raison de l'instabilité du potentiel; on y observe cependant des condensations du même ordre de grandeur.

Avec le corps vitré, 14 séries comprenant 114 lots ont été expérimentées. La technique est semblable à celle employée avec le cristallin: 4 à 12 jours de digestion de vitrés filtrés à létuve à 38° après établissement d’un pH de 6,5 environ et en présence de toluène. A la fin de cette digestion, le liquide clair est amené à pH 7,5 à 8 et réparti en lots additionnés ou non de réactifs divers. Les quanutés d’oxydants utiles sont plus faibles que pour le cristallin. Après 48 heures de séjour à Pétuve, on mesure les potentiels et on dose l’azote aminé. Comme pour le cristallin, il peut encore augmenter dans les lots amenés à des potentiels bas, il ne change pas aux environs de +206 mV ; aux environs de +400 à +500 mV, on trouve dans sensiblement un tiers des lots une condensation dépassant 8 p. cent de l'azote aminé initial (fig. 35). La plus forte con-

100 © +200 77400 wW

F1G. 35. — Variation ,en fonction du potentiel d’oxydation-réduction du milieu, de l’azote formoltitrable de corps vitré, en p. cent de la valeur atteinte par une autolyse préalable.

Lots réalisés sans addition Æ, lots réalisés par addition d’eau oxygénée 0, de ferricyanure +, de réducteurs A.

densation observée est de 24 p. cent à +433 mV. Dans quelques échantillons ayant été placés à l'étuve sans addition d'oxy-

Tir

dants, nous avons observé des condensations nettes el ceci surtout quand Palcalinisation faite après la lyse a été relativement plus importante. Il se pourrait donc que la variation de pH à elle seule pût agir comme les oxydants (notons que le rH monte dans les deux cas). Dans les conditions de nos expériences, le processus de condensation n'est pas terminé au boul de 48 heures, délai habituel de nos dosages. Nous avons suivi des lots au-delà de ce terme et nous avons constaté qu'aussi bien avec le ferricyanure qu'avec H?0? et même par la simple alcalinisation la condensation continue à évoluer, de même d’ailleurs que la lyse, dans les lots à potentiel bas. Il ne s’agit donc pas d’un équilibre rapidement atteint, mais d’une lente action enzymatique.

Nous avons fait des expériences avec une catepsine extraite du joie de Bœuf. Ce matériel paraît à première vue favorable : d’après RosENBOHM, le tissu hépatique est un de ceux qui s’autolysent le plus facilement, Des essais d'alimentation de Rats avec des acides aminés contenant du deutérium ont montré à UssiNG qu'en 3 jours, 10 p. cent des protéines du foie sont néoformés alors que dans d’autres tissus, ce taux atteint au plus 2,5 p. cent. Les échanges azotés sont donc intenses dans le foie. L'enzyme est en plus très résistant (EDER, BRADLEY el BELFER). Pour l’autolyse, on a signalé l'activation par le chlorure manganeux (BRADLEY et MorsE) et par les sels ferreux, alors que les chlorures cuivriques et mercuriques inhibent (STERN). Le manque d'oxygène accélère l’autolyse, aération la ralentit (LAQuEUR). L’iodate (Luck), le bromate et le persulfate (JOERGENSEN) ont également une action inhibitrice ; la cystéine active considérablement (ANSON). Ces données paraissent bien relever d’une intervention du potentiel d’oxydation-réduction : la catepsine est activée par les réducteurs et inhibée par les oxydants. Pour nos essais de synthèse nous nous sommes écarté de la technique habituelle: au lieu d'opérer sur un extrait aqueux total, nous avons cherché à isoler la catepsine et les protides de bas poids moléculaire dans l'espoir de réaliser une Synthèse dans un milieu moins complexe. On broie au sable 75 8. de foie de Bœuf, on délaie avec 100 cm° d’eau et, après üne heure de macéralion, on porte rapidement à 70° et on refroidit immédiatement avec de la glace. On se débarrasse par centrifugation des protéines précipitées. Le liquide obtenu est additionné d’acélone, filtré et réduit dans le vide jusqu'à disparition de l’acétone. On oblient ainsi un liquide à pH 6,8 dont l'azote formoltitrable est contrôlé au cours d’un séjour à l’éluve après établissement de potentiels d’oxydation-réduction variables. Nous mavons pas observé de condensation nette. De nombreuses courbes de neu-

tralisation effectuées avant et après séjour à l'étuve (voir un exemple, fig. 2) montrent que les caractéristiques physicochimiques sont modifiées par ce traitement, sans que cependant une diminution appréciable de la bande de pouvoir tampon décalée par l’action du formol (effet tampon des groupements aminés libres) accuse une condensation. Nous attribuons cet échec au fait que la technique suivie supprime les cosub- Strats, coferments et certains activateurs dont nous avons suggéré l'importance et qui se trouvent éventuellement dans un extrait aqueux total.

Discussion

Point de vue physico-chimique.

Résumons les résultats que nous venons d'exposer : les condensations de protides sont possibles par renversement du sens de l’action enzymatique correspondant à la protéolyse et ceci par le seul changement du pH et du potentiel d'oxydationréduction du milieu. Mais cette condensation ne se retrouve pas à coup sûr dans des expériences conduites d’une façon aussi semblable que possible. D'autres facteurs (massivité, structure du milieu, etc.) que nous n'avons pas éludiés peuvent donc éventuellement intervenir. Toujours est-il que la condensation peut être réalisée à l’abri des causes d'erreur éventuelles que nous avons spécialement examinées et éliminées dans lexemple de la papaine. Dans tous les cas, un potentiel d’oxydation-réduction élevé semble nécessaire pour que la diminution des groupements aminés libres (ainsi que l’augmentation de l’azote précipitable par divers réactifs) traduise une condensation de protides en plus grosses molécules par formation de liaisons peptidiques.

Que signifient les condensations que nous avons observées ? Représentent-elles réellement léquivalent des synthèses dans organisme vivant? Rien n’est moins certain. ALCOCK n’est pas convaincu que la synthèse des protéines in vivo se fasse par condensation d'acides aminés ; dans ce cas, la production de plastéines et les phénomènes que nous avons étudiés seraient donc très différents de ce qui se passe dans l’organisme. Même en allant moins loin, il suffit d'admettre la StFüctire en cyclol des protéines natives (voir LanNGmuIR et ‘WRINCH) pour conclure que la condensation artificielle des acides aminés aboutissant vraisemblablement à des chaînes polypeptidiques ne réalisera pas l’édifice de la molécule naturelle dont les voies de synthèse seraient d’ailleurs inconnues. C’est bien en raison de ces réserves que nous parlons d’une condensa-