TECHNIQUE

Choix des ferments.

Etant donné la répartition absolument générale des protéinases intracellulaires dans les règnes végétal et animal nous avons choisi les systèmes étudiés et notamment leur provenance d’après les considérations suivantes : nous nous sommes adressé à des tissus qui présentent par leur physiologie normale des synthèses et éventuellement des lyses actives de matière azotée. Dans cette idée, nous avons étudié les graines végétales au sein desquelles se produisent des remaniements importants des protéines au cours de la germination. Nous avons utilisé des tissus de l’Arénicole qui présente, d’une part, une fonte physiologique en hiver et, d'autre part, une croissance très rapide si les conditions alimentaires sont favorables. Les Actinies peuvent également présenter des fontes tissulaires ou au contraire une croissance rapide. Pour les tissus d'animaux supérieurs, on sait que dans la rate s’opèrent à la fois des destructions et des proliférations cellulaires s’accompagnant probablement de remaniements de protéines dans le sens de la lyse et de la synthèse ; c’est ce qui nous a incité à étendre nos expériences à la pulpe de rate. En général, nous nous sommes adressé de préférence à des animaux jeunes, les transformations de la matière azotée y étant plus intenses que chez les adultes.

Un autre point de vue qui a dirigé notre choix était le souci d'opérer sur un matériel aussi homogène que possible. La paroi musculaire de l’Arénicole, les tissus de l’Actinie ne sont guère favorables en ce sens. Par contre, le cristallin privé de sa capsule, le corps vitré de l’œil ont été choisis en raison de leur homogénéité. Le muscle de poisson, constitué presque exclusivement par des fibres musculaires striées, peut encore être considéré comme un matériel favorable.

RSR

Voici d’ailleurs la liste des matériaux ayant fourni les enzymes dans nos expériences. Du règne végétal proviennent la papaine et différentes graines, dont seule l’Orge a été étudiée à fond. Les animaux inférieurs ont fourni la paroi ectodermique d’une Actlinie (Bunodes equina) et la paroi musculaire de l’Arénicole. Le muscle de Poissons représente les Vertébrés poikilothermes. Enfin, le veau nous a fourni le cristallin, le corps vitré, la pulpe de rate et le foie. A titre de comparaison avec les ferments digestifs, nous avons étudié la pepsine.

Sauf en ce qui concerne la papaine et la pepsine pour lesquelles nous avons utilisé des préparalions commerciales ayant déjà subi un début de purification nous avons évité de purifier, voire d'extraire les protéinases et cela pour plusieurs raisons. Pour chercher à obtenir un travail des enzymes analogue à celui qui se fait dans l'organisme, il convenait de modifier aussi peu que possible les conditions de leur fonctionnement. Nous nous sommes efforcé de conserver l’ensemble du complexe enzymatique en le plaçant dans un milieu suffisamment homogène pour que les mesures physico-chimiques y aient un sens et pour que l'addition de réactifs divers n'y pose pas un problème de répartition entre plusieurs phases ou d’équilibre de membrane. :

Les essais de purification des ferments par les méthodes courantes risquent de modifier leurs propriétés, même si leur activité est conservée. Peut-être s’agit-il d’un début de dénaturalion analogue à celle qu'on a bien étudiée pour différentes protéines et qui altère leurs propriétés sans cependant leur enlever certaines de leurs caractéristiques essentielles, En tout cas, la littérature nous fournit des exemples de modifications des propriétés de ferments par des essais de purification ou autres interventions qui, cependant, n’en-. tament pas leur activité. Ainsi WILLSTAETTER et WALDp- SCHMIDT-LEITZ étudient une lipase du ricin dont l'action a un optimum à pH 5 avec une décroissance très rapide vers les pH élevés au point qu'à pH 6,8 l’activité est nulle ; après passage par un milieu acidifié par HCI, l’activité est maxima à pH 6,8 et très réduite aux pH plus bas, par exemple au liers à pH 4,7. WILLSTAETTER, GRASER et KunN montrent que la purification de la saccharase la rend plus électropositive sans Cependant modifier le pH optimum. La pepsine brute est un ampholyte avec le point isoélectrique à pH 2 (Micnagrts et DAVIDSOHN) ; une préparation purifiée est par contre continuellement négative même dans des milieux très acides (PEKEL- HARING et RINGER). Pour éviter qu'une purification ou sim-: ple extraction des enzymes ne modifie éventuellement les pro-

priélés que nous nous proposions d'étudier, nous avons donc utilisé les préparations brutes « totales ».

Non seulement des caractéristiques physico-chimiques, mais encore le comportement biologique des enzymes peut être modifié par leur purification. Ainsi l’invertase est inhibée par les narcotiques dans la cellule vivante ainsi que dans un extrait aqueux de tissus végétaux. SCHUERMEYER a montré que l’invertase purifiée est insensible à l’action des narcotiques, : mais qu’elle retrouve sa sensibilité si lon ajoute des protéines : au milieu. OPparIN a insisté longuement sur la portée générale de telles constatations. à |

Le substrat.

Le souci de conserver le mieux possible à l’enzyme étudié les conditions de son fonctionnement in vivo nous a également imposé le choix du substrat. Il nous a semblé que le substratum normal de l’enzyme, c’est-à-dire l’ensemble des protides au contact desquels il se trouve à l’origine dans le lissu vivant, devait être celui qui lui permettrait d'exercer son aclivité dans les conditions les plus physiologiques et peut-être aussi de l’exercer avec un maximum d'efficacité. Différentes recherches confirment cette dernière hypothèse. FIisHER fait agir des extraits de plantes séchées sur diverses protéines ; l’activité la plus forte s’observe quand la protéinase et la protéine proviennent de la même espèce végétale (action d’un extrait de poudre de Pois sur la légumine). RoNponr préconise l’autoprotéolyse comme meilleur procédé d'investigation des ferments protéolytiques tissulaires. GOLDSTEIN montre que la catepsine digère mieux les protéines provenant de son tissu d'origine (foie, rein, muscle) que la gélatine, par exemple. GOLDSTEIN et GINTSBOURG signalent que les protéines de l’œuf : de Poule sont mieux digérées par la catepsine extraite de l’embryon de poulet que par des catepsines extraites de tissus de Mammifères.

Fournir à chaque enzyme son substratum naturel extrait et purifié ne semble pas encore suffisant pour assurer les meilleures conditions de fonctionnement. Soustraire au contraire aussi peu que possible du milieu naturel revient à conserver éventuellement des coenzymes, des cosubstrats, des activateurs, etc. BEHRENS et BERGMANN ont en effet montré que l’action de la papaïne sur la glycine-anilide ou la glycyl-l-leucine est plus efficace en présence d’un troisième corps, dit cosub-

Son

strat parce qu'il sert de substrat intermédiaire nécessaire pour l'attaque du substrat même tout en se retrouvant à peu près intact à la fin du processus. Il peut même y avoir intérêt à laisser subsister des actions enzymatiques concomitantes ne portant pas sur les protides: RUBEL montre sur des tranches de tissus in vitro que la protéolyse est plus active dans des conditions telles qu’une glycolyse énergique peut se poursuivre ; la protéolyse dans des tranches de foie, de cortico-surrénale et de tumeurs varie du {simple au double suivant qu’on: inhibe la glycolyse par FNa ou qu'on l’entretient par des additions de glucose au milieu. En plus les extraits bruts sur lesquels nous opérons doivent contenir des stabilisateurs du potentiel d’oxydation-réduction qui seront précieux pour empêcher de trop fortes variations de potentiel en cours d’expérience. Ces variations ne semblent en effet pas toujours attribuables à des réactions secondaires de corps qu’une purification judicieuse éliminerait, mais souvent à des réactions du substralum même au cours de la lyse.

Dans le but de n’enlever au milieu naturel rien qui pourrait favoriser l’action des protéinases par des mécanismes généralement mal connus nous avons donc éludié l’autolyse protéique dans des extraits aqueux totaux de différents tissus sans aucun fraclionnement. Si, à la suite, nous parlons des « systémes proléasiques » ou encore des « systèmes protéolytiques » de l’Orge, du foie, de la pulpe de rate, etc..{ nous entendons désigner par là l’ensemble des protéinases et s’il y a lieu des polypeptidases et autres ferments protidasiques avec leurs coferments éventuels, d’une part, des protides et surtout des protéines normalement présents dans le tissu d’origine des ferments accompagnés des cosubstrats éventuels, d’autre part, bref le milieu cellulaire aussi complet que possible. Il est évident que dans un tel milieu d’autres systèmes enzymatiques que celui que nous envisageons existent et exerceront leur activité simultanément. Dans certains cas, cetle activité peut être génante : nous avons dû abandonner les expériences sur certaines graines en raison de lacidification trop forte produite au cours de lV’autolyse par des réactions fermentaires concémitantes et qui faisail trop varier les conditions physico-chimiques du milieu pour la protéolyse au cours même d’une expérience. Dans d’autres cas, nous avons, au contraire, été placé dans des conditions presqu’idéales de pureté du système protéasique employé. Nous voulons parler du cristallin et du corps vitré. I s’agit là de systèmes déjà presqu'homogènes au départ, ne présentant pas d’inclusion figurée et ne contenant que fort peu de substances en dehors des protéines. On imagine difficilement des préparations plus parfaites dans lesquelles figurent,