ES UNE

d'une part, tous les activateurs, etc., d'autre part, un minimum de corps étrangers, indifférents ou nuisibles, au processus étudié.

Pour la pepsine et la papaïine, nous avons fait abstraction du principe de faire agir chaque enzyme sur son substratum naturel complet. La pepsine, en effet, n’agit pas, normalement, dans un milieu intracellulaire bien défini et constant, mais au contraire sur n'importe quelle protéine. Elle ne se trouve donc pas dans des conditions anormales en agissant sur la gélatine. Pour la papaïne, son rôle dans le fruit de Carica papaya semble peu connu et nous ignorons même si elle y présente normalement une certaine activité. En plus, nous ne disposions pas de fruits, mais seulement de préparations commerciales de papaine. Comme, d'autre part, les conditions de son. activation sont bien connues, nous avons cru pouvoir l'utiliser avec de la gélatine comme substrat et les résultats obtenus ont jus- Ufié ce choix.

Technique de l’autolyse.

Voici en gros la technique que nous avons utilisée. Le tissu frais est broyé aussi finement que possible (éventuellement avec du sable), mis en suspension dans 4 à 10 volumes de sérum physiologique, centrifugé et additionné de toluène. Dans une première série d'expériences. on délermine Toptimum de pH de la protéolyse qui s'effectue à l’étuve à 370-400. Les échantillons sont amenés au pH voulu à laide de Pélectrode à antimoine montée en différentiel (VLÈS). L’intensité de la protéolyse est appréciée par la formoltitration des groupements -NH? libérés. Une fois l’optimum de pH établi, nous amenons systématiquement les extraits de tissus à ce pH pour étudier l'influence du potentiel d’oxydation-réduction. Si la zone de l’activité de l’enzyme le permet, des séries parallèles sont faites à des pH voisins.

Différents points de notre technique d’autolyse — très simple — appellent des commentaires : le broyage simple au mortier des tissus mis en expérience n’aboutit pas à une suspension bien homogène. Nous avions indiqué avec VEL- LINGER une technique de broyage tissulaire, rapide et très poussé, qui consiste à congeler le tissu à la neige carbonique et à le réduire en une poudre fine dans un mortier également refroidi par la détente de gaz carbonique li-

«quéfié. Les travaux de F.-F. Norp nous ont empêché d’utiliser cette technique pourtant commode ; cet auteur a en effet décrit sous le vocable de la cryolyse toute une série de modifications de systèmes complexes, enzymatiques entre autres, par le froid. La congélation risquait par conséquent d’altérer nos systèmes protéasiques ce que nous voulions éviter dans la mesure du possible.

Nos manipulations n'ayant malheureusement pas pu être faites à l'abri d’une infection éventuelle, nous avons été obligé d'utiliser des antiseptiques. Les extraits tels que nous les porlons à l’étuve sont d'excellents milieux de culture et la moindre infection se traduit à la sortie de l’étuve par une décomposition complète. Du point de vue de la protéolyse, l’action des ferments microbiens produit un effet au moins dix fois plus fort que l’autolyse tissulaire aseptique ; on ne risque donc pas de confondre l’une avec l’autre, d'autant moins que l’infection, si elle se fait, est toujours massive. Nous avons vérifié plusieurs fois par des contrôles bactériologiques que, sauf les Cas d’une telle infection massive, nos milieux sont stériles à la sortie de l’étuve. Les antiseptiques qui semblent le moins gêner la protéolyse sont le toluène et le thymol à saturation, FNa à 2% (EFERONT) et le chloroforme. Nous avons le plus souvent ulilisé le toluène à saturation qui a l'avantage de ne pas exiger de dosage et nous a donné satisfaction à condiüon de l’introduire précocement dans un extrait préparé proprement el de veiller à ce que l'étanchéité du bouchonnage des échantillons empêche son évaporation à l’étuve. Le chloroforme et le thymol que nous avons utilisés dans certains cas se comportent comme le toluène. Nous avons évité le fluorure qui inhibe certaines réactions fermentaires dont l’accomplissement est peut-être utile pour les phénomènes que nous étudions.

On à bien signalé que les antiseptiques altèrent les enzymes protéolyliques, mais, notamment pour le toluène, EFFRONT a montré que cette action ést d'autant moins prononcée que la préparation enzymatique est moins pure et plus concentrée. Notre technique nous met donc à l’abri de cet inconvénient.

Les’ autolyses ont été effectuées le plus souvent à 370, bien que loplimum action de la plupart des systèmes protéolytiques ne soit atteint qu’à des températures notablement plus élevées (FIRDMAN). Mais, à ces températures, la destruction spontanée des enzymes semble s’accentuer encore ‘ plus que leur activité ; nous avions à cœur d'éviter cette destruction élant donné que nous cherchions à la fin de l’autolyse la réversibilité éventuelle du processus et qu'il fallait par conséquent que la lyse s’achevât autant que possible en présence du ferment intact.

Mesure de l’autolyse.

La méthode choisie pour l'étude quantitative de la protéolyse devait nous permettre de mesurer avec une même précision la scission des molécules de protéine et la condensation éventuelle des fragments obtenus. Il nous a semblé que le dosage des groupements -NH? ou -CO2H libérés ou réengagés dans une structure moléculaire offrait dans ce sens plus de garantie que ŸYétude d’une propriété physique telle que la précipitabilité par des réactifs déterminés. Le dosage de l’azote aminé par la formoltitration nous a paru un procédé de choix. “Nous donnons un tableau emprunté à EFFRONT qui montre que la formoltitration permet de suivre les progrès d’une digestion aussi bien que les autres procédés figurant dans ce tableau ; elle à sur eux l’avantage de la rapidité.

TABLEAU I (d’après EFFRONT)

Digestion d’ovalbumine à 2% par la trypsine en présence ‘de toluène.

Durée SD | 2 es RAM STE te | 2 les)

N précipitable par ZnSO +. GO NNLG AI 00 2007 501 4221212:9 6:91 6,9 N précipité par l'acide phosphotungstique.....|17,6 |26,9 | 28,5 | 21,7 | 19,3 | 20,4 |21,5 | 24,0 | 24,1 N non précipité par l’acide phosphotungstique....... 22,8 | 56,7 | 56,7 | 59,1 | 63,2 | 65,4 | 65,6 | 69,1 | 69,0 N aminé dosé par formol- ÉD IONM du eee Lien 11,1 |21,3 |26,8 | 27,7 | 29,0 | 34,6 | 34,8 | 41,9 | 41,5 17,0 |15,5 | 12,8 | 10,8 | 3,2 | 3,0

N précipité par le tanin.... | 52,8 |10,1 |10,7

Dans des recherches plus modernes on a pu constater que la quantité des liaisons peptidiques scindées au cours d’une digestion est à la fois caractéristique de l'intensité et de la nature de l’action fermentaire étudiée (MILLER).

Le seul dosage des groupements aminés comporte cependant une cause d'erreur très importante provenant d’une désamination éventuelle (TERROINE et LAURESCO, NEBER). Pour contrôler qu’une telle désamination ne fausse pas nos résultats nous avons pratiqué dans certaines séries d'expériences des dosages d’ammoniaque, des dosages dazote précipilable par