LANDES

l'acide trichloracétique ou’ encore des titrations des groupements CO?H à la thymolsulphonephtaléine. Nous signalerons les résultats à l’endroit voulu: ils ne comportent aucune indication d'erreurs entraînées par la formoltitration.

I faut cependant préciser un point important: la formoltitration est-elle encore correcte en milieu complexe ? Le dosage des acides aminés par formoltitration (SOERENSEN) est basé sur linfluence qu’exerce le formol sur la dissociation électrolytique de ces acides. Il apparaît qu’à la suite du bloquage du groupement aminé par le formol le caractère acide s’accentue et devient ainsi plus accessible à un dosage. La méthode de SOERENSEN consiste à amener la solution à la neutralité au tournesol et à ajouter du formol, neutralisé préalablement. A la suite de cette addition la solution s’acidifie et on titre à la soude jusqu’au virage franc de la phénolphtaléine.

Alanine

Alanine + formol

ENTRE 4 CÉRÉSNTTURE : 8 TJ pA‘

FiG. 1. — Courbes de pouvoir tampon, dans l’échelle des PH, d’une solution d’alanine pure m /10 (+) ou additionnée de formol (o).

Dans la pratique courante on utilise celle-ci seule: on l'amène ü abord au début du virage et ensuite à la fin du virage après addition de formol. Quoiqu'il en soit, il Y a toujours un intervalle de pH entre les points finaux de la première el de la deuxième neutralisation et ce fait pourra donner lieu à des causes d'erreur comme nous allons le montrer de suite.

Le mécanisme de la formoltitration s'explique par la courbe de neutralisation d'acides aminés avant et après addition de formol. Des études de ce genre ont déjà été faites. notamment par HARRIS, qui a montré l’abaissement progressif de la constante de dissociation acide pk, de l'acide. Nous avons fait à l’antimoine les courbes de neutralisation d’une solution d'alanine contenant 225 mg dans 24 cm d’eau distillée avant et après addition de formol. Les courbes de pouvoir tampon (fig. 1) dérivées de ces courbes de neulralisation montrent

Sons

que l’alanine présente vers pH 10 un maximum de pouvoir tampon qui correspond à la dissociation du groupement acide (pk=—9,7, Harris). Après addition de formol cette bande de pouvoir tampon est déplacée vers les pH bas ; cet abaissement du pk, des acides aminés en présence de formol a élé vu et étudié par de nombreux auteurs (Harris; DunN et WEINER ; SCHMIDT (1). Dans notre cas le sommet correspondant au pk vient se placer à pH 7,4. Dans la formoltitration courante on amène donc la solution aux abords de la zone de pouvoir tampon. Par suite de Pacidification et du déplacement simultané de la zone de pouvoir tampon consécutifs à l’addition du formol, on se trouve encore à la marge de la zone de pouvoir tampon qui représente les groupements acides équivalents aux groupements aminés primitivement libres et bloqués par le formol qu'il s’agit de doser. En alcalinisant jusqu’à pH 9 à 10 on aura correctement mesuré le pouvoir tampor en question.

Pour que le dosage puisse se faire avec précision, il faut que la solution ne présente pas un pouvoir tampon supplémentaire notable dans la région comprise entre les deux virages utilisés (pH 7 et 9, par exemple). Ce pouvoir tampon se superposerail en effet à celui résultant du déplacement de la bande du groupement acide ; il serait dosé avec celui-ci et fausserait par excès les résultats de la formoltitration.

Or dans les milieux complexes (extraits de tissus, par exemple) dans lesquels on effectue couramment la formoltitration et que nous avons utilisés dans nos expériences, cette condition (absence de pouvoir tampon supplémentaire) mest pas réalisée. On trouvera dans la fig. 2 un exemple de courbes de pouvoir tampon d’un extrait aqueux fractionné de foie dans laquelle apparaît un pouvoir tampon assez considérable du milieu initial dans toute la gamme des pH et aussi aux environs de la neutralité. Les courbes se relèvent autour de pH 9 à 10 comme on a l’habitude de le voir dans les milieux protidiques. A la suite de laddition de formol, ce maximum de pouvoir tampon se déplace pour se situer entre pH 6 et 7. Dans de nombreux extraits que nous avons ainsi étudiés à l’aide de courbes de neutralisation nous avons observé des modifications par le formol comparables à celles que nous venons de décrire dans la solution pure d’un acide aminé ; cependant la bande de pouvoir tampon qui nous intéresse se

(1) Postérieurement à nos expériences, DUBUISSON à étudié la courbe de neutralisation de la myosine avant et après addition de formol. Le résumé de son travail donné dans le Bulletin Analytique, qui nous a été seul accessible, nous fait supposer que ses résultats sont analogues aux nôtres.

M ri ee

dégage moins nettement. Les points initiaux et finaux de la ütration sont moins définis. Il en résulte que la formoltitraltion aura une précision moindre que dans les solutions d'acides aminés purs. En plus le pouvoir tampon existant aux environs de pH 7 à 8 avant addition de formol introduit une cause d'erreur en ce sens qu’il se superpose à celui qu’on se propose de doser. Nous en concluons que les valeurs absolue: de formoltitration sont entachées d'erreur et nous

Se.

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2 Ne 15 EE RENNES NE

| F1G. 2. — Courbes de pouvoir tampon d’extraits de foie purs (en haut) ou additionnés de formol (en bas).

X — témoin, . = lot expérimenté (voir p'o12)

ne baserons pas de raisonnement sur elles. Cependant nos courbes montrent que ce pouvoir tampon des environs de la neulralité ne se modifie pas sensiblement au cours de nos expériences Gl doit être dû à des substances comme des électrolytes qui ne subissent pas de digestion) ; les valeurs relalives de nos titrations, les différences entre les dosages avant et après digestion, ne sont donc pas faussées et c’est de cellesci que nous ferons état.

Store.

On peut augmenter la fidélité de la formoltitration sans cependant modifier la valeur absolue des dosages effectués en remplaçant les indicateurs par la mesure des “pH à l’antimoine (A et J. RocnE). Le dosage peut ainsi être effectué avec grande précision dans des milieux troubles dans lesquels

avant 10 Foie | | 4 de dig Æstion &ô

V4 /# 7%, 3 x ne , 2 PACL Vo O 1 NaOH io 2 cm3 Etc. 3. — Courbes de neutralisation d’un extrait de foie de veau avant auto-

lyse (.) et après 3 heures (X) et 7 heures (|) d’autolyse. En abscisses les quantités d’acide et de soude ajoutées, en ordonnées le pH.

l'appréciation du virage des indicateurs est délicate. A. et J. Rocng titrent en amenant le milieu d’abord à pH 7 et ensuite, après addition de formol, à pH 9. Dans les milieux complexes que nous avons utilisés et surtout en raison du pouvoir

tampon existant entre ces deux limites de pH nous avons cru préférable de partir de pH 8 au lieu de 7. Dans ces conditions, l'accord avec le dosage aux indicateurs était saüisfaisant.

Etant donné le caractère purement relatif des résultats que nous tirons de la formollitration nous nous sommes demandé si le dosage direct des valences acides titrables entre pH 8 et 10,5 ne pouvait pas fournir un renseignement équivalent sur la quantité des acides aminés présents, la plupart des pK, se plaçant dans cette région. Les résultats obtenus dans quelques essais ne se montrent pas supérieurs à ceux obtenus à la formollitration.

Dans le même ordre d'idées, on peut essayer de pousser plus avant l’analyse des milieux en cherchant à séparer et à doser à part les différentes fonctions dissociables apparaissant par rupture des liaisons peptidiques ou disparaissant par leur formation. On peut mettre à profit en ce sens létude de la courbe de neutralisation des mélanges avant et après action du ferment dans l’espoir de révéler une apparition de groupements dissociables par une augmentation du pouvoir tampon dans une zone de pH définie. La fig. 3 montre la modification du pouvoir tampon après une digestion partielle telle que nous l’obtenons par l’autolyse d’un extrait aqueux de foie ainsi qu'après une aulolyse poussée. Ces courbes traduisent l’abaissement du pH du milieu et l’augmentation progressive du pouvoir tampon au cours de la digestion. Mais l'augmentation du pouvoir tampon s'étale sur toute la gamme de pH explorée. Bien que le phénomène se manifeste dans certaines régions de pH plus que dans d’autres, aucune n’est suffisamment privilégiée de ce point de vue pour qu’on puisse être tenté de proposer un simple titrage entre deux limites de pH fixes comme mesure de la digestion.

Nous nous sommes d’ailleurs rendu compte que le premier temps de la formoltitration, qui consiste à amener les milieux au début du virage de la phénolphtaléine, réalise une mesure de la digestion. La quantité de soude nécessaire traduit à la fois l’augmentation du pouvoir tampon par libération de groupements dissociables et l’abaissement du pH du milieu au cours de la digestion. Nous avons toujours noté cette quantité de soude. Elle varie parallèlement aux valeurs fournies par la formoltitration. Cependant nous n'en faisons pas état, car dans certains cas les résultats ainsi obtenus paraissent moins fidèles et leur signification théorique est moins bien définie. |

On peut envisager d'améliorer les résultats tirés d’un simple ütrage si l’on réussit à diminuer la dissociation de certains