CULTURE DES MICROBES

aussi ne faisons-nous que renvoyer aux ouvrages qui les résument; néanmoins nous avons pensé qu'il n'était pas inutile de montrer, par les figures ci-après (fig. 222 à 225) comme exemples, l'aspect de quelques-uns des organismes microscopiques les mieux étudiés et les plus connus ; ces figures, que nous devons à l'obligeance de l'éditeur M. Georges Masson, sont extraites du livre de M. le Dr Duclaux; elles sont toutes au même grossissement de 500 diamètres.

Technique de M. Pasteur pour la culture des microbes. — La démonstration directe ou méthode expérimentale de la nature parasitaire des maladies infectieuses se compose de deux opérations distinctes : il faut d'abord arrivera isoler le microbe et ensuite reproduire le microbe ainsi isolé. Cette seconde partie de l'expérimentation s'effectue à l'aide de l'inoculation. Quant à la première, elle s'obtient par la méthode des cultures dont le principe, ainsi que l'établissent MM. les Drs Zuber et Du Cazal dans une revue critique sur le Rôle pathogénique des microbes (Revue des sciences médicales, 1881), appartient incontestablement à M. Pasteur depuis ses études déjà anciennes sur les maladies du vin et de la bière. Nous extrayons de ce travail les principes suivants de la technique actuellement employée par M. Pasteur, telle qu'il l'a indiquée lui-même à cette occasion :

Il s'agit de préparer d'abord le liquide de culture qui varie avec les microbes que l'on se propose d'étudier.

Les liquides les plus usités sont :

1° L'urine que l'on neutralise avec quelques gouttes d'une solution de potasse ;

2° L'eau de levure de bière : on fait bouillir, pendant 20 à 30 minutes, 20 grammes de levure dans un litre d'eau ; on filtre et on neutralise ;

3° Le bouillon de poulet : on prend parties égales de muscles maigres et d'eau et l'on fait bouillir pendant 1/4 d'heure ; on filtre et on neutralise, toujours par le même procédé.

Le liquide ainsi préparé est introduit dans des ballons de dimension moyenne, dont le col est ensuite étiré à la lampe.

Les ballons ne doivent pas être trop remplis, mais il est important aussi de n'y pas trop laisser d'air à cause de l'opération suivante : la stérilisation du liquide de culture.

Les ballons fermés à la lampe sont placés dans un bainmarie c imposé d'un récipient en cuivre surmonté d'un couvercle à deux ouvertures (l'une au centre pour la tige du porteballons, l'autre sur le côté pour le thermomètre). Le porteballons se compose d'un plateau au centre duquel s'élève une tige de métal portant 4 anneaux pour soutenir et maintenir les ballons.

Fig. 222. — Infusion de foin. — Principales formes qu'on rencontre dans une macération de foin, au bout de 5 à 6 jours de séjour à l'étuve. — En a, gros kolpodes, portant à l'avant des rides couvertes de cils vibratiles, à l'aide desquels ils avalent les aliments dans une sorte de bouche, placée obliquement dans la partie rentrante; à l'arrière, vésicule contractile, tantôt visible en gris bleuâtre, tantôt invisible quand elle est contractée et qu'on doit assimiler à un cœur; un de ces kolpodes est en boule et commence à s'enkyster; c'est ce qui arrive quand les conditions d'existence deviennent difficiles. — En b, vibrions contournés régulièrement en spirale, qu'on appelle spirillums. — En c, monades avec un cil vibratile à l'avant. — En e, amas amorphes de micrococcus. — En f, micrococcus en chaînes; çà et là, dans le champ, petits bâtonnets mobiles et immobiles, rectilignes ,ou flexueux, composant le monde des vibrions. Au milieu du champ, tout près de e, cellules rondes, de la grosseur des cellules de levure. — Grossissement de 500 diamètres. — (D'après M ' Dr Duclaux.)

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VIBRION SËPTIQUE.

Fig. 223. — Vibrion septique. — On a représenté dans cette figure et aussi bien qu'il a été possible, la variété de formes et de dimensions vraiment remarquable de ce microbe. Dans le quart du champ on a essayé de représenter ce qu'il devient quelques heures après la mort dans le sang, où il est pourtant moins visible que ne le représente la figure, à cause des globules au milieu desquels il se glisse. On le devine plus qu'on ne le voit "alors, mais aucun dessin ne peut rendre cette impression. On l'a représenté traversant une de ces places vides de globules, comme il y en a quelquefois dans une préparation, quand la surface "de l'un des deux verres qui la maintiennent présente quelques taches de matière grasse. — Grossissement de 500 diamètres. — (D'après M. le D^Duclaux.)

Fig. 224. — Microbe du choléra des poules. — Côté gauche : Culture récente, formée de granules turgescents, isolés ou par couples, lorsque les micrococcus remplissent le liquide et le rendent trouble. — Côté droit : Même culture, après quelques jours, quand le liquide s'est érlairci, et que les microbes sont tombés au fond du vase. — Grossissement de 500 diamètres. — (D'après M. le Dr Duclaux.)

BACTÉRIDIE DU CHARBON.

Fig. 225. — Bactéridie du charbon. — Côté gauche : Aspect de la bactéridie charbonneuse cultivée dans du bouil on de veau, dans des matras Pasteur; elle est en lon^s tils entrelacés, homosènes d'abord, mais où on voit bientôt apparaître des spores qui linissent par s'isoler et devenir indépendantes ; la figure représente quelques-unes de res spores non encore complètement libérées dr leurs attaches primitives et arrangées en lignes régulières. — Côté droit : Aspect de la bactéridie duns le sang d'un animal mort charbonneux; beaucoup de hàtonnets isoles ou par coaples, rarement des chaînes plus longues ; des globules de sang crénelés sur leur pourtour; en haut et en bas, deux leucocytes. — Grossissement de 500 diamètres. — (D'après M. le Dr Duclaux.)

Des ustensiles de ce genre existent dans tous les laboratoires de chimie.

Le porte-ballons se place facilement dans le récipient de cuivre, rempli d'eau additionnée de chlorure de calcium en quantité plus ou moins considérable suivant qu'on veut retarder plus ou moins le degré d'ébullition. On met le couvercle et on fait chauffer de façon à faire bouillir pendant 20 minutes ou une demi-heure (à une température de 115° à 120°). Cette opération n'est pas sans quelque danger ; la vapeur d'eau fait quelquefois éclater les ballons. Aussi est-il nécessaire d'assujettir le couvercle. On évitera de circuler autour de l'appareil pendant qu'il fonctionne et l'on se garantira des éclats qui peuvent se produire en interposant une planche ou un tableau noir. — On laisse refroidir dans le récipient, puis on lave les ballons à grande eau.

Les liquides de culture sont alors stérilisés et resteront indéfiniment dans les mêmes conditions sans subir aucune altération.

Lorsque l'on veut les utiliser, on ouvre un ballon pour en retirer le liquide que l'on répartit dans des petits flacons spéciaux : à culture.

Pour cela, il faut se placer dans un lieu où l'air soit aussi pur, aussi immobile que possible. Pendant toute la durée des opérations suivantes, on évitera avec le plus grand soin d'agiter l'air, on se bornera aux mouvements strictement nécessaires et l'on se gardera de tout mouvement brusque.

Pour ouvrir le flacon, on donne sur le col un trait de 1 me que l'on continue au moyen d'un charbon enflammé.

Puis avec une pipette (de Pasteur) on aspire le liquide et on le répartit dans les petits flacons à culture. Ce sont des flacons fermés à l'émeri par un bouchon ouvert contenant du coton stérilisé à l'étuve. Ils doivent être naturellement stérilisés euxmêmes, puisqu'ils peuvent contenir des germes. Pour cela, ils doivent être maintenus pendant une heure dans une étuve à air sec à une température de 150° environ.

Les flacons à culture étant remplis comme nous venons de le dire, on les met à l'étuve pendant quelques jours à une température constante de 36°. Si le liquide reste clair, c'est qu'il est stérile et prêt pour l'ensemencement ; s'il se trouble, c'est qu'un germe s'y est introduit pendant l'opération. En général quatre jours suffisent pour cette épreuve.

Pour ensemencer une culture, on prend avec une pipette (de Pasteur), stérilisée à l'étuve et dont on casse la pointe au moment d'en faire usage, une petite quantité du liquide à essayer ■et on l'introduit dans le liquide, — toujours en évitant d'agiter l'air pour ne pas introduire dans le ballon d'éléments étrangers. Le liquide étant ensemencé, on reporte le ballon à l'étuve.

ATTENUATION DES VIRUS. 339

Les inoculations aux animaux se font avec une seringue de Pravaz. Au laboratoire de Pasteur, les seringues ne servent jamais qu'une fois. Lorsqu'on en fait usage, l'instrument est démonté, les pièces jetées dans l'eau bouillante, puis le tout est envoyé au fabricant pour être nettoyé et remonté.

Les pipettes en verre ne servent non plus jamais qu'une fois et sont ensuite jetées au rebut.

En somme, les instruments nécessaires pour les recherches de ce genre sont :

1° Un bain-marie en cuivre avec couvercle percé de deux trous ;

2° Des porte-ballons pour placer les ballons dans le bainmarie ;

3° Des ballons à col un peu long destinés à emmagasiner les liquides de culture ; le col est fermé à la lampe ;

4° Des petits flacons bouchés à l'émeri (Alvergniat) destinés aux cultures proprement dites;

5° Une étuve à air chaud, ou poêle à air, ou étuve de Darsonval ;

6° Pipettes en verre d'une forme spéciale (Pasteur) ;

7° Thermomètres ;

8° Seringues de Pravaz.

Une des principales difficultés des opérations microbiologiques est d'isoler les germes, comme, par exemple de ne cultiver qu'un microbe déterminé lorsque le sang avec lequel on fait les ensemencements en contient plusieurs. Ici il n'y a plus de règle fixe ; le choix des cultures varie avec chaque microbe et c'est chaque fois une nouvelle étude à faire.

Dans ce procédé, cet isolement est obtenu d'ordinaire par une véritable application de la loi de Darwin de la lutte pour la vie. Dans le milieu de culture, c'est l'organisme auquel le milieu est le plus approprié qui l'emporte sur les autres qui meurent et disparaissent successivement.

Mais cette sélection est si difficile en même temps qu'importante que l'on ne réussirait guère si l'on comptait simplement sur les résultats de la lutte des microbes, ou bien « sur un hasard de préparation comme il arrive toujours dans les recherches de longue, haleine ». (Pasteur)

M. Pasteur cite comme moyens adjuvants :

1° La séparation d'après la nature aérobie ou anaérobie des microbes ;

2° La culture dans un morceau de chair ;

3° La culture d'une goutte commune qui souvent ne contient qu'un seul germe. C'est par ce procédé que M. Pasteur a découvert son vibrion pyogénique.

Atténuation des virus. — Nous verrons plus loin, au para-

graphe consacré aux affections charbonneuses, les résultats produits par la vaccination dans ces maladies, à la suite des découvertes de M. Pasteur, de MM. Chamberland, Joubert, Roux etThuillier, ses aides, et de MM. Chauveau, Toussaint, Arloing, Cornevin et Thomas, et grâce à cette méthode de l'atténuation des virus, de la diminution de vitalité des microbes bactériens et bactéridens qu'ils ont obtenue en exposant ceux-ci à des doses graduées d'oxygène, en étudiant leur résistance variable à la chaleur et en combinant les procédés de leurs cultures successives. Il n'est pas douteux que l'on ne parvienne ainsi à connaître à la fois la nature des virus des diverses maladies infectieuses et en même temps la transformation de ces virus en vaccins préservateurs. Comme le faisait remarquer M. le DrCornil dans la leçon inaugurale de son cours d'anatomie pathologique à la Faculté de médecine de Paris (Revue scientifique, 1882), « en tenant compte aujourd'hui de tant de données nouvelles introduites par M. Pasteur, le génie initiateur dans cette voie, par Davaine, par Roch, Cohn, Klebs, etc., sur le rôle des microorganismes dans les maladies, il nous est bien permis d'admettre qu'une période nouvelle s'ouvre aux recherches scientifiques. Jamais révolution médicale ne s'est annoncée plus complète et plus féconde, car elle fera connaître la cause des maladies virulentes, épidémiques, endémiques ou contagieuses et mettra sur la voie d'une thérapeutique nouvelle par les vaccinations, par la purification de l'air, de l'eau, des aliments, des circumfusa et des ingesta, comme on dit dans la langue médicale. »

Déjà, en effet, non seulement l'hygiène, mais la clinique s'emparent de ces données nouvelles, ainsi qu'en témoignent les recherches de MM. les professeurs Bouchard et Germain Sée, le premier dans son cours à la Faculté de médecine de Paris, sur les ?iéphrit,es infectieuses, sur les ma' ailles par ralentissement de la nutrition (Paris, Savy, 1881 et 188u2), et dans sa communication sur la présence cl alcaloïdes dans les urines au cours de certaines maladies infectieuses {Société de biologie, séance du 5 août 1882), le second dans ses leçons à l'Hôtel- Dieu sur les pneumonies infectieuses [Union médicale, 1882).

Ptomaïnes et alcaloïdes toriques des produits normaux d'exci étion. — D'autre part, la découverte que notre collègue M. le Dr Armand Gautier, en 1873, et peu après MM. les Drs Selmi (de Bologne) et Lussana (de Padoue) faisaient des ptomaïnes, «substances basiques d'une toxicité redoutable, représentant les réactions générales des alcaloïdes végétaux et qui se rencontrent dans les matières animales en décomposition, en particulier dans les cadavres exhumés », cette découverte est encore