CONTRE LES MICROBES

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série de recherches sur l’absorption des cytases. Il a établi d’abord que les globules rouges normaux, plongésdans un sérum hémolytique normal, sont incapables de fixer toute la cytase. Lorsqu’on centrifuge un sérum pareil, après un contact prolongé avec des globules rouges d’espèce étrangère, on obtient un liquide qui ne dissout plus les hématies normales. Mais, lorsqu’on sensibilise celles-ci à l’aide d’nn fixateur spécifique, les hématies se dissolvent en grande quantité. Il faut bien admettre (ju’il s’agit dans cette expérience d’une seule et même cytase, parce qu’avant la centrifugation, comme après, on ajoute les globules rouges de même espèce. Seulement, dans le premier cas, ces globules étaient normaux, tandis que dans le second, ils étaient sensibilisés par le fixateur.

Lorsqu’à près le premier acte de cette exjiérience, c’est-à-dire après la fixation d’une certaine quantité de cytase par les hématies, on centrifuge le mélange et qu’on ajoute non plus les globules rouges de meme es[>èce sensibilisés, mais les hématies normales d’espèce différente, on voit celles-ci se dissoudre et fixer encore une certaine (juantité de cytase. Comme la première expérience (avec les hématies sensibilisées) a montré que toute la cytase n’a pas été absorbée par les hématies, on comprend facilement que la portion restant dans le liquide agisse sur des hématies normales d’antre espèce.

Mais lorsqu’on fixe la cytase sur des hématies sensibilisées, l'absorption devient complète et l'addition d’autres espèces de globules rouges n’amène plus aucune dissolution. 11 est donc facile, à l’aide de globules rouges sensibilisés, d’enlever toute la cytase à un sérum. Eh bien, lorsque dans un sérum pareil, prive de cette façon de toute sa cytase hémolytique, on ajoute des bactéries, celles-ci ne présentent aucun signe de destruction; tandis qu’auparavant, c’est-à-dire avant l’asorption de la cytase par les hématies sensibilisées, le même sérum était fortement bactéricide. Prenons un exemple concret pour que le lecteur puisse se rendre compte d’une façon })récise des phénomènes observés. Voici im sérum normal de rat (|iii, en peu de temps, fransformeles vibrions cholériques en granules ou l)ien déforme et dissout les bacilles charbonneux. Le même sérum dissout les hématies d’espèce étrangère. On laisse d’abord en contact ce sérum avec ces hématies, sensibilisées par le fixateur spécifiijue. Après la dissolution d’une quantité tle ces hématies, on ajoute au sérum un peu de vibrions cholériques ou de bacilles charbonneux. Les vibrions, dans ce sérum, ne se transforment [ilus en granules et les bactéridies ne changent en

dflAPlTRE Vit

rien : elles se colorent de la l‘a(;on normale par les couleurs d’aniline basiques, elles ne présentent ni déforinatious, ni dissolution de leur contenu. En d’autres termes, il iic se produit pas d’action bactéricide dans un sérum, dépouillé de sacytasc par des hématies sensibilisées.

Faut-il conclure de cette expérience et d’autres aiialogaies que la cytasc, fixée par les éléments figairés sensibilisés (globules rouges ou microbes), est toujours la seule et niôme cytase? Ne pourrait-on pas supposer que, imprégnés de fixateurs spécifiques, ces éléments deviennent tellement avides de cytascs (pi’il leur est facile d absorber non seulement une variété, mais plusieurs espèces de cytases?

Les faits que nous avons résumés dans le quatrième chapitre, concernant les macrocytases, indiquent (ju’il existe très probablement deux espèces de cytascs, liées aux deux grandes catégories de phagocytes. Les extraits des ganglions mésentériques, de l’épiploon et des exsudats très riches en macrophages exercent une action hémolyti(pic incontestable, et cependant ils ne sont pas bactéricides. Ihir contre les exsudats, composés pour la plupart de microphages, ne dissolvent pas les globules rouges, mais sont au contraire éminemment Ijactéricides. M. Tarassewitch a exécuté à ce sujet des expériences nombreuses dans mon laboratoire et a fourni un grand nombre de données en faveur de la théorie des deux cytases phagocytaires. Il a observé que, même lorsqu’on ajoute du fixateur spécifique à l’extrait d’exsudats microphagiques (de lapin), les globules rouges sensibilisés ne se dissolvent pas. 11 faut donc croire réellement que la microcytase, si active vis-à-vis des bactéries, est tout à fait impuissante contre les cellules animales.

Comme les microphages saisisseiit, quoique rarement, et digèrent les hématies, les spermatozoïdes et d’autres cellules d’origine animale, 011 doit admettre qu’ils renferment aussi une petite quantité de macrocytase, ou bien que la microcytase est a la longue capable de dissoudre ces éléments. D’un autre côté les macrophages, malgré leur prédilection si jirononcée pour les cellules animales, englobent et digèrent aussi certaines bactéries. Ceci est dù peut-être a la présence d un peu de microcytase ou à la propriété de la macrocytase d attaquer les microlnîs. Ces questions sont trop subtiles pour pouvoir être déti-

nitivement résolues dès à présent.

La dualité des cytases ne se trouve pas en contradiction avec les expériences de M. Dordet que nous avons rapportées plus haut. 11 n’y a qu’à admettre que les éléments figurés, une fois qu ils sont ini-

LE MÉCANiSME DE L’IMMUNITÉ NATURELLE CONTRE LES MICROBES 207

jjrégTiés (le fixateurs spécifie] ues, deviennent capaliles d’absorber non soLileinent la cytase (jui les digère, mais aussi une autre (]ui, sans les dissoudre, se fixe siinplement sur eux. 11 y aurait ici un phénomène analogue a la fixation par la fil)rine de diüstases, autres cpie la ti’ypsinc et la pepsine^ ou bien à la fixation par la soie de toutes sortes de ferments solubles.

Nous admettons donc que les phagocytes élaborent deux cytases : la inacrocytase, active sur les cellules animales, et la microcvtase, qui digère les bactéries, (le résultat a été jusqu’à un certain point préparé par les expériences de M. Sclnittenfroh (1 ) et prévu ]>ar M. M. Neisser (/. c.).

Nous avons déjà vu (jue la réaction dans l’intéiieur des ])hagocytes est le plus souvent iaiblcment ou très faiblement acide et (pichpiefois seulement nettement alcaline. 1) un autre coté, il est bien connu que les cytases, dans les sérums, exercent leur action en milieu alcalin. 11 est donc certain cjuc ces terments solubles peuvent digéi'cr dans des conditions variées. M. llegelcr (2), du laboratoire de M. Buchner, a étudié 1 intluence de 1 alcalinité et de l’acidité du milieu sur l'iiction bactéricide du sérum. 11 est arrivé à la conclusion (pic la destruction des microbes peut bien s opérer dans un sérum, ampiel ou ajoute des petites (juantités d alcali (carbonate de soude), et aussi dans un smaim de réaction faiblement acide a la suite de 1 addition de [ictites (piantités d’acide sulfurique. Une fois que le sérum est devenu nettement acide, le pouvoir bactéricide disparaît aussihit.

tout l’ensemble des données sur les cytases rapprochent ces diastascs du groupe des trypsines, de la papaïne, de ramibodiastasc et de 1 actinodiastase. Les cy tases s(3iit élaborées par les [ihagocytes, mais ne sont pas sécrétées dans les plasmas et restent dans riiitéricur des cellules, tant que celles-ci sont intactes.

Sous ce rapport, les cy tases doivent être rangées dans le groupe des « Endoenzymes », d’après la nomenclature de MM. llahn et Gerct (.1). (jCS (observateurs ont étudie avec beaucoup de soin la*diastasc protéolytique de la levure de loière qui, elle aussi, agit dans l’intéricur des cellules, sans jamais être sécrétée au dehors. Cette diastase, à laquelle ils donnent le nom d’ (( endotrypsine de la levure » (llefeendotrypsin), présente en général une parenté indéniable avec

(1) Archiv fur Ihjyiene, i<S99. ï. XXXV, p. li)9

(^) Ibid., 1901. T. XL, p. 373.

(3) Zeitschrift fur lîioloyie, 1900. T. XL, p. 117.

CllAlMTR'-: Vil

les cytases phagocytaires, se clistingiuiiit cependant de ces dernières par une plus grande sensibilité pour les alcalis. M. Kutscher (l), dans ses recherches sur rautodigestion de la levure, a pu établir des faits analogues.

Les cytases et l’endotrypsine sont donc des endoenzymes, comme le sont aussi l’amihodiastase, ractinodiastase,la plasmase (fibrinferment) et la zymase d’E. Buchner. Toutes, elles restent confinées dans l’intérieur des cellules qui les ont élaborées, sans être sécrétées ou excrétées au dehors, comme la sucrase, ou invertine, produite par des levures ou des mucédinées.

Nos connaissances actuelles sur les cytases sont encore bien imparfaites, ce qui n’est pas étonnant, vu la nouveauté de la question. Les cytases que l’on trouve dans le sérum du même animal sont les mêmes, comme nous l’avons vu : la rnacrocytase qui dissout les hématies est la même qui digère les spermatozoïdes ; la même microcytase digère les bacilles, les spirilles et les cocci. Mais dans les sérums d’espèces diltérentes, les cytases diffèrent aussi. Ainsi les cytases de chien ne sont pas les mêmes que celles des sérums de lapin ou de cheval. Tandis que la plupart des cytases sont très sensibles à la chaleur et sc détruisent déjà à oo^-oG”, quehpies-unes, comme la microcytase du sérum de rat, résistent à cette température et ne se détruisent qu’à G3“, présentant ainsi un exemple de cytase stable à la chaleur, semblable à celle qui avait été découverte par MM. Ehrlich et Morgenroth.

Il est encore très difficile d’étalilir si, en dehors des cytases, il existe d’autres endoenzymes dans l’intérieur des phagocytes, c’est-à-dire des ferments solubles qui ne passent pas dans les sérums après la destruction des phagocytes, restant toujours dans l’intérieur de ces cellules. Nos méthodes actuelles d’investigation ne permettent aucune conclusion à cet égard. Nous savons seulement que la digestion des éléments figurés est plus profonde dans l’intérieur des phagocytes que dans les sérums. Ainsi, comme nous l’avons vu dans le chapitre IV, les meilleurs sérums spermotoxiques et hémolytiques ne digèrent jamais ni les spermatozoïdes, ni les noyaux de globules rouges d’oiseaux. Et cependant ces éléments se dissolvent complètement dans le contenu phagocytaire. Cette différence dépend-elle de ce que, dans les sérums, on ne retrouve qu’une faible partie de la rnacrocytase, ou

(1) SUcungsberichteder natiu'forsch. (leselhchafi in Marburg, 1000.

LE MÉCANISME DE L’IMMüMTÉ NATURELLE CONTRE LES MICROBES 209

bien de l’influence nuisible de l’alcalinité des sérums sur la macrocytase qui agit mieux dans des milieux faiblement acides, ou delà présence dans les phagocytes d’autres endoenzvmes, encore inconnues ? Autant de questions auxquelles nous ne pouvons répondre d’une façon précise.

De même que les cellules animales, englobées par les phagocytes dans la résorption (v. chap. IA ) deviennent aussitôt perméables aux couleurs, les microbes de 1 intérieur des phagocytes, dans rimmunité naturelle, acquièrent la même propriété. Assez souvent les microbes englobés, sons rintluence de l’action phagocytaire^ deviennent capables de se colorer par 1 éosine (fig’. 36). Cette transformation éosinophile a été observée chez le vibrion cholériipie, le bacille charbonneux et chez le Proleii.s milgans. Elle est pi*obablemcnt très répandue parmi les bactéries phagocytées. Ce fait démontre clairement (ju’au moins une certaine partie des granulations éosino[)hiles provient des corps étrangers, englobés par les phagocytes. Une autre partie de ces granulations est probablement due à la transformation de substances solubles, absorbées par les phagocytes. En effet, on voit souvent, pendant 1 inflammation, beaucoup de microphages (pii ne renferment aucun corps solide étranger, se charger d’une quantité de petites granulations pseudoéosinophiles.

Plusieurs vibrions et bacilles, englobés par les microphages, s’y transforment presque aussitôt en granules sphériques. Le vibrion cholérique subit la même transformation dans l’exsudât péritonéal au moment de la phagolyse, ainsique dans le sérum sanguin. Les bacilles coli, typhique et quelques autres coccobacilles ne se transforment point ou presque pas dans les sérums, mais accusent cette transformation en granules dans l’intérienr des microphages. Les macrophages digèrent au contraire les mêmes microbes (vibrions et coccobacilles) sans qu’ils présentent de signes de ce changement de forme. La membrane bactérienne résiste plus longtemps à rintluence (Je la digestion phagocytaire que le contenu, mais elle finit aussi par être complètement digérée. Après l'englobement et la destruction des microbes par les phagocytes, il y reste pendant longtemps des débris de forme indéterminée, mais Je n’ai jamais pu constater d’excrcta solides de ces cellules. Il faut donc croire que les parties indigestes ne s éliminent pas en dehors dos phagocytes.

Nous avons mentionné, dans le récit de la dissolution des globules rouges par les sérums normaux, l’opinion de MM. Ebrlich et Moreen-

GHAI'ITUE Vil

rotli qui pensent que jamais les cytases ne sont capables de se fixer a ces cellules sans le concours de fixateurs. Ils citent en faveur de leur opinion plusieurs exemples de fixateurs (substance intermediaire, on Zwisclienkdrper) qu’ils ont pu découvrir dans le sérum de plusieurs espèces de mammifères. Mn est-il de même de la microcytase par rapport aux microl)es ? Si ce ferment soluble est incapable de se fixer tout seul sur le corps de ces parasites, le concours de fixateurs

lui serait indispensaljle. La propriété bactéricide de la microcytase dépendrait donc de l’existence d’un autre corps (fixateur) qui, peutêtre, n’aurait point les phagocytes pour origine. Le problème présente donc, comme on voit, une portée générale considérable.

Dans un de ses mémoires, xM. Dordet(l ) avait déjà posé cette question de l’existence de la propriété sensil)ilisatrice (ou fixatrice) dans les sérums neufs. En mélangeant deux sérums neufs, pi-ovenant d’espèces ditférentes, il a pu constater quelquefois l’existence de pareils fixateurs. Ainsi, les vibrions cholériques qui ne subissent pas de transtormation granuleuse ni dans le sérum de cheval neuf (qui est capable seulement de les immobiliser et les agglutiner en amas), ni dans celui de cobaye neuf, se transforment facilement en granules lorsqu’on les met en contact du mélange des deux sérums. M. Bordet met du reste en garde contre une généralisation hâtive do cette observation et se propose de faire de nouvelles recherches sur ce sujet. Indépendamment de lui, Moxter (2) a essayé de démontrer la présence de fixateur dans le sérum de cobaye normal. Débarrassé des cytases par le chautfage, ce sérum est incapaljle de transformer les vibrions cholériques en granules; mais, lorsqu’on lui ajoute du liquide de l’exsudât péritonéal du même cobaye, la transformation se fait peu de temps après. Cependant, comme cet exsudât était déjà par lui-même en état de produire le phénomène de Pteiller, les conclusions de Moxter sur la présence du fixateur dans le sérum de cobaye normal, ne peuvent être acceptées sans une analyse plus profonde des faits, ce qui demande de nouvelles recherches.

Un travail récent, exécuté par I\L Bordet (3) en collaboration avec M. Gengou. travail consacré à l'étude de l’absorption des cytases par les niicrol)es, sensibilisés à l’aide de fixateurs, nous renseigne aussi sur la question qui nous préoccupe en ce moment. Il a été tacite d é-

(1) Annales de dl/istilnt Pasteur, 1899. T. XllI, p. 293.

(2) Centralblatt /'. liakieriol. . 1899. T. XXVI, p. 3-44.

(3) Annales de l'Institut Pasteur, 19Ü1. T. X\q p. 289.

LE MÉCAN1S>[E Dl': L’I.MMUMTÉ NATUUELLE GOTI'RE LES MIGKOBES

tablir la présence du fivatcur dans des sérums vis-à-vis du vil)rion cholérique et do scs congénères, à cause do leur transformation en granules, ap[)réciahle à rexamen microscopique. Lors(]u’un sérum qui lui-mème est incapable de [)rovoqucr cette transformation, la produit aussitôt qu on lui ajoute un autre sérum, cbauffé à 55", on doit en conclure que le dernier liijuide renferme le lixateur choléri- (]ue, tandis que le premier ne contient que des cytases. ]\Iais, comme la plupart des bactéries ne subissent aucune transformation analogue dans les séi‘ums,on mau(|ue dans ces cas d’un critérium de la présence du iixateur. MM. lîordet et Gengou ont obvié à cet inconvénient, en déterminant latixatioii de l’alexine [)ar*des bactéries qui ne subissent ni transformation g’ranuleuse, ni aucun autre changement visible. On prend un sérum neuf, nonchauüe, qui contient toujours une quantité sultisante de cytases et on le mélange avec un microbe quelconque, par exemple avec du bacille cbarbonneux ou du coccobacille pesteux. Le sérum, décanté après un contact prolongé avec ces bactéries est tout aussi bien qu auparavant capable de dissoudre les globules rouges d espèce étrangère déterminée. Ceci prouve qu’il est resté des cytases dans le sérum, qu elles n’ont pas été absorbées par les microbes. Répétons la môme expérience avec cette différence qu’au lieu de bacilles cbarbonneux et de coccobacilles pesteux normau.x, nous introduisons dans le sérum neuf, non chauffé, ces microbes, sensibilisés [)ar les fixateurs correspondants (c’est-à-dire soumis à l’intluence préalable de sérums spécifiques, cliautfés à 55"), Après un contact d une certaine durée avec ces bactéries, le sérum ne sera plus capable de dissoudre les globules rouges d’espèce étrangère déterminée, ce qui démontre que les cytases ont été fixées par les microbes, grâce au concours des fixateurs. On voit donc qu’il est facile de déterminer si uii sérum, dont les propriétés sont inconnues, renferme ou non des fixateurs. On le chautle à 55" et on le mélange avec du sérum neuf, non cbautfé, auquel on ajoute des bactéries. Si, après le contact avec ces dernières, le sérum neuf a perdu le pouvoir de dissoudre les globules rouges (qu’il était capable de dissoudre auparavant), c’est que scs cytases ont été absorbées par les microbes, grâce au fixateur qui devait se trouver dans le sérum chauffé. Dans le cas contraire, on conclut à la non-cxistence du fixateur.

Dans leurs recherches, MM. Rordet et Gengou ont dii souvent employer des sérums neufs, non chauffés, auxquels ils ajoutaient plusieurs espèces de bactéries. Us ont constaté (pie, dans ces mé-

CIlAlMTiU': VU

langes, les cytases restaient intactes on à peu près. Ces ferments solul)les ii’étaient pas ou presque pas absorl^és par les microbes, ce <]ui prouve que, tlaus les sérums neufs, il n y a pas de tivateui s en quantité tant soit peu appréciable. De toutes leurs c.vpériences, celle qui nous intéresse le plus a été exécutée avec le Proleiis vuhjaris. Ce microbe, mis en contact prolongé avec le sérum de cobaye neuf, s est montré incapable d'absorber les cytases d’une façon sensible. Tout au plus en fixait-il des quantités minimes. Il n’y a donc pas de fixateur pour le Proleiis dans le sérum de cobaye neuf ou bien, s il en existe, sa quantité est négligeable. VA cependant ce môme Proln/s vi/lgaris^ injecté à des cobayes, est peu de temps après englobé et détruit par les phagocytes qui assurent à 1 animal une immunité natuielle des plus stables. La facilité avec laipiellc les leucocytes de cobaye dévorent le Protem découle, entre autres, d’une expérience de M. Ilordet (1), exécutée à propos d’une tout autre tpiestion. Un cobaye, très malade à la suite de l’injection dans sa cavité péritoneale d’un streptocoque très virulent, contient dans Texsudat du péritoine une quantité de microphages vides, incapables d’englober ces microbes. A ce moment critique, on lui injecte dans le môme endroit une masse de Prüteus vulgaris. « Au bout d'un temps très court, on constate que les leucocytes qui refusaient énergiquement d’englober le streptocoque, se sont avidement em[)arés du microbe nouveau qu on leur offre ; au bout d’une demi-heure, la totalité des microbes est à l’intérieur des phagocytes. »

Voilà donc bien une preuve réelle de ce fait que les phagocytes, pour débarrasser l’organisme d’un microbe et lui assurer une nnnuinité naturelle, n’ont pas besoin du secours préalable d'un fixateur extraphagocytaire. Les phagocytes agissent pour ainsi dire rnoLu pro-^ pria et règlent eux mômes la résorption des intrus. La question des fixateurs dans les sérums neufs perd donc pour nous son importance et leur origine ne présente pins d’intérôt essentiel pour le problème qui nous occupe en ce moment.

Peut-on conclure des données que nous venons de résumer que les cytases qui, sous plusieurs rapports, se rattachent aux tr\ psinet, ont encore ce point commun avec elles qu elles peuvent agir sans le concours detixateur? Il est connu, et nous en avons parlé dans notre chapitre III, que la trypsine peut digérer seule, ou en collaboration avec l’entérokyiiase, ce ferment du suc intestinal qui favorise si piiis-

(1) Annules th; rinstilnt l'astenr, 1896. 1. X, i>. 107.

LL MLCANIS.ML J)L L’I.MMUNITI'; NATUHKLLL CONTRE LES MICROfJES

sammcnt l’action fies ferments pancréatifjiies. Est-ce aussi le cas des cytases ? t.e fait que, mis en contact avec le sérum neuf non cliautfé de cobaye, le Proteus vulgans est incapable d’absorber les cytases, tandis (pi il est si facilement digéré par les phagocytes, indifjue plutôt que, pour la lixation des cytases, le concours du fixateur est indispensable. Mais, comme ce fixateur tait délaut dans le sérum, et tpie malgré cela il doit exister pour le besoin de la digestion, il faut bien en conclure ([u’il se trouve dans l’intérieur des phagocytes. Sa quantité est peut-être si faible (jue, passé dans le sérum, son action se perd totalement ou à peu près. De nouvelles recherches sont nécessaires pour élucider ce [)oint délicat.

Mais peut-être les phagocytes qui, comme nous venons de le voir, peuvent eidrer en lutte et englober les microbes sans (pie ceux-ci soient préalalilement touchés par le fixateur, sont-ils incapables de lemplir leur rôle sans le concours de quehpie autre substance, circulant dans le plasma sanguin ? Parmi ces substances, il y en a une ([ui agit manilestenient sur les mici’obes, en les immobilisant et en les réunissant en amas. Cette propriété agglufinative se rencontre souvent dans les humeurs normales de beaucoup d’espèces animales et s’exerce vis-à-vis d’un grand nombre de bactéries. On peut la constater non seulement dans le sérum sanguin, mais encore dans les liquides des transsudats et des exsudais et dans certaines sécrétions, comme le lait, les larmes, 1 urine. Le mécanisme de cette action agglutinative est encore très peu connu et nous pouvons d’autant plus nous dispenser d’entrer dans les détails à son sujet qu’il ne présente pas une grande importance au point de vue de l’immunité naturelle.

Nous avons déjà parlé dans le précédent chapitre de renglobement des vibrions cliolérhpies dans la cavité péritonéale des cobayes. Dans les cas où ces animaux manifestent une résistance définitive, les phagocytes dévorent les vibrions à un moment où ils présentent des moLivemenls très actifs. Même dans la période où la plus grande majorité des vibrions sont déjà saisis par les leucocytes et où il ne reste plus que quelques vibrions libres isolés, ceux ci se meuvent de façon normale, fies faits, observés maintes fois, démontrent nettement que la phagocytose, pour s'elfectuer, peut se passer traction agglutinative préalal)le, ce qui n’empêche pas que lorscpie les microbes sont réunis en amas immobiles, ils peuvent être entourés par les leucocytes avec plus de facilité.

Dans le cas du bacille typhifjue, microbe des plus mobiles, on

CilAlMTUI': VII

()l)sei-vc les mêmes laits (in’avec le vibrion cholérique. On voit souvent, chez des animaux indemnes, les derniers bacilles lilires se mouvoir très vivement au milieu des leucocytes, remplis de microbes. Dans beaucoup d’autres exemples d’immunité naturelle, on rencontre constamment des phagocytes, ne renfermant (pi’un seul ou un petit nombre de microlies (streptocoques, levures, etc.).

Des exemples de microbes mobiles à 1 intérieur des phagocytes jirouvent aussi la possibilité pour ces cellules de se passer du concours de substance agglutinative pour leur œuvre protectrice. Le cas le mieux étudié de rapports entre l’immunité naturelle et ragglutination est celui qui concerne le bacille charlionneiix. C est M. Gengou( l) qui a exécuté à l’Institut bactériologique de liège un travail très détaillé sur celle tpiestion. Il a établi que le bacille du premier vaccin charbonneux pasteurien est agglutiné par le sérum sanguin d'un grand nombre d’animaux. Mais il a constaté que les sérums qui agglutinent le plus ce bacille ne proviennent pas des espèces les plus réfractaires. C’est le sérum humain qui agglutine le plus fortement le bacille du premier vaccin (dans la proportion d une partie de sérum pour 500 parties de culture) et cependant l’homme n’est rien moins qu indemne contre le charbon. Le sérum de pigeon est au contraire coin- ])lètement dépourvu du pouvoir agglutinatif, quoique cette espèce résiste non seulement au premier vaccin, mais assez souvent même au charbon virulent. Le sérum de bœuf, espèce sensible au charbon, est plus agglutinatif (1 : 120) que celui de chien (1 : 100), réfractaire. Il y a parmi ces exemples aussi des cas exceptionnels, où la propriété agglutinative correspond au degré de réceptivité. Ainsi le sérum de souris n’agglutine pas du tout la bactéridie du premier vaccin. Seulement, à côté de cet exemple, il y a celui du rat, espèce d’une sensiliilité modérée pour le charbon, dont le sérum possède le moindre pouvoir agglutinant, n’agissant qu’en pi-oportion de 1 : 10. Tous ces faits justifient pleinement le résultat formulé par M. Gengou qu’« 011 ne peut pas établir de relation entre le pouvoir agglutinant et l’état réfractaire des animaux au charbon » (p. 319). Cette conclusion peut être étendue aux phénomènes de l’agglutination des microbes

et de l’immunité naturelle en général.

Parmi les propriétés des humeurs, il en existe encore une qui pourrait jouer un rôle dans l’immunité naturelle eontre les microbes. J ai

(1) A)X‘hivPS internationales de Pharmacodiinamie et de Thérapie, 1M)9. l.^b

p. 299 et Annales de /'Institut IPisteur, 1899. I . Xlll, p. 042.

Lli MKCANIS.MK DK L’IMMUMTK NATUUKLLK CÜNTilK LKS MICUOHKS

en vue le poiivoii* du sang et de certains autres liquides de l'organisme de neutraliser l’action des poisons microbiens. Peut-être, peuton se demander, les phagocytes ne sont capables d’entrer en fonction qu’après une action préalable des aniito.vincs? Après la neutralisation du principal moyen des microbes de nuire à rorganisme, ces [)arasites, devenus inollensifs, pourraient alors facilement être détiaiits [>ar les cellules phagocytaires. Nous avons déjà eu l’occasion d'aborder celte question fondamentale. Ainsi nous avons insisté dans les chapitres ])récédents sur 1 absence de parallélisme entre l’iminnnité contre les microbes et contre leurs toxines et sur rcxcmplc des bactéries anaérobies (tétanos, vibrion septique, charbon symptomatique), vis-àvis desquelles la phagocytose s accomplit sans aucun concours de fonction antitoxique. Maintenant nous devons passer directement à 1 examen de la question des antitoxines dans les humeurs des animaux naturellement réfractaires contre les microbes et de leur rôle éventuel dans cette immunité.

Les cas de sérums antitoxiques chez des animaux normaux sont en général très rares. On pourrait croire que ceux d’entre eux qui sont doués d immunité naturelle contre les microbes et en même temps contre leurs toxines, présentent un pouvoir antitoxicjue naturel appréciable. Examinons quelques exemples des [)lus typiques. La poule jouit d’une immunité très pi-ononcéc conti*e le bacille tétanique et sa toxine ; son sang et son sérum cependant ne manifes-

tent aucun pouvoir antitoxique, comme cela a été prouvé par M. Vaillard il) et confirmé par plusieurs autres observateurs. Le rat est très réfractaire à la diphtérie ; il résiste à l’inoculation soiis-cutanéc d’une grande quantité de bacilles diphtériques et supporte bien la toxine di[)htéri(pie, injectée ailleurs (jue dans le cerveau. Eh bien, comme l’a démontré M. Kouprianoxv (2), dans un travail exécuté sous la direction de M. Lœffler, le sérum sanguin et l’émulsion d’oi*ganes de rats gris ( Mifs (/rcf/ma/ws) ne jouissent d’aucune propriété antitoxi(pie. Ce fait a été aussi confirmé par d’autres observateurs. *M. v. Hchring (3), dans un aperçu des phénomènes de l’immunité en général, résume la question (jni nous intéresse de la façon suivante : « Nous ne trouvons pas d’antitoxine dans le sang des individus natu-

(1) C. r. de la Soc. de Hiologie, 1891, [>. 464.

(2) Centralblatt für Hakleriolonie, 1894. T. XVI. p. 4I.“).

(3) ,\rlicle « Immunilal » dans la troisième édition de la Ileal-Enci/clonedie d'iùilenhun/, IS9(5

GIIAIMTRI': VII

rellemciit réfractaires ». 11 y a cepeiiclaiit quel(|ues exceptions, peutêtre seiileineiit apparentes, à cette règle. Ainsi M. Wassermann (1) a constaté que le sérum sanguin, chez riioinnie sain, est quelquefois antitoxique vis-à-vis du poison diplitéiiquc. Les personnes qui fournissaient cette antitoxine aftirinaient n’avoir jamais eu de diphtérie. Mais on sait que cette maladie évolue quelquefois d une façon si l)énigne qu elle peut passer inaperçue. Plus concluant serait 1 exemple de chevaux normaux, dont le sérum sanguin, comme 1 ont démontré M. Meade Bolton et M. Cobl>et, est assez souvent antitoxique pour la toxine diphtéri([ue. Seulement, cette propriété n est pas propre à l’espèce clievaline en général et chez certains individus elle fait complètement défaut. Ce dernier fait indique que le pouvoir antitoxic^ue des chevaux a été plutôt acquis a la suite de quelque affection, produite par uu hacille diphtériforme. Cette supposition n’a pas encore été assez étudiée et ne peut pas par conséc[ueiit avoir la prétention d’ètre acceptée comme définitive. Uéceinment,MM.Max JNeisser et Wechshcrg (2) ont découvert une antitoxine du sang humain, capable d’empêcher la dissolution des globules rouges par la toxine des Staphylocoques. Ce pouvoir antitoxique est 1res variable selon les individus et s’ex[)liquc probablement par le fait que le Staphylocoque est uu des microbes des plus répandus parmi la flore bactérienne du corps humain. Les petites attections produites par ces microbes (acnés, furoncles, etc.) sont tellement fréquentes chez l’homme qu’elles peuvent facilement donner lieu a la production d’antitoxine. Seulement dans cet exemple, il s’agirait encore d'un cas de pouvoir antitoxique acquis.

Les exemples que je viens de citer sommairement, ne peuvent nullement ébranler cette thèse générale que les phagocytes, pour remplir leur fonction microbicide dans l’organisme, doué d immunité naturelle, n’ont pas besoin d'une action [)réalable des humeurs pour neutraliser les toxines correspondantes.

Les faits et les opinions, analysés dans ces deux chapitres, nous donnent un tableau général des phénomènes qui se maniteslent dans l’immunité naturelle contre les microhes. Le trait dominant est représenté par la réaction phagocytaire qui s’observe dans toute 1 échelle animale et s’exerce vis-à-vis de parasites apparteîiant à tous les groupes microbiens, blette [)hagocytosc se manifeste non seulement

(1) Deutsche niedic. Wocheiischr., 1894, p. LiO.

(2) Zeitschrift fur Ifiifiiene, 1901. T. XXXVI, p. 299.

LE MÉCANISME DE L’IMMUNITÉ NAI’URELLE CONTRE LES MICRORES

par les macrophages, mais aussi à un degré très élevé par les micropliages (pii se [iréseiiteiit comme des cellules défensives par excellence contre les microbes. Leur fonctionnement se divise eu une série d’actes physiologiijues, vitaux, comme la sensibilité pour les microbes et leurs produits, les mouvemeuts amiboïdes cpii servent à 1 engloliemcnt des microbes, et en des processus chimiques ou [)bysico-cbimiques, comme la destruction et la digestion des microbes dévorés.

Les phagocytes entrent en lutte contre les microbes et en débarrassent 1 organisme, sans avoir besoin d’aucun concours préalable de la part des humeurs. La phagocytose, s’exerçant envers les microbes vivants et virulents, suffit pour assurer l’immunité naturelle. Le pouvoir bactéricide du sérum (jui, [leudant longtemps, servait de base à une théorie humorale de rimmuuité, ne représente (|u’une qualité artificielle, développée à la suite du dégagement de la microcytase des leucocytes, éclatés après la saignée. Le pouvoir aggbitinatif des humeurs normales ne joue aucun nMe marrpié dans l’immunité naturelle.

Les phagocytes, pour accomplir leur fonction, peuvent s’atta(juer aux microbes capables de produire leurs toxines. Une action antitoxi(]ue (juelconque vis a vis de ces poisons bactériens n est nullement nécessaire pour [)ermcttre 1 entrée en scène de la phagocytose.

lout l’ensemble des données, recueillies sur l’immunité naturelle conti’c les microbes, démontre bien cpie la destruction de ces parasites dans l'organisme réfractaire ne représente qu’un cas particulier de la résorption des éléments figurés.

OHAPITHE VI II

\l*i:iiai DKS FAITS SUR l’immunité

ACQT^ISF CONTRE LFS MICRORFS

La découverte des virus alléuucs et son application à la vaccination contre les maladies infectieuses . — Vaccination parles produits microbiens. \accinalion avec les sérums. — Immunité acquise de la grenouille contre la maladie p^'ocyanupic. Immunité acquise contre les vibrions. — Destruction cxtiaccllulaiic du vibrion cholérique. — Rôle de deux substances dans la production du phénomène de Pteiffer. — Spécificité des fixateurs. — La pbagolj'se et son rapport avec la destruction extracellulaire des vibrions. — Le rôle de la phagocytose dans 1 immunité acquise contre les vibrions. — Sort des spirilles de la fièvre récurrente dans l’organisme de cobayes immunisés. — Immunité aoejuise contre les microbes de la fièvre typhoïde et de la maladie pvocyanique. — Immunité acquise vis-a-vis des bacilles du rouget des porcs et du charbon. — Immunité acquise contre le Streptocoque. — Immunité acquise des rats contre le Trypanosome.

Certaines notions sur l’immunité acquise sont d’origine tout aussi ancienne cjue celles sur l’immunité naturelle. Comme, depuis ti ès longtemps, on savait déjà que 1 homme est par sa nature réfractaire a plusieurs maladies, très graves pour le bétail, de même on savait qu’après une première atteinte d’une maladie contagieuse, comme la xaiiole, la rougeole, la scarlatine, la fièvre typhoïde, etc., 1 homme acquiert une immunité durable. On connaissait que la môme règle s’applique aux animaux domestiques et que par exemple les bœufs, guéris de peste bovine ou les moutons, guéris de clavelée, deviennent réfractaires à ces maladies.

Les découvertes de la variolisation et de la vaccination, comme piocédéspour communiquerlarésistance de 1 homme contre la variole, ont faitnotalïlement progresser les connaissances sur 1 immunité acquise. Les recherches sur les propriétés du A^accin ont amené déjà quelques résultats impoFlants. Mais ce n’est que depuis les travaux de Ihisteur, exécutés avec scs collaborateurs, MM. Chamherland et Houx d’abord’ Thuillier, plus tard, qu'on a pu commencer l’étude de rimmunité acquise par la méthode vraiment scientifique. Le premier jalon dans cette série de découvertes qui ont inaugure une a oie si

Ai‘i;u(;ij i):-:s faits suk ltmmumte Acoui'ii-; conthk les microbes 2iy

féconde à la science et à l’art médical, a été posé par le fait de l’atténnation des microbes. Le petit coccobacille du clioléi'a des poules s'est trouvé apres plusieurs semaines de culture en bouillon notablement atténué dans sa virulence. 1‘asteur a eu Tidée de vérifier si les poules (]ui avaient bien résisté à l’inoculation de ces microbes atténués, avaient acquis une véritable immunité vis-à-vis du choléra des poules virulent. L’expérience confirma sa prévision et amena la découverte du vaccin contre cette maladie. Aussitôt on se mit à a|)pli(juer la méthode à d’autres éj)izooties infeclieuses et peu de temps après, l’asteur, Lbamberland et Houx trouvèrent le moyen de préserver des moutons et des bœufs contre le charbon bactéridien. Dans ce but, ils durent empêcher ce bacille de produire des spores (ce ({u'ils réussirent en le cultivant en bouillon à la température de i2o,o), car les spores fixent la virulence et em|)êchent ratténuation. Après avoir vaincu ce principal obstacle, l*asteur et ses collaborateurs ont vu leurs cultures, dépourvues de spores, s’atténuer sous rintluence de l’air et se transformeren vaccins. Ils ont pu decette façon jiréparer leurs deux vaccins charbonneux qui trouvèrent bientôt une application si large dans la pratique. Peu d’années plus tard, Pasteur et Thuillier ont trouvé les vaccins contre le rouget des porcs et, en collaboration avec MM. Houx et Granclier, Pasteur fit la première application de ses découvertes à la vaccination de l’homme contre la rage.

La voie ainsi ouverte fut parcourue par beaucoup d’autres savants et donna lieu à un grand nombre de découvertes remarquables. La vaccination avec des microbesest devenue méthode courante et trouva bientôt, entre les mains de MM. Arloing, Cornevin et Thomas, son application au charbon symptomatique ou bactérien. Le pas suivant dans cette marche progressive de la science fut réalisé par la découverte de MM. Salmon et Smith qui démontrèrent, pour la première fois, à propos du llog-Clioléra, la possibilité de vacciner non seulement avec des microbes, mais aussi avec des li(juides de culture, dans lesquels s’étaient développées ces bactéries. Ces liquides, cofnplètement débarrassés de microbes par filtration, préservaient les animaux d’expérience du Ilog-Choléra virulent. Cette découverte, au premier moment un peu indécise, fut bientôt confirmée et élargie par des travaux d’autres savants. MM. Heumer et Peiper l’étendirent à la maladie expérimentale des petits animaux de laboratoire, provoquée parle bacille typhique ; M. Charrin rappli(jua à la maladie (pi’il obtint avec le bacille du pus bleu. IMM. Chamberland et Houx préparèrent des

(JiiAi'iTUi': vin

vaccins avec des produits soluble^ du vibrion sc[)ti(]ue et du lîacdledu cbarljon syin])tomati(]ue. Depuis ces travaux, les vaccinations parles produits microbiens sont devenues courantes dans tous les laboratoires de recberebes, les vaccinations pratKjues (cbarbons bactéridien et bactérien, rouget des porcs, rnge)ayant conservé la méthode d inoculation des virus vivants.

L’histoire comparée de l’immunité acquise est encore très peu avancée. Les faits sur l’adaptation des organismes unicellulaires à toutes sortes d’inlluences nuisibles de nature physique ou chimique permettent de prévoir que l’immunité acquise est tout aussi générale chez les êtres vivants que l’immunité naturelle ; seulement, il est impossible, dans l’état actuel de la science, de confirmer cette hypothèse par des données précises et expérimentales. La cause de cet état imparfait réside dans la grande difficulté qui se présente pour exécuter des expériences sur des animaux inférieurs. La plupart des Invertébrés ne vivent pas assez longtemps en captivité et ne sont pas accessibles aux inoculations répétées, indispensables pour obtenir une immunité acquise bien manifeste contre les microbes. M. Kowalevsky ( 1) le célèbre zoologiste russe, a essayé de vaincre toutes ces difficultés en s adressant aux Myriapodes. Il a constaté d’abord quelesScolopendres, inoculées avec des bactéridies, en meurent, pendant les chaleurs de l’été, avec une quantité de bacilles charbonneux dans le sang. Mais lorsque la température ne dépasse pas I7“-18“, un assez grand nombre de ces Myr iapodes survivent. La même survie a été observée après l’injection du premier vaccin pasteurien. M. Kowalevsky a utilisé les Scolopendres, ayant résisté à la première injection de bactéridies, pour voir si elles avaient contracté une immunité ac(|uise. Les résultats n ont pas été absolument démonstratifs et M- Kowalevsky les a formulés dans la phrase suivante : (( Je ne puis donc pas dire que je suis arrivé à résoudre la question de la vaccination, qui me parait cependant très proba- )>le » (p. 607).

En présence de cette indécision, j'ai demandé à M. Mesnil de faire une nouvelle tentative, en se servant de Scolopendres et en les inoculant avec des bacilles charbonneux. Mais ces animaux se montraient si délicats et si peu capables de vivre longtemps dans les conditions artificielles de leur captivité, que l’essai a dû être bicnlèt al)andonne. J’ai tâché d’obtenir de meilleurs résultats avec des larves d Onjetes

(1) Archives de Zoohxjie eæpèrimenlale, 1S95, série. T. lit, p. 591.

AI’KliÇü I)KS FAITS SUR LTMMUMTÉ ACQÜISI'; GÜxXïKF LFS MIGROIIFS i'2l

?i(fsicor/Hs, mais ici encore je me suis heurté à des difficultés trop grandes. Ces insectes manitestaient une immunité naturelle al)Solue vis-a-vis de certains microbes, tandis cpie pour d’autres ils aecusaient nue sensibilité insurmontable. Il est de toute évidence (]ue l’immunité acquise ne doit pas s obtenir lacilement chez les Invertébrés.

11 a donc fallu remonter récbelle animale et s'adresser au.x Vertébrés « a sang’ froid ». Le choix s est arreté tout naturellement sur la grenouille. ,1 ai priéM. le l)"^ (iheorghiewski (I ),<jui ti’availlait dans mon laboratoire, d essayerde vacciner ces batraciens contre la maladie pyocyani(]ue. Je dois ilire d abord (jue le bacille du [)us bleu est pathogène pour la grenouille. Il la tue à la température ordinaire du laboratoire, ainsi qu’à celle de l’etuve, à Dans le premier cas,

la dose mortelle est beaucou[) plus forte (pie dans le second, mais il est toujours facile de [iroduire une infection mortelle. Sous ce rapport, le bacille [lyocyanique est donc beaucouj) plus avantageux pour l’étude (]ue la bactéridie ou tant d’autres microbes. M. Gheorghiewski vaccinait ses grenouilles vertes [ liana psciileii/a)^ habituées à vivre à l’étuve à 30“, en leur injectant tous les i à 7 jours des doses considérables de cultures pyocyaniques, chautlées à 8()** [lour tuer tous les microbes. Ouelques (3-4) semaines après, les grenouilles préparées devenaient plus résistantes vis-à-vis du bacille pyocyanique que les témoins, placés dans les memes conditions. Les grenouilles, inoculées avec la dose mortelle de bacilles vivants, manifestaient sûrement un certain degré d immunité acipiise, (juoiijue faillie, billes supportaient bien la dose sûrement mortelle pour les témoins ou meme une dose et demie, mais, mouraient dès (]u on leur injectait la dose deux fois mortelle. Le licpiide lymphatiipie des grenouilles vaccinées agglutinait faiblement (1 :2()-l :30) le bacille pyocyanique, en lui fournissant en môme temps un excellent milieu de culture. M. Gheorghiewsky a pu s’assurer que l'agglutination était insuffisante pour assurer l’immunité aux grenouilles. Aussi les bacilles agglutinés en amas se présentaient comme très virulents.

L examen détaillé des phénomènes qui se passent chez les grenouilles immunisées a révélé les faits suivants. Pendant les premiers moments, les bacilles, injectés dans le sac lymphatique dorsal, se trouvent libres dans le li([uide en conservant bien leur forme et sans se transformer en granules Les microbes se répandent avec rapidité

(I) Annuhs de rinislitiU Pasteur, I8!)ü. T. Mil, p.

CHAPITUK VllI

dans tout le corps, transportés parle courant lymphatique. Mais déjà très peu de temps après l'inoculation,, quelques leucocytes commencent à eng'loher les bacilles du pus bleu qui se ti-ansforment en boules dans l’intérieur de ces cellules. Plus tard, la réaction phagocytaire s’accroît et au bout de lü à 20 heures, tous les bacilles se trouvent déjà à l'intérieur des leucocytes. 11 a été facile de s’assurer que ces microbes ont été englobés à l’état vivant. Au bout de 48 heures après l’inoculalioii, on ne trouve plus dans la lymphe du sac dorsal de bacilles ni en dedans, ni en dehors des cellules. Mais, ensemencé sur desmdieux nutritifs, ce liquide donne des colonies du bacille pyocyani(jue jusqu a lo et même 18 jours après l’inoculation.

On peut conclure de ces faits que les Vertébia'S «à sang froid » sont capables d’acquérir rimmunité à un faible degré et (pie, dans cette immunité acquise, on constate une phagocytose prononcée, mais pas de pouvoir bactéricide des humeurs.

Afin de se rendre compte d’une laçon plus complète du mécanisme de rimmunité acquise, il est nécessaire de 1 observer chez des ^ ertébrés supérieurs, chez lest|uels on obtient tacilement cette immunité a un degré très élevé. Nous devons donc nous adresser aux mammitèies et passer en revue un nombre suffisant d exemples, avant de présenter aux lecteurs un résumé général de la cpiestion.

Pendant longtemps, les recherches sur 1 immunité accjuise se lésumaient presque uniquement à l’analyse des faits observés chez des animaux soumis aux vaccinations anticharbonneuses a 1 aide des deux vaccins pasteuriens. On a réussi à rassembler de cette façon un grand nombre de faits importants, dont les principaux doivent être présentés au lecteur. Seulement, avant d’aborder ce sujet, i\ est indispensable de donner une orientation générale sur Pimm unité acquise des animaux de laboratoire vis-à-vis des vibrions, car cet exemple domine pour ainsi dire tout le chapitre sur l’immunité acquise contre les

microlies.

Dans leurs recherches sur le pouvoir l)aetéricide des séiunis, MM. V. Behring et Nissen (1) ont examine entre autres plusieurs échantillons de sérums, provenant d’animaux vaccinés contre divers microbes. Tandis que, dans la majorité de leurs exemples, rimmunité acquise ne provoquait aucune augmentation do ce pouvoir, le sériuii sanguin de cobayes, bien immunisés contre le vibrion de Gamaleïa

(1) Zeitschrift fin' Ifijgiene, 1890. T. VIH, p. iHi.

[Vibrîo Metchnikovi)^ se montrait beaucoup plus Ijactéricide vis-à-vis de ce microbe que le sérum de cobayes neufs, sensibles. Ces auteurs arrivèreiita la conclusion que, dans Cimmuiiité acquise, au moins dans le cas du vibrion nommé, le principal ïaMc est accompli par une substance bactéricide qui se développe dans les humeurs des animaux vaccinés. Ils se contentèrent de cette constatation, sans avoir essayé d'établir la marche du phénomène de la destruction des vibrions dans rorganisme de cobayes vaccinés. C’est M. H. I‘feiffèr (1) qui, en collaboration avec M. Issaëtf, a cherché à combler cette lacune. Seulement, au lieu du vibrion de (lamaleïa, ces observateurs ont concentré leurs etlorts sur 1 étude de 1 immunité acquise des cobayes contre le vibrion cholérique. Comme ce microbe est en général moins virulent que le vibrion de (Tamaleïa, pour obtenir l’infection mortelle^ il faut 1 injecter non pas dans le tissu sous-culané, mais dans la cavité péiilonéale. Nous avons vu déjà dans le chapitre \ I (jue le vibrion cholérique, inoculé dans le péritoine du cobaye, y rencontre une vive opposition de la part des leucocytes qui saisissent les vibrions vivants et virulents et, les digérant, en débarrassent l’organisme. Mais, lorsqu on augmente la quantité des vdbrions, ceu.x-ci se multiplient, malgré la léaction phagoev taire ; on les voit pulluler dans la cavité péritonéale, d où ils envahissent les vaisseaux lymphatiques et sanguins et amènent la mort de 1 animal. Il est donc lacile de provoquer une infection mortelle chez le cobaye par le vibrion cholérhpie. Mais il est facile aussi de vacciner ces animaux contre cette maladie expérimentale. 11 n y a qu à leur inoculer une quantité non mortelle de vibrions cholériques vivants, ou liien à leur injecter une culture de ces microbes, tués par la chaleur, ou du liquide de culture, débarrassé des vibrions par tiltration. Tous ces procédés amènent. au bout de peu de temps, 1 immunité acquise des cobayes. Si, à ce moment, on leur retire un peu de sang et que l’on ajoute au sérum une petite quantité de vibrions cholériques, m vifrn, on pourra facilement constater leur ths[Kirition sous l’intliience de la substance bactéricide, dissoute dans le liquide. Sous ce rapport, il y a donc une grande analogie avec le fait établi par MM. v. Ilehring et Nissen au sujet du vibrion de Gamaleïa.

Lorstpie l'on injecte dans le péritoine de cobayes vaccinés une certaine quantité de culture cholérique qui renferme des vibrions viru-

1894. T. XVII, p. 335 el Deutsche medic. ^Y ochenschr . , 1896, pp. 97