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ALEXINE ET SENSIBILISATRICES. — OPSONINES. - CYTOLOGIE 373

B. - OPSONINES. — MESURE DE L'INDICE OPSONIQUE.

Sir Alm. E. Wrigbt et Douglas * avaient observé que la pAayocytose in vitro de certains microbes (tels que le staphylocoque doré) par les leucocytes ne se produisait qu'en présence de sérum normal et qu'elle n'avait pas lieu lorsque ces microbes étaient mis en présence des mêmes leucocytes débarrassés de toute trace de sérum par une série de lavages successifs. Ils en tirèrent cette conclusion que le sérum renferme certaines substances bactériolropiques qui préparent les microbes à être absorbés par les éléments phagocytaires et ils donnèrent à ces substances le nom d*opsonines (du mot grec: opsoneô, je prépare).

On savait déjà par les expériences de Dents et Leclef ^ que la phagocytose du streptocoque s'exerce avec beaucoup plus d'intensité en présence du sérum d'animal vacciné, et Metch^ikoff ^ avait émis l'idée que les sérums spécifiques devaient cette propriété excitante de t activité phagocy taire à des stimalines qui n'existent pas dans les sérums normaux.

C. Levaditi et Inmam * ont montré que les opsonînes des sérums normaux, qui sont détruites, comme l'avaient constaté dailleurs Wright et Douglas, puis Neufeld et Hûhne, par dix minutes de chauffage à 60'', sont identifiables à Talexine, tandis que celles des sérums spécifiques, qui sont thermoslabiles comme les sensibilisatrices, auraient une constitution complexe qui les rapproche de ces dernières. Elles déterminent des modifications physico-chimiques dans l'enveloppe des bactéries qui rendent celles-ci plus aptes à être englobées par les leucocytes.

Quoi qu'il en soit, je phénomène qu'elles traduisent est intéressant à étudier et susceptible dans certains cas de fournir des indications utiles. Dans l'infection tuberculeuse en particulier, il semble que la mesure de C indice opsonique, à la condition d'être ejjectuée et répétée par le même observateur j puisse parfois éclairer un pn^nostic ou servir de guide aux cliniciens au cours de là tuberculinotbérapie.

Malheureusement elle nécessite une technique délicate et compliquée* ce qui est un obstacle à son emploi dans la pratique courante.

Pour effectuer la mesure de l'indice opsonique d'un sérum, il faut mettre en présence :

i** Des leucocytes ;

•2** Une émulsion bacillaire convenablement préparée ;

3° Le sérum à étudier.

Ces trois éléments étant mélangés en parties égales, on les porte à

I. Proceed. Royal Society, 1904, LXXIV, p. 1^7. a. La Cellule, 1896, p. 177 (l^uvain).

3. L'immunité dans les maladies infectieuses, Paris, 1901, Masson, éd.

II. Société de biologie, 20 avril, 27 avril, 4 mai, 11 mai 1907.

l'étuve à 87° pendant quinze ou vingt minutes. On fait ensuite des préparations colorées au Ziehl à froid, puis au bleu de méthylène. On compte les bacilles contenus dans un certain nombre de leucocytes et on établit la moyenne du nombre de bacilles phagocytés par leucocyte. On obtient ainsi un chiffre qui indique le pouvoir opsonique du sérum considéré. Mais comme les conditions (concentration de la suspension de leucocytes et de l'émulsion bacillaire) changent fatalement d'une expérience à l'autre, les résultats obtenus ne sont comparables et ne prennent une valeur que si on les rapporte à un facteur constant, toujours le même dans toute la série des expériences. Ce facteur constant est représenté par un sérum normal, celui de l'observateur par exemple. Au pouvoir opsonique de ce sérum témoin, on compare le pouvoir opsonique des sérums pathologiques étudiés.

Le chiffre représentant le pouvoir opsonique d'un de ces sérums, divisé par le chiffre représentant le pouvoir opsonique du sérum témoin, donne Yindice opsonique.

I. — PRÉPARATION DES LEUCOCYTES. — Les leucocytes habituellement employés sont empruntés soit au sang humain, soit h Tex* sudat péritonéal du cobaye. L'expérimentateur emploie généralement ses propres leucocytes ; il lui suffît de se piquer avec un vaccinostyle la face dorsale d'un doigt, près de l'ongle, après avoir ligaturé le doigt à sa base. Environ 20 gouttes de sang sont recueillies dans un tube de centrifuge à fond effilé, préalablement garni de 10 ce. delà solution anticoagulante dont voici la formule :

Eau distillée 1.000 ce.

Chlorure de sodium 8 gr. 5

Citrate de soude f ^ gf*«

Il faut 8 ou 10 parties de cette solution au minimum pour une partie de sang.

On fait le mélange en renversant et redressant plusieurs fois le tube dont on a obturé l'orifice avec la pulpe du pouce. Il faut avoir soin d'éviter de secouer brusquement pour ne pas altérer les leucocytes.

On centrifuge, puis on lave le culot. Pour cela, on aspire avec une pipette à boule le liquide qui surnage. On verse dans le tube 10 cent, cubes d'eau salée physiologique que l'on mélange au culot en renversant le tube comme précédemment, et l'on centrifuge de nouveau. Cette opération est répétée trois fois. Puis on enlève tout le liquide. La partie la plus superficielle du culot contient les globules blancs. Afin de la séparer de la couche plus profonde formée des globules rouges, on incline le tube et, les leucocytes de la surface s'étalant, sont recueillis par aspiration dans une pipette spéciale à léline de caoutchouc (pipette de Wright), puis portés dans un tube à essai court, de très petit calibre.

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On peut encore se procurer des leucocytes en provoquant, chez le cobaye, la formation d'un exsudât péritonéal piar injection d'eau salée, de bouillon, etc. Une ou deux heures après, en piquant l'abdomen du cobaye tenu par un aide, le ventre tendu dirigé en bas, on prélève, à Taide d'une pipette coudée à pointe effilée, un peu de l'exsudat riche en leucocytes. On recueille celui-ci dans de l'eau citratée et on le traite comme il a été dit ci-dessus pour le sang.

n. — PRÉPARATION DE UÉMULSION BACILLAIRE. ~ On prend une jeune culture en bouillon glycérine, âgée de quatre à cmq semaines. On la stérilise à l'autoclave à ioo° pendant 20 minutes. On jette sur un filtre en papier et on lave les bacilles en versant sur le filtre de l'eau salée physiologique jusqu'à ce que celle-ci s'écoule incolore. Une. petite quantité de bacilles (environ i centigramme) est alors prélevée sur le filtre et déposée dans un mortier d'agate. On broie doucement et on émulsionne en versant goutte à goutte, tout en continuant le broyage, de l'eau physiologique à l'aide d'une pipette effilée. On obtient ainsi une émulsion laiteuse que l'on rend encore plus homogène en l'agitant dans un flacon stérile avec des perles de verre. On la centrifuge ensuite (pendant quelques minutes seulement) pour la débarrasser des grumeaux.

Cette émulsion homogène est diluée avec de l'eau salée hypertonique, à 1,5 p. 100 (c'est le taux le plus favorable), jusqu'à l'obtention d'une concentration microbienne déterminée qu'on apprécie d'après son opalescence, laquelle doit être très légère. Il faut pour cela environ 5o ce. d'eau salée pour un centigramme de bacilles.

L'émulsion ainsi préparée peut être stérilisée à io5° et conservée en tubes scellés qu'on aura soin de bien secouer avant chaque expérience pour mettre les bacilles en suspension aussi fine que possible.

III. — PRÉPARATION DU SÉRUM A ÉTUDIER. — On se procure le sang chez l'homme par piqûre de la face dorsale du pouce, ainsi qu'il a été dit précédemment. Le sang est aspiré par capillarité dans un petit tube à extrémités effilées et dont Tune a été recourbée. Quelques gouttes suffisent. On laisse pendant deux ou trois heures le sérum se séparer du caillot et on sectionne le tube au couteau à verre au moment de l'usage. Chez les animaux de laboratoire (lapins, cobayes) et aussi chez le bœuf, c'est par piqûre de l'oreille qu'on prélève le sang, en piquant au niveau d'une des veinules que l'on voit par transparence.

Il faut que le sérum soit clair, parfaitement exempt de globules rouges, car la présence de ceux-ci fausse complètement les résultats (A. Fleming). Il peut être conservé à la glacière pendant 6 à 7 jours, ce qui permet d'utiliser en une seule séance les sérums recueillis pendant toute une semaine par exemple chez le même sujet ou chez divers malades.

L IKFECTIOM BACILLAIRE

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IV. — TECHNIQUE DE LA RÉACTION. Possédant les trois éléments nécessaires, leucocytes, émulsion bacillaire, sérum^ il reste à les mettre en présence.

On prépare un certain nombre de pipettes capillaires. Il est commode et économique d'employer pour cela des segments de tube de verre de lo à 12 centimètres de longueur tels que ceux qui servent à fabriquer les pipettes dans les laboratoires. On les élire en leur milieu en prenant soin que Teffilure soit bien régulièrement calibrée. On sec- — tionne au milieu de la partie effilée et on obtient ainsi deux pipettes de calibre égal.

A deux centimètres de la pointe ouverte on marque un trait au crayon bleu. On adapte à la pipette une tétine spéciale en caoutchouc, à soupape, qui sert à l'aspiration

Fig. a6. — Mesure de Vindice opsonique par la méthode de Sir A. \N right. I. Technique pour le prélèvemeut du sang au doigt, a. Pipettes de Wright pour la mesure de l'indice opsonique.

A. Pipeite préparée pour l'usage.

B. Pipette contenant en i) émulsion bacillaire.

a) émulsion de leucocytes.

3) sérum à étudier.