RECHERCHE ET DÉTERMINATION DES MÉNINGOCOOUES

Recherche.

La recherche des méningocoques s'effectue dans les différents produits pathologiques qui les renferment.

Dans le mucus rhino-pharjmgé. — L'anatomie pathologique et les recherches bactériologiques ont montré que c'est, non pas les fosses nasales, mais le rhino-pharynx qui donne asile au germe infectant. C'est là qu'il se cantonne de préférence et qu'il faut aller le chercher pour le trouver.

I. Prélèvement. — On fait ouvrir la bouche du sujet, une spatule abaisse la langue ; de la main droite, on introduit derrière le voile du palais un écouvillon d'ouate stérile, monté sur une simple tige de métal, coudée à l'extrémité qui la porte, à angle légèrement obtus. Là, on imprime à l'appareil quelques mouvements d'oscillation à droite et à gauche, et on le retire, enduit de mucus (fig. 18).

On peut pratiquer un examen microscopique direct de ce mucus

Colorer les frottis par la méthode de Gram composée.

Fig. 18. — Prélèvement du mucus rhino-pharyngé dans le rhino-pharynx.

Mais, de l'avis de tous les auteurs qui se sont occupés de la question, cet examen microscopique direct est dénué de toute valeur diagnostique car le rhino-pharynx normal ou pathologique donne asile à une foule de germes qui, tout en ressemblant au méningocoque, lui sont étrangers (page 107). Il est dore impuissant à les différencier; seule l'étude des cultures et des réactions biologiques en est capable.

IL Isolement. — Dans trois ou quatre boites de Pétri, on coule de lagélose-ascite (agar : 3 parties ; ascite : 1 partie). Sur la première d'entre elles, on dépose une parcelle du mucus recueilli. A l'aide d'un agitateur de verre coudé, ou de préférence à l'aide d'un ose de platine de forme triangulaire, on l'étalé sur toute la surf ace du milieu ; sans recharger l'ose, on opère de même successivement sur les autres boîtes. On met à l'étuve à 31^ pendant vingt-quatre ou quarante-huit-heures (1) ; au bout de ce temps on observe : on constate habituellement de nombreuses colonies dont il va falloir examiner les plus suspectes. Il convient de choisir la boite où elles sont le plus isolées..

Prélèvement et examen microscopique des colonies. — On porte tout particulièrement l'attention sur les colonies rondes, un peu surélevées, transparentes, grisâtres, de 1 à 3 millimètres de diamètre (fig. 20). Ce sont les caractères habituels des colonies isolées de méningocoques.

A l'aide d'une ose droite très fine on prélève une parcelle de chacune d'elles ; on l'émulsionne dans une gouttelette d'eau déposée sur une lame de verre (2) ; on note en passant si le trouble dû àl'émulsion est homogène ou non, quelle teinte il présente, constatations qui peuvent servir à la différenciation ultérieure. Sécher, fixer, colorer par le Gram avec suraddition de Ziehl dilué ; observer au microscope.

Il s'en faut que toutes les colonies présentant l'aspect indiqué soient constituées par du méningocoque : les unes montreront des bâtonnets (Gram positif ou négatif), d'autres des cocci en amas ou chaînettes, voire

(1) Au sujet de cette technique se pose une question pratique de la plus haute importance :

On a remarqué (V, Lingelsheim, Bruns et Hohn) que quand l'ensemencement était pratiqué sitôt après le prélèvement, on obtenait un pourcentage de résultats positifs bien supérieur à celui qu'on observait quand un intervalle de plus de vingt-quatre heures, même moins, séparait les deux opérations : c'est qu'en effet, le méningocoque présente une grande fragilité à la dessiccation. On a cru remédier à ce grave inconvénient en prescrivant l'expédition de chaque écouvillon chargé de mucus dans un tube contenant une petite quantité de bouillon stérile, destiné à entretenir l'humidité ; mais, en ce cas, les germes associés au méningocoque pullulent durant le transport et entravent encore la vitalité de ce germe. Bruns et Hohn conseillent de faire les envois dans des tubes entourés de glace.

Il semble qu'il soit préférable d'opérer comme suit : le médecin praticien fait lui-même sur place les prélèvements et les ensemencements avec le matériel qui lui a étéexpédié; le matériel ainsi ensemencé est ramené, entouré de glace, directement, par les voies les plus rapides, au laboratoire de bactériologie, qui le met de suite à l'étuve. En agissant ainsi l'intervalle entre l'ensemencement et la mise à l'étuve est aussi limité que possible, et donne les meilleures garanties désirables.

(2) Il est commode, pour gagner du temps, de faire sur la lame une dizaine de ces préparations. Il est même bon d'y ajouter sur un coin de la lame une émulsion de microbes prenant le Gram (staphylocoque par exemple), servant ainsi de témoin, pour être sûr que la coloration est bien effectuée. On colore ainsi en même temps toutes ces émulsions, La figure 19 montre comment on peut disposer les préparations réunies sur la même lame, toutes doivent présenter la même minceur pour que les résultats du Gram soient comparables.

RECHERCHE DES MÉNINGOCOQUES 111

même des cocci en grain de café prenant le Gram (il s'agit alors de Diplococcus crassus ou pseudo-méningocoque de J aeger, que l'on sait actuellement être totalement différent du vrai méningocoque) ; quelquefois encore on peut rencontrer du pneumocoque dont les grains, pendant les premières heures de son développement, peuvent prendre une forme rappelant les cocci de Weichselbaum, mais ils prennent le Gram. Il va de soi que toutes ces colonies devront être éliminées sans leur faire subir des épreuves ultérieures : à coup sûr, elles n'appartiennent pas au méningocoque.

A côté d'elles enfin, on en rencontrera dont les cocci en grains de café n'auront pas pris le Gram, seront de volume uniforme ou variable, isolés, ou en diplocoques ou en tétrades. Il peut s'agir de méningofcoque vrai, mais aussi de germes qui, bien que

■présentant un aspect Fig. 19. — Dispositif pour l'examen de nombreuses

Y, . . , ^ colonies suspectes.

identique, s en écartent

par d'autres caractères

plus importants, et lui sont complètement étrangers. Parmi ceux-ci, on

connaît, en effet, le Micrococcus catarrhalis, le Diplococcus siccus, le

Micrococcus pharyngis cinereus^ les trois variétés Diplococcus pharyngis

flavus /, // et ///. A cette liste il convient d'ajouter, d'après Ghon, le

gonocoque qu'il a rencontré dans le rhino-pharynx de nourrissons issus

de mères infectées par ce même germe.

Or tous ces microbes, sans montrer, au point de vue morphologique, une analogie complète avec le vrai méningocoque, présentent entre eux des différences trop minimes, trop contingentes pour permettre de les diagnostiquer. Il sera néanmoins indispensable d'en pratiquer l'examen microscopique direct pour donner une orientation aux épreuves qui doivent suivre ; et Von poursuivra systématiquement V étude des colonies qui montreront des cocci, décolorés par le Gram, plus ou moins volumineux, isolés en diplocoques et en tétrades. Seules elles devront être considérées comme suspectes. Leur identification complète ne pourra être effectuée qu'après un nouvel ensemencement, pour en étudier les caractères de cultures, d^ agglutination, et leur pouvoir fermentatif sur les sucres.

Ensemencement. — Ces colonies, une fois examinées et repérées sur le verre de la boîte de Pétri (par le crayon gras, par exemple), sont toutes ensemencées sur tubes inclinés d'agar-ascite. Au bout de vingt-quatre ou quarante-huit heures au plus de séjour à l'étuve à 37°, la culture a poussé ; on en note les caractères. Elle va servir de point de départ pour les recherches ultérieures.

Dans la circulation. — On pratique une hémoculture dans les conditions habituelles, et on ensemence 4 à 5 centimètres cubes de sang dans un ballon de 250 centimètres cubes de milieu favorable :

soit bouillon-ascite classique,

soit bouillon à l'œuf (page 76),

soit bouillon Martin glucose (page 77).

Quand la culture a été fertilisée, pratiquer un isolement sur tubes de gélose-ascite, comme précédemment, pour soumettre ensuite à l'identification les colonies qui ont poussé; un tel isolement partant de la culture est indispensable pour éviter des causes d'erreur provenant d'une souillure

Fig. 20. — Boîte de Pétri avec gélose-ascite ensemencée avec du mucus rhino-pharyngé. Au milieu de colonies diverses, on perçoit six colonies de méningocoque, M, semi-transparentes (grandeur naturelle).

accidentelle toujours possible, ou d'une infection secondaire se surajoutant à la septicémie méningococcique.

Dans le liquide céphalo-rachidien. — Ponction lombaire. — On pratique, suivant la technique usuelle, une ponction lombaire qui donne issue à du liquide céphalo-rachidien, louche et opalescent, ou clair et limpide.

Centrifugation. — Quel que soit son aspect, on soumet le hquide à la centrifugation pendant quinze à vingt minutes : un culot blanchâtre ou grisâtre se forme au fond du tube, alors que la partie liquide superficielle est claire et limpide.

Examen microscopique. — Après décantation, à l'aide d'une pipette effilée, on prélève une parcelle du culot, et on l'étalé en couche mince sur plusieurs lames de verre.

Après dessiccation, fixer par l'alcool-éther, et colorer par la thionine phéniquée ou de préférence par la méthode de Gram, avec suraddition de fuchsine de Ziehl diluée.

RECHERCHE DES MÉNINGOCOQUES 113

Au microscope, outre des leucocytes dégénérés (polynucléaires le plus fréquemment), on constate des cocci en grains de café, ne prenant pas le Gram, intracellulaires ou extracellulaires. Ce seul examen ne permet pas de préjuger de leur nature : il peut s'agir de méningocoques, comme aussi de germes similaires. L'isolement s'impose pour qu'on puisse, par des réactions biologiques, caractériser ce germe, suspect à l'examen direct.

Isolement. — On a plusieurs procédés à sa disposition pour l'ensemencement du liquide céphalo-rachidien :

10 Procédé classique (ancien). — On ensemence abondamment en surface le culot de centrifugation soit sur tube de gélose-ascite, soit sur boite de Pétri dans laquelle ce miheu a été préalablement coulé. A défaut de gélose-ascite, employer un milieu succédané (page 76).

On porte à l'étuve à 37° pendant vingt-quatre heures ; des colonies ont poussé après ce délai. En prélever une parcelle, l'émulsionner dans une gouttelette d'eau déposée sur une lame de verre. Après dessiccation et filtration, colorer par le Gram et le Ziehl combinés.

Si la colonie examinée révèle la présence d'un coccus en grain de café ne prenant pas le Gram, la repiquer sur un tube de gélose-ascite ; cette nouvelle culture permettra l'identification ultérieure (si la culture venant directement de l'ensemencement du Hquide céphalo-rachidien est pure et assez abondante, on peut, pour gagner du temps, l'utihser immédiatement pour l'identification).

Dans un certain nombre de cas, surtout quand le liquide céphalo-rachidien est examiné plusieurs heures après son prélèvement, ces moyens de recherche peuvent ne donner aucun renseignement : ou bien l'examen microscopique ne révèle l'existence d'aucune bactérie (faire néanmoins l'ensemencement), ou bien l'ensemencement reste stérile.

Enfin il arrive fréquemment que, même si la recherche précédente a été faite dans les conditions les plus favorables, les résultats restent néanmoins négatifs. C'est qu'en effet, avec la méthode précédente, si large qu'il soit, l'ensemencement ne porte que sur une partie minime du culot de centrifugation et ne peut révéler que le nombre habituellement restreint des germes qu'il contient. La proportion de ces cas négatifs est encore assez élevée ; aussi le chnicien n'étant pas éclairé sur la nature du germe infectant ne peut mettre en œuvre la thérapeutique spécifique qui convient.

Aussi a-t-on recherché en de nombreux laboratoires un procédé capable de donner des résultats plus constants.

20 Procédé de Tribondeau.— Soit le hquide céphalo-rachidien obtenu par ponction lombaire (10 à 15 centimètres cubes environ). En prélever 5 à 10 centimètres cubes pour un ensemencement total ; le restant sera soumis à la centrifugation pour l'examen microscopique direct et la mise en culture du culot.

a) Culture totale. — Procédé de choix d'après l'auteur.

Couler dans une grande boîte de Pétri de la gélose-ascite. Après solidification, verser sur ce milieu 5 à 10 centimètres cubes de liquide céphalo-rachidien venant d'être obtenu par ponction lombaire. Placer la boîte à plat, dans l'étuve àS?^. Au bout de quelques heures (six heures environ), donner à la boîte de Pétri un

DopTER. — L'Infection méningococcique. 8

114 B.-VCTÉRIOLOGIE

léger degré d'obliquité, de manière que le liquide céphalo-rachidien se collecte dans l'a partie déclive en laissant à découvert plus de la moitié de la surface du milieu. Dès la seizième ou dix-huitième heure après l'ensemencement, on observe des colonies de méningocoques disséminées dans toute la zone émergente, et confluant souvent en bande le long de la limite du liquide.

Ce procédé parait donner des résultats supérieurs à ceux de la méthode classique : l'ensemencement est en réalité plus abondant, puis le liquide apporte à la culture un complément de substances nutritives.

h) Culture du culot de centrifugation.

Sur le culot de centrifugation, dont on a prélevé aseptiquement une parcelle en vue de l'examen microscopique direct, verser à la place du liquide surnageant qui a été décanté, 2 à 3 centimètres cubss de bouillon ordinaire (on peut avantageusement utiliser le bouillon-ascite, ou le bouillon à l'œuf, ou le bouillon Martin glucose). Emulsionner le culot dans ce milieu liquide, et placer à l'étuve à 37°. Dès la seizième heure, le pus s'étant déposé au fond du tube, le liquide surnageant est parfois trouble et contient des méningocoques ; il peut rester clair, mais l'examen du dépôt montre que des méningocoques s'y trouvent en abondance.

D'après Tribondeau, d'une façon générale, le procédé serait moins fidèle que le précédent. En certains cas, cependant, il donne des résultats positifs alors que la culture totale en boîte de Pétri est restée négative ; ensemencer alors sur tubes de gélose-ascite la culture en bouillon qui a été fertilisée, les colonies qui fructifieront devant servir à l'identification.

3^^ Procédé DE M. Nicolle, Debains et Jouan. — Ces auteurs associent pour le même ensemencement deux méthodes :

a) La méthode classique, où la gélose-ascite est remplacée par la gélosesérum (formolée).

h) La culture en masse en bouillon Martin glucose. Dans ce but, ils ensemencent le liquide céphalo-rachidien dans un tube contenant ce miheu (un tiers de liquide rachidien pour deux tiers de milieu) ; ils conseillent d'incliner dans l'étuve le Hquide ensemencé afin d'obtenir, par une bonne aération, la croissance rapide des germes, a Celle-ci s'effectue en seize à dix-huit heures, et la culture obtenue permet l'identification des microbes et de leur type (agglutination). »

Ce milieu donne un pourcentage élevé de résultats positifs, car les germes contenus, dans les leucocytes et les dépôts fibrineux sont libérés facilement et y croissent sans entraves, en présence de matières nutritives abondantes.

Il présente toutefois l'inconvénient de favoriser la culture des souillures accidentelles qui prennent le pas sur la culture du méningocoque.

Dans les viscères. — Au niveau des viscères, le prélèvement est simple; il s'effectue comme pour la recherche microbienne dans toute maladie infectieuse. Une pipette stérile aspire le produit pathologique au niveau de l'endocarde, du péricarde, du poumon, de la plèvre, des articulations, etc.