MICROBES
1— ( Iz;
ce
Méningocoques A, B,C,D
Micrococcus catarrhalis. .
Micrococcus cinereus. . . .
Diploc. phar, jlav. J . . . .
Diploc. phar. jlav. II . . .
Diploc. phar. flai>. III . .
Diplococcus siccus
Diplococcus crassus
Gonocoque
II. Epreuve de l'agglutination. — La culture sur milieu solide du germe qu'il faut identifier doit être soumise à l'épreuve de l'agglutination avec chacun des antisérums correspondant aux types connus de méningocoque. Cette recherche doit être faite par la méthode macroscopique. Plusieurs procédés peuvent être employés.
P Procédés extemporanés. — a. Procédé de M. Nicolle, Debains et Jouan. — Ces auteurs opèrent de la façon suivante :
D'une culture de dix-huit à vingt-quatre heures sur gélose-ascite du germe isolé de l'organisme, prélever une anse de platine bien remplie (anse de 2 millimètres de diamètre), l'émulsionner dans 4 centimètres cubes d'eau physiologique.
La densité de cette émulsion correspond à celle obtenue par le mélange de 1 centigramme de corps microbiens dans 20 centimètres cubes d'eau.
Répartir l'émulsion dans 4 petits tubes à agglutination (tubes de 8 millimètres de diamètre) à raison de 1 centimètre cube par tube.
Ajouter respectivement dans chacun d'eux 1/20 de sérum antiméningococcique anti-A, B et C. On peut aussi compter 19 gouttes d'émulsion microbienne par tube, auxquelles on ajoute une goutte, de même volume, de sérum (il va de soi qu'on peut rechercher l'agglutination à des taux plus élevés : 1 /50, 1 /40). Adjoindre un tube témoin avec du sérum normal aux mêmes taux.
Les tubes sont aussitôt bouchés par un tampon serré de coton cardé, agités dans le sens de la hauteur à plusieurs reprises afin de hâter l'agglutination.
En cas de résultat positif, cette agglutination est perceptible à la loupe, de 5 à 15 minutes après le début de l'épreuve ; elle s'accroît dans la suite au point que les amas sont nettement visibles à l'œil nu.
b. Procédé de Gordon (1). — A l'aide d'une fine pipette, déposer sur une
(1) Gordon, Méningite cérébro-spinale : un procédé clinique de détermination du type méningococcique infectant, [The Lancet, 24 mai 1919).
RECHERCHE DES MÉNINGOCOQUES 119
lame une goutte de sérum ; à côté de chaque goutte, déposer ensuite une goutte d'émulsion microbienne. Mélanger et examiner à la loupe. En cas d'agglutination positive des amas se forment immédiatement.
On peut ainsi, si l'agglutination est négative dans les conditions précédentes, mélanger l'émulsion microbienne avec 2, 3, 4 et même au besoin 10 à 12 gouttes.
Il semble que ce procédé ne puisse donner de garanties suffisantes sur la valeur des résultats et notamment la spécificité de l'agglutination. Gordon lui-même est obligé de reconnaître qu'il ne dispense pas du procédé ordinaire.
c. Procédé de Warren-Crowe (1). — Procédé un peu complexe, analogue à celui qu'on utilise pour la détermination de l'index opsonique.
1° Aspirer avec une pipette une petite quantité de solution de citrate de soude à 10 p. 100, puis de sang prélevé sur un sujet normal par piqûre du doigt, de manière à avoir environ une partie de solution citratée pour six ou sept de sang ; mélanger.
2o Emulsionner une culture jeune du microbe à identifier dans une solution à 1,5 p. 100 de sel marin. L'émulsion doit être épaisse.
• 3° Prendre une pipette opsonique sur laquelle on marque d'un trait un certain volume pris pour unité, et aspirer :
Un volume de sang citrate,
Un volume de sérum,
Un volume d'émulsion.
Mélanger, sceller, laisser à l'étuve dix minutes environ, pendant lesquelles on prépare le tube témoin avec sérum normal. Reprendre ainsi chaque tube, bien mélanger son contenu et faire une préparation comme pour la détermination de l'index opsonique ; fixer et colorer à la thionine phéniquée, par exemple.
Dans les préparations correspondant au sérum normal, les microbes restent isolés; dans celles correspondant à l'antisérum, les germes sont tous réunis en amas, rassemblés au bord de la préparation.
La complexité de la technique, surtout quand on a de nombreux germes à identifier, est de nature à limiter beaucoup l'emploi de ce procédé.
2° Procédé lent (classique). — Disposer une série de tubes à essai destinés à recevoir le mélange sérum-microbes. Théoriquement il suffit de quatre tubes où le même microbe est mis en contact du sérum normal, puis dessérums anti-A, B et G, tous dilués à 1 p. 100. Mais en raison de la fréquence des coagglutinations et pour éviter de nouvelles recherches semblables à des taux plus élevés pour permettre une interprétation des résultats, il est préférable d'expérimenter d'emblée sur une série de quatre à cinq tubes par sérum.
On préparera donc :
lo Une série de cinq tubes pour le sérum anti-A à 1 /lOO, 1 /200, 1 /300, 1 /400, 1 /500.
2° Une deuxième série de cinq tubes pour le sérum anti-B aux mêmes taux successifs.
3° Une troisième série pour le sérum anti-C (mêmes taux).
4° Une quatrième série pour le sérum normal (mêmes taux). On peut alors opérer de deux façons :
(1) Warren Crowe, Quelques aspects de la question de la méningite cérébro-spinale [The Lancet, 20 novembre 1915, p. 1127).
BACTERIOLOGIE
a] Ou bien verser dans chaque tube 1 centimètre cube du sérum dilué aux taux précédemment indiqués, puis émulsionner dans chacun une anse de la culture sur gélose-ascite, âgée de vingt-quatre heures.
b) Ou bien émulsionner la culture dans 10 centimètres cubes d'eau physiologique (pour l'épreuve précédente, il faut au moins deux tubes de cultures) ; en verser 9/10 de centimètre cube dans chaque tube, puis 1 /lO de centimètre cube d'une dilution de sérum à 1 /lO, 1 /20, 1 /30, 1 /40, 1 /50.
Porter à l'étuve à 37° pendant vingt-quatre heures et observer.
Voici, sous forme de tableaux, les constatations que l'on peut être appelé à faire :
Première éventualité.
S. anti-A
■ — normal
Il n'y a aucun doute, le méningocoque à déterminer appartient au type A.
Deuxième éventualité.
S. anti-A
— normal
Ici le germe est agglutiné par tous les sérums, mais à des taux différents ; mais l'agglutination dominante est obtenue avec le sérum anti-A. Le ijiéningocoque appartient au type A.
Troisième éventualité.
S anti-A
— normal
Même constatation que précédemment, mais l'agglutination dominante est donnée par le sérum anti-B. Le méningocoque appartient au type B.
RECHERCHE DES MÉNINGOCOQUES
Mf
Au cas où l'agglutination dominante serait fournie par le sérum anti-C, va de soi que le méningocoque appartiendrait au type C.
Quatrième éventualité.
S. anti-A
— normal
Le cas est plus délicat. Ce n'est certainement pas un A. Pas d'agglutiation nettement prédominante entre les sérums anti-B et C. Impossible e savoir auquel des deux types B ou G le méningocoque appartient. A lus forte raison si, comme le fait se présente parfois, les agglutinations ont égales.
Ce simple exposé est de nature à montrer les inconvénients de cette méthode.
, 10 Manipulations assez longues pour le laboratoire : il faut vingt tubes pour cette recherche.
2^ Il faut attendre vingt-quatre heures pour avoir les résultats. 3*^ Quand deux germes présentent des agglutinations égales ou presque égales (quatrième éventuahté), la détermination d'emblée est impossible. Aussi est-il préférable d'utihser le procédé qui consiste à utiliser les antisérums préalablement saturés par les germes hétérologues.
3° Procédé des sérums saturés. — Préparation des sérums saturés. — Le but à poursuivre est le suivant : libérer chaque sérum anti-A, B et G de ses agglutinines hétérologues pour ne lui laisser que ses agglutinines homologues.
Dans ce but, le sérum anti-A doit être saturé par les méningocoques B et G ; le S. anti-B par les méningocoques A et G ; le S. anti-G par les méningocoques A et B.
Prenons pour exemple la saturation du S. anti-A :
1° Ensemencer une boîte de Roux contenant de la gélose à 2.5 ou 3 p. 100 avec un méningocoque B ; étuve à 37° pendant vingt-quatre heures.
2° A la sortie de l'étuve, enlever de la boîte l'eau de condensation ; verser 10 centimètres cubes d'eau physiologique stérile ; racler et émulsionner d'une façon homogène.
3° Prélever 9 centimètres cubes de l'émulsion que l'on verse dans un tube à centrifuger ; ajouter 1 centimètre cube de sérum anti-A non chauffé. Mélanger. Abandonner vingt-quatre heures à la température du laboratoire.
40 Centrifuger jusqu'à éclaircissement complet du sérum dilué surnageant.
50 Décanter ce sérum et le verser dans une boîte de Roux ensemencée la v.iUe à l'aide d'un méningocoque G. Emulsionner comme précédemment.
Abandonner vingt-quatre heures à la température du laboratoire.
6° Centrifuger. Décanter le sérum.
Ce sérum dilué à 1/10 a été dépouillé successivement de ses agglutinines pour les méningocoques B et C ; il a conservé ses agglutinines pour le ménini^ocoque A.
Même technique pour saturer les sérums anti-B et anti-G, en utiUsant
BA.CTÉBIOLOGIÊ
les méningocoques qui doivent fixer les agglutinines hétérologues de chacun et laisser intactes les agglutinines spécifiques.
Epreuve de V agglutination à Vaide de cette méthode (Dopter et Dujarric de la Rivière). — Les coagglutinines étant éliminées, il n'est plus indispensable d'employer les nombreux tubes destinés à déterminer le taux limite d'agglutination avec chacun des sérums. Trois tubes seulement sont nécessaires, contenant respectivement les sérums anti-A, B et C, saturés comme il a été dit, et que l'on n'a besoin de diluer qu'à un taux unique.
Deux procédés peuvent être utiUsés :
1^ Procédé lent. — C'est le procédé lent, classique (page 119) dans lequel les sérums neufs sont remplacés par les sérums saturés.
Dans les trois tubes on verse l'émulsion du germe à identifier, puis chaque sérum anti-A, B et G dont la dilution au 1 /lO est portée à 1 /lOO au total. Mise à l'étuve à 37**, et observation des résultats au bout de 24 heures.
Avec une saturation bien pratiquée, l'agglutination ne se produit que dans un seul tube, celui qui contient la variété du sérum correspondant au germe que l'on cherche à identifier ; le contenu des deux autres tubes reste homogène, évitant ainsi toute erreur d'interprétation ; la nature du sérum contenu dans le tube où l'agglutination est positive indique la variété cherchée des méningocoques.
Le tableau ci-dessous figure les éventualités que l'on peut être appelé à observer ainsi que les résultats qui en découlent.
S. anti A saturél/100
S. anti B saturél/100
S. anti C saturél/100
Résultat
Méningocoque à déterminer
= Tvpe A.
= Type B.
= Type C.
2® Procédé rapide. — Les résultats donnés par l'épreuve précédente sont précis, mais tardifs. Il est préférable d'employer un procédé beaucoup plus rapide :
Dans trois tubes on verse 1 centimètre cube d'une émulsion obtenue comme précédemment, en raclant une culture entière en tube d'agar-ascite dans 10 centimètres cubes d'eau physiologique ; puis, dans chacun d'eux, 1 centimètre cube de chacun des sérums saturés dont la dilution a été réalisée à 1 /lO, ce qui porte la dilution sérique de chaque tube à 1 /20. Mise à l'étuve à 370.
Si la culture n'est pas assez abondante pour obtenir le louche désirable, on peut en prélever une anse de platine et l'émulsionner dans chaque tube contenant 1 centimètre cube de sérum saturé dont la dilution-mère (1 /lO) a été portée à 1 /20 par addition d'un volume égal d'eau physiologique.
Grâce à cette concentration (1 /20) qui ne peut donner de résultats nets qu'à la faveur de la saturation préalablement opérée, la réaction peut être observée au bout de deux heures de séjour à l'étuve : comme avec le procédé lent, l'agglutination n'est positive que dans un seul tube, et sa lec-
RECHERCHE DES MÉNINGOCOQUES 123
^ure est aussi nette. L'observation macroscopique suffit, point n'est besoin de recourir à l'usage de la loupe.
Sans être extemporané, ce procédé, qui ne perd aucunement en précision ce qu'il acquiert en rapidité, fournit donc une réponse précise dans un délai très court ; il permet de gagner un temps précieux en vue du diagnostic à formuler et de l'intervention thérapeutique spécifique.
Il semble que ce soit le procédé de choix à adopter.
Voici enfin, à titre de renseignement, un procédé qu'Olitsky a imaginé pour la recherche de l'agglutination sur les méningocoques provenant des porteurs de germes :
Procédé d'Olitsky, applicable a la recherche des porteurs de GERMES. — Du bouillon glucose à 1 p. 100, additionné de 5 p. 100 de sérum normal de cheval non chauffé, est réparti en tubes à hémolyse, à raison de
I centimètre cube de mélange par tube.
Chaque colonie suspecte est ensemencée isolément dans chaque tube. Le tout est porté à l'étuve à 37°. La plupart des germes qui pourraient prêter à confusion sont les Dipl. pharyngis flaç^us I, II et III, Dipl. siccus, M. catarrhalis, et le bacille de l'influenza. Or, ce dernier ne pousse qu'en présence de sang; les autres poussent dans ce milieu, plus ou moins fortement agglutinés ; seul, M. catarrhalis détermine un trouble dense et donne souvent une pellicule àla surf ace.
Sur bouillon glucosé-sérum, les méningocoques ne troublent que légèrement le milieu, tout en formant un léger dépôt au fond du tube ; ce dépôt s'émulsionne en outre uniformément dans le liquide.
Après douze heures de séjour à l'étuve, on peut déjà, d'après les caractères précédents, éliminer les tubes qui ne renferment sûrement pas le méningocoque. Au contenu de ceux qui semblent suspects, il suffirait d'ajouter dans chaque tube 0 cmc. 1 de sérum anti-méningococcique polyvalent, dilué à 1 /lO. Après deux heures de séjour à l'étuve à 37°, on observe l'agglutination. Si elle est positive, il s'agit d'un méningocoque ; si elle est négative, il s'agit d'un autre germe.
Pour connaître le type de méningocoque isolé, il faut utiliser par germe quatre tubes, dans lesquels on verse respectivement des dilutions des quatre anti-sérums.
Telles sont les méthodes indispensables pour l'identification du méningocoque et de ses divers types. Cette détermination présente actuellement la plus haute importance, car, en raison de la pluralité spécifique de ces germes, il est de toute nécessité de savoir à quel type appartient un méningocoque pour pouvoir lui opposer, au point de vue thérapeutique, l'antisérum homologue qui, seul, est capable de combattre spécifiquement son action pathogène.
Toutefois ces épreuves ne peuvent être poursuivies que si l'ensemencement primitif du liquide méningococcifère met le germe en évidence.
II est malheureusement fréquent que, même si l'examen est pratiqué dans de bonnes conditions, immédiatement après la ponction lombaire, les cultures premières (liquide céphalo-rachidien, sang, etc.) restent négatives (page 110). Il convient alors de recourir à des méthodes indirectes qui pourront assez souvent donner la clef du problème : précipitoréaction, séro-diagnostic, analyse chimique (voir diagnostic bactériologique de la méningite cérébro-spinale).
