ET CORPS ANNEXES

I. Méthode de travail. — Quand on part de plantes vivantes, qu'on les sèche rapidement à robscurité dans le vide sur Tacide sulfurique, on n'aura sans doute à traiter que }es produits post mortem des cellules, mais encore ceux-ci seront-ils aussi peu altérés que possible .C'est de telles préparations qu'a été extrait lecarottenecristallise.il suffit de lessiver ces feuilles avec de l'éther de pétrole, qui enlève bien peu de chlorophylle à ces matières, pour avoir aussitôt, si l'air n'intervient pas, un très abondant dépôt de carottène cristallisé. Ce n'est que dans ces conditions qu'on voit l'abondance et le rôle important du carottène dans les feuilles. Que les phylloglaucines primitives soient seulement autant, ou même plus altérables, et il y a toute chance de n'en isoler que de bien incertaines.

136 SÉPARATION DES CHLOROPHYLLES.

Ne sachant pas la nature d'une phylloglaucine primitive, c'est-à-dire du complexe coloré agissant dans les cellules, ni à quel signe .reconnaître de combien ses fragments de rupture moléculaires saisissables s'en éloignent, il m'a paru préférable d'éviter les complications et de viser à obtenir beaucoup de matière verte, afin de tenter de faire une séparation très sérieuse des molécules vertes que l'on possède, alors même qu'elles ne seraient qu'une trace un peu plus lointaine des états où elles ont vécu.

Pour un tel travail, il ne faut pas songer à prendre 3 ou 4 kilogrammes d'herbes frsdches. Gela ne représente que 300 ou 400 grammes au plus de matière sèche et à peine 30 ou 40 grammes d'extraits chlorophylliens très complexes.

Le plus souvent l'extraction a porté sur 10 kilogrammes au moins de plante séchée à 40^ dans l'air. Cela représente environ 100 kilogrammes de végétal frais et rend 1 000 grammes d'extraits verts.

Les plantes proviennent de cultures pures ou de récoltes faites spécialement pour l'usage. Souvent ce sont des plantes obtenues dans le commerce de - la droguerie, dites mondées et d'espèce pure, telles que Datura stramonium^ Aspidium filix fœmina ....

Après dessiccation, les feuilles sont pulvérisées à la main sur un tamis et les tiges ou pétioles

rejetés. C'est donc le parenchyme de la feuille, riche en corps chlorophylliens, qui domine dans les préparations.

Dix kilogrammes de matière sèche, légère, foliacée , occupent un cube considérable ; il est impossible de se servir des allonges et des épuiseurs en usage dans les laboratoires. Pour ces études il a fallu employer un véritable appareil industriel régénérant son dissolvant. La figure ci-contre donne une première idée de Textracteur.

La pièce principale est un cylindre aplati de façon que la chaleur puisse pénétrer jusqu'au milieu des masses de matière non conductrices imprégnées de dissolvant et chasser ce dernier. Ce tube plat reçoit 10 kilogrammes de plantes et 30 kilogrammes de sulfure de carbone par charge. Autour est soudée sur toute la hauteur une spire enveloppe en tube de plomb T que peut traverser une vapeur considérée comme source de chaleur. Tout le système est noyé dans un bain d'eau concentrique servant de régulateur de chaleur. Dans le tube extracteur fixe glisse h frottement libre un panier de même forme en tôle perforée. Ce panier reçoit les feuilles et laisse passer les dissolvants. Tout le système ;Se ferrie par une couronne elliptique de vis de pression qui maintiennent contre un cuir le couvercle noyé dans une gorge remplie^^de glycérine, le tout assurant

138 SËPARATION DES CBLOROPHYLLES.

rétanchéilé. Le dissolvant venant d'un réservoir supérieur tombe sur les feuilles ; on constate sa hauteur sur un niveau n. Après digestion à chaud ou à froid, un robinet r laisse tomber les extraits colorés dans un cylindre en tôle fermé, comme le précédent, par pression dans une gorge à glycérine et chaulTé par un serpentin intérieur. Un tube de départ D conduit constarainent les vapeurs de dissolvant k un fig. 10. réfrigérant. La

boîte cylindrique, quand de l'eau parcourt son serpentin, peut servir elle-même de condensateur pour les vapeurs venant de a quand il fonctionne à chaud par son serpentin, en\'ue de dessécher lesmatièresépuisées.

Ces quelques i*enseignements suffisent pour, donner une idée de cet épuiseur qui distille jusqu'à 50 kilogrammes de sulfure de carbone par jour de dix à douze heures. Ce sulfure se condense très parfaitement en passant dans le serpentin froid de a.

Après quatre charges de sulfure de carbone, cinq au maximum, les plantes sont totalement dégraissées, et ce liquide, ne dissolvant plus de chlorophylle, passe incolore. Avec le travail interrompu des laboratoires, quatre jours suffisent à épuiser 10 kilogrammes au sulfure de carbone et on a d'ordinaire entre 250 et 400 grammes d'extrait gras solide que je nommerai extrait sulfocarhonique.

Les feuilles totalement épuisées au sulfure de carbone sont encore vertes. On chasse le sulfure par la chaleur, sans démonter l'appareil froid, on enlève le panier en tôle perforée et étale les herbes pour bien dissiper le sulfure. Pendant ce temps, l'extrait de la boîte B est enlevé et celle-ci avec son serpentin soigneusement lavée. L'épuisement est recommencé à l'alcool à 95'* et se passe de même, l'apport de vapeur devant être naturellement plus rapide pour concentrer dans le vase B et sécher à la fin du nouvel épuisement dans le vase A. Il convient de remarquer que, grâce au changement de quelques raccords à collier, A et B jouent successivement l'un par rapport à l'autre le

140 SÉPARATION DES CHLOROPHYLLES.

-rôle d'alambic et de condensateur. Cet appareil^ calculé avec la collaboration de M. G. Bémont, figure dans le catalogue de la maison Adnet.

Après cinq tours d'épuisement à Talcool, les feuilles sont définitivement décolorées. Dans le récipient B se trouve une masse paraissant un extrait brun de consistance assez liquide, contenant de l'alcool fort aqueux, des extraits bruns et des chlorophylles alcooliques.

L'extrait encore riche en alcool se retire mieux du récipient B. On le concentre dans des ballons de verre pour récupérer de l'alcool et rendre par ce fait l'extrait tout à fait aqueux. Cet extrait aqueux chaud est versé dans une capsule et refroidi lentement. Du jour au lendemain, l'extrait aqueux (sucres, « principes extractifs », sels...) se dépose, et au-dessus surnage une matière semblable à de la graisse et d'un beau vert. On écréme avec la plus grande facilité cette chlorophylle alcoolique brute qu'on lave avec un peu d'eau.

A la suite de ces premiers travaux, on se trouve donc en présence de trois matières d'étude :

!•* L'extrait sulfocarbonique, 250-400 grammes pour 100 kilogrammes de plante fraîche, soit 2 k

4 millièmes en nombres ronds ;

2^ L'extrait alcoolique, 500-700 grammes, soit

5 à 7 millièmes ;

3^ Les principes extractifs très mélangés, 2000-

CLASSIFICATION ANALYTIQUE GÉNÉRALE. 14i

3000 grammes, soit 20 à 30 millièmes ou de 1 à 2 p. 100, selon les plantes fraîches prises.

■ La totalité des matières enlevées dans ces conditions et ramenées à Tétat sec dépasse rarement 1,5 p. 100 à 2 p. 100 du poids d'herbe vive, soit 15 à 20 p. 100 de la plante sèche tout au plus.

Les deux groupes de chlorophylles brutes atteignent rarement, si on les suppose sèches, 8 à 10 millièmes de la plante vivante, soit 8 à 10 p. 100 du sec, et là il y a encore bien des impuretés incolores*.

Les recherches faites jusqu'à présent sur les plantes vertes ont eu presque toujours pour but d'en extraire quelque substance déterminée, le plus souvent un alcaloïde, et cela au prix de la perte des autres matières. Tout étant subordonné à ce but, aucun, procédé méthodique de séparation générale n'a été institué, qui permette d'isoler les principes immédiats en nombre infini qui peuvent se former dans les végétaux. Assurément, l'ana- Ivse immédiate est un art, et l'infinité des cas ne peut être sûrement et machinalement abordée.

Cependant il faut s'efforcer d'aborder les principales propriétés des séries, et je me suis proposé, dans ce sens, de séparer ces principes immédiats, quels qu'ils soient, qui accompagnent les pigments verts, exactement comme on isole les éléments

1. Étard, Méthode d'analyse immédiate des extraits verts {Comptes rendus^ t. GXIV, p. 1116).

142 SÉPARATION DES CHLOROPHYLLES.

minéraux au moyen d'une marche analytique simple.

Cela n'est pas aussi téméraire qu'il semble; car, s'il est vrai que les principes immédiats sont indéfiniment nombreux, les groupes chimiques possibles dans lesquels ils doivent nécessairement entrer sont, en fait, limités. Dans cette analyse spéciale, on est conduit à traiter les corps complexes de la chimie biologique aisément altérables par les réactifs ordinaires et supportant seulement Taction des dissolvants neutres et de quelques réactifs étendus. Encore il faut répéter que ces dissolvants très faibles sont loin d'être démontrés sans action aucune.

II. Extraits sulfocarboniques. — La méthode que je m'attache à recommander a l'avantage de mettre en œuvre des dissolvants successifs et d'assurer, pour raison de solubilité, l'exclusion totale de groupes entiers de la chimie.

En ce qui concerne Yextrait sulfocarbonique^le produit de l'épuisement de plantes sèches par le sulfure de carbone sec, on peut affirmer, en toute certitude qu'il ne peut contenir aucune trace d'amidons, de mucilages, de sucres, de gommes, de tannins, d'acides polycarboniques, tels que les acides oxalique, succinique, maUque, tartrique des sucs,... enfin la masse principale des matières qui circulent dans les plantes. Par contre, cet

extrait est suspect de contenir des matières bien déterminées : ce sont les graisses et huiles, les acides gras, les cires, les essences, les carbures, quelques alcaloïdes ....

Voici assurément une situation relativement simple et, pour tout un ensemble d'impuretés exclues, elle est certaine.

L'extrait sulfocarbonique sec est mêlé de gravier siliceux fin, calciné et patiemment malaxé à la main avec de Talcool à 90' froid. Bientôt Talcool ne sort plus qu'avec la teinte d'un vert

très pâle que donnent les j-r—— de chlorophylles.

La plus grande quantité de la matière reste insoluble, elle constitue ce que je nommerai groupe analytique L

Groupe l. — Ce groupe, qui a été dissous parle sulfure de carbone et est remarquablement insoluble dans l'alcool, ne peut contenir qu'un nombre limité de substances. A moins de soins spéciaux, il reste teint en vert, cristallise plus ou moins bien et, grâce à sa couleur, c'est surtout de lui qu'il s'agissait quand on parlait de « la chlorophyllane ». Décoloré, il est en bloc la cire des feuilleSy la cholestérine végétale^ la phyllostérine^ etc.

Une étude plus attentive sur de nombreuses espèces m'a montré que dans ce groupe, limité par sa solubilité dans le sulfure de carbone et son insolubilité dans l'alcool, se trouvaient des paraf-

144 SÉPARATION DES CHLOROPHYLLES.

fines végétales C°H*"-^*, des monoalcools saturés ou non G"H2»-»-'(0H), des dialcools ou g-lycols, des trialcools ou glycérines, etc. Le noir animal décolore toujours complètement ces matières, surtout dans des dissolvants appropriés, notamment Téther acétique, Tacétone.... Quelquefois on voit ces matières en houppes ou fibres tordues dans les cellules; même elles représentent « la chlorophyllane » ou « Thypochlorine » des auteurs et sont dépourvues de tout caractère d'espèce chimique.

Groupe II. — Les eaux mères alcooliques du groupe précédent sont très vertes; on en chasse Talcool dans le vide. Par concentration et refroidissement il peut se séparer un peu de cristaux verts qu'on joindra à I. Après disparition totale de Talcool, on a une matière vert noir bien moins abondante que I et d'ordinaire plus complexe. On reprendra par de Téther et, pour certains végétaux, il restera une partie verte insoluble distincte de l et non décolorable. Pour former un cadre analvtique, sauf purification, cette matière sera II; on conçoit qu'il n'y ait pas là d'huiles, graisses ou essences solubles dans de grandes masses d'éther, mais il peut y avoir des alcaloïdes avec les chlorophylles. Ce que l'éther dissout est distillé ; il reste un résidu de chlorophylles très belles, mais pouvant être bien impures.

On les dissout dans un peu de pentane C*H**

dans un lieu frais. Le pentane s'incorpore grâce à un peu d'huiles ou d'essences ; sans doute on a une solution, mais ici se place une réaction importante : en ajoutant une grande masse de pentane, environ 100 fois le volume de l'extrait privé d'éther, les huiles, graisses, essences... deviennent négligeables par rapport à ces quantités et, dans la plu^ part des espèces, une chlorophylle IP se précipite. On lave par malaxage cette chlorophylle par le pentane et on reste assuré qu'elle ne retient plus ni graisses, ni essences, ni carottène. Ces matières ont des pouvoirs colorants atteignant

souvent le ^^^^^ des spectres déterminés pour

une concentration donnée, et rendent la même composition dans diverses préparations. Ce sont, pour chaque espèce, des chlorophylles déterminées.

Groupe III. — En distillant le pentane, on a des chlorophylles souvent un peu jaunes (carottène), odorantes (essences), pouvant tenir des graisses et des huiles. A moins de réactions particulières qu'on peut aviser dans chaque cas, ce groupe III doit être considéré comme mélangé de quelques impuretés. Le plus souvent, par la potasse à 1 p. 100 et l'éther, on peut faire d'utiles séparations dans ce groupe. Les chlorophylles se dissolvent souvent dans une faible alcalinité avant de saponifier les glycérides et sans dissoudre A. Étard. 9

146 SÉPAftATION DES CHLOROPHYLLES.

les essences. Les chlorophylles libérées des eaux alcalines seront ensuite traitées par Féther, le pentane....

III. Extraits alcooliques, — L'alcool n'a agi que sur des feuilles totalement dégraissées au sulfure de carbone. L'extrait alcoolique ne pourra donc pas contenir les carbures, cires, graisses, huiles, acides gras que nous pourrions soupçonner dans l'extrait sulfocarbonique. C'est là une préoccupation analytique dont on est désormais affranchi. L'extrait alcoolique formé dans de l'alcool à 95** ne peut contenir ni amidon, gommes, mucus, albumine. Séparé des extraits aqueux à l'état d'une sorte de graisse verte, il ne contient guère que des chlorophylles et on. ne peut y admettre que des traces de glucoses et similaires.

Groupe IV. — L'extrait alcoolique est malaxé avec de l'alcool froid, comme il a été expliqué plus haut ; la plus grande partie se redissout, le résidu est encore malaxé avec de l'éther et la partie restant insoluble en dernier lieu constitue ce groupe IV, parfois spécifique, très abondant, d'autres fois réduit à une petite quantité de glucoses, extractifs ordinaires, tannins, sels.

' Groupe V. — Les teintures éthérées très volumineuses sont distillées pour récupérer les dissolvants et les résidus verts sont alors malaxés avec peu d'éther qui dissout abondamment et quelque-

fois totalement la chlorophylle. La partie soluble dans Téther sera nommée :

Groupe YI. — Celle iankûâe ésans Féttier,

solubïe dans Taleoot, sera V,.

Ce ne sont ici que des indications d'analyse, une purification par solubilité strictement limitée est atteinte. Mais il reste, selon la façon dont se présentent à l'étude VI et V, , à les retraiter par des dissolvants combinés.

Il est certain que le cas V,, quand il se présente, donne déjà une matière très pure par une exclusion de plus dans les possibilités de dissolution. Une substance insoluble dans Teau, soluble dans Talcool et insoluble dans Téther, sans compter sa provenance, est déjà fort avancée en pureté. On cherche encore quelques contradictions entre d'autres dissolvants neutres et on arrive à un corps à composition constante dans toutes les préparations, à solubilités étroitement définies, à aspect défini, donc à une espèce.

Groupe VII. — C'est par essence le groupe des chlorophylles abondantes, insolubles dans l'eau, solubles dans l'alcool et l'éther, ayant été insolubles dans le sulfure de carbone.

Dans ce groupe, en appliquant l'art de l'analyse immédiate à des corps aussi variés que Jes espèces le sont en botanique et mêmement les variétés et les lieux d'origine, on doit chercher sa voie par quelques essais. Mais toujours le pentane donne

148 SÉÏ>AftATION DES CHLOROPHYLLES.

un résultat. Après avoir chassé Téther, on reprend par du pentane à froid en malaxant à la main; presque toujours, une grande masge de matière devient insoluble et se lave au pentane. Répétons que cette substance sera insoluble daçis Teau, très soluble dans Talcool et Téther, précipitable par le pentane après avoir primitivement été épuisée par le sulfure de carbone. On se trouve là en présence d'un corps pur qu'on peut retrouver avec sa composition constante. D' ailleurs, en présence de cette permanence de composition, si la méthode des dissolvants était critiquée, je demanderais pour combien de chlorophylles on a été aussi sévère et quels sont les corps biologiques sans constantes physiques auxquels on impose une telle série de dissolvants successifs et éliminatoires ?

Dans ce groupe VII, outre la chlorophylle insoluble dans le pentane, il en est le plus souvent une moins abondante, qui se dissout dans le pentane. On sait qu'elle ne peut tenir ni graisses, ni cires. On évapore le pentane et il reste une chlorophylle VII,, qui, si l'on veut bien considérer ses origines et la succession de ses dissolvants, sera pure. Cependant, en vue d'arriver aux résultats les plus probants, je soumets cette matière à d'autres dissolvants pour essayer d'en trouver un nouveau qui ne la dissolve pas ou la dédouble en deux corps manifestement distincts.

CLASSIFICATION ANALYTIQUE GÉNÉRALE. 14d

IV. Extraits aqueux, — Je ne m'occupe pas volontairement d'obtenir des extraits aqueux. Mais, après exposition à l'air de la plante épuisée par le sulfure de carbone, elle peut prendre un peu d'eau ; on l'a épuisée par l'alcool à 94o-95' qui n'est pas anhydre. Alors une notable partie des sucs végétaux des cellules, bien que fort peu solubles dans l'alcool à 94"'-95% devenu à 93^-94° peutêtre au contact de la légère humidité des feuilles, est mise en solution. Sans doute ces matières sont à peine solubles,mais je fais passer 120 à 130 litres d'alcool sur 10 kilogrammes de feuilles; lors de la concentration finale, ces petites quantités s'accumulent, retiennent un peu d'eau, et c'est ainsi que, par l'épuisement à l'alcool à94°-95°, j'obtiens un extrait aqueux. Bien que je le nomme ainsi, on conçoit qu'il y ait là un extrait aqueux très particulier ; né dans l'alcool, il ne contient pas trace de gommes, albumines. . . .Mais, très complexe parfois, on peut y trouver tout ce que dissolvent à la fois l'alcool et l'eau, glucoses, tannoïdes, sels, acides végétaux, extractifs.... Quelquefois cet extrait aqueux se présente d'emblée avec des propriétés qui attirent l'attention (laurier-cerise). On prend alors l'extrait partiellement évaporé dans le vide par de l'alcool à 94°-95'* et on lave à fond par ce solvant. Bientôt le tout devient une masse plastique qui se laisse étirer avec de beaux reflets de soie en écheveau.

Cette masse est redissoute dans l'eau, précipitée

130 SÉPARATION KS CHUaWHTLLKS.

par l'alcool et ramenée encore à i'état de nMsee soyeuse. La consistance rappelle la pâte de gmmauve bien connue, mais avec un plus vif éclal; tibreui à la dessiccation, cela devient une sorte de ^omme cassante facile àpulvériser. Le plus souvent lextrail visqueux est presque noir et fort complexe. H est possible d'en isoler des glucosazones prouvant les glucoses ; il y a des sels : KCl, NaCI, AzO'K, PO'K^H....

L'abondance de ces sels est quelquefois surprenante, Le gazon, io/i«»i/>erf/)nf, pendant le refroidissement des cxlraits h ydro alcooliques, laisse déposer par centaines de grammes de beaux cristaux qu'on isole et qui, séparés ultérieurement, se montrent constitués d'un mélange de AzO»K + KCI.

D'autres plantes déposent du nitre pur AzO'K en longues aiguilles.

le mes recherches, j'ai vu des chlorofaitement vertes et insolubles dans r une matière extractive brune . l'eau. Cela tenait soit à la lumière, eur, soit à ce que le trEiitement de l'avmt pas été conduit assez vile, que les « principes extractifs » vrais la chlorophylle. Elle les formerait e normalement pour tes chasser avec ime ferait une fonction urinaire; ils icombrer des cellules qui tomberont

avec la chute des feuilles. Mais, pendant la mort des feuilles que le chimiste traite, mort lente souvent à la lumière, presque toujours à Tair, toujours dans le milieu humide et acide des cellules, une grande part des chlorophylles passerait en extraits bruns.

Peu importe de ces extraits bruns. Il s'agit pour chacun de s'inspirer des circonstances et dedisposer d'une grande quantité de matière. Lea procédés auxquels on peut avoir systématiquement recours sont les suivants :

1** Dialyser l'extrait dissous pour chasser lessels, sucres, cristalloïdes en général ;

2® Ensemencer une partie avec de la levure aussi pure que possible, afin de savoir, en mesurant les gaz, si les glucoses sont partis ;

3** Prendre l'extrait très concentré par un excès de solution saturée de sulfate de magnésium.

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avec la chute des feuilles. Mais, pendant la mort des feuilles que le chimiste traite, mort lente souvent à la lumière, presque toujours à l'air, toujours dans le milieu humide et acide des cellules, une grande part des chlorophylles passerait en extraits bruns.

Peu importe de ces extraits bruns. Il s'agit, pour chacun de s'inspirer des circonstances et dedisposer d'une grande quantité de matière. Les^ procédés auxquels on peut avoir systématiquement recours sont les suivants :

i" Dialyser l'extrait dissous pour chasser lessels, sucres, cristalloïdes en général ;

2® Ensemencer une partie avec de la levure aussi pure que possible, afin de savoir, en mesurant les gaz, si les glucoses sont partis ;

3* Prendre l'extrait très concentré par un excès de solution saturée de sulfate de magnésium.