CHAPITRE II

LE BACILLE DE KLEBS-LŒFFLER 1

Dès le début des recherches microbiques, on signala dans la fausse membrane diphtérique la présence de cocci. de bacilles, de chapelets de formes variées, mais on ne savait auquel de ces micro-organismes devait être attribuée l’affection. Ivlebs, le premier en 1883 [Archiv für experiment Pal/iologie, I et IX), décrivit un bacille auquel était due la production de la fausse membrane : ce bacille était à peu près aussi long que celui de la tuberculose, et deux ou trois fois plus large. Il l’avait trouvé en faisant des coupes d’une muqueuse encore garnie de sa fausse membrane, au-dessous des masses d’autres bactéries qui en recouvraient la surface. Ce bacille se groupait d'une façon spéciale, en s’enchevêtrant, formant ainsi de petits amas à la limite interne de la couche exsudative pauvre en cellules, c’est-à-dire dans la partie la plus ancienne de la fausse membrane.

Klebsne cultiva pas ce bacille : il était réservé à Lœ filer, dès 1884, de l’isoler, de le cultiver, et de faire des expéiiences tendant à démontrer sa spécificité.

1 Ce chapitre et le suivant sont entièrement dus à M. le Ir Tollemer, cher eu a oiatoire de la diphtérie à l’hôpital Trousseau. Sur mes indications et sur ma demande, .M, Tollemer a bien voulu se charger d’exposer, avec sa compétence spéciale, la bactériologie clinique de la diphtérie.

Culture pure de bacilles de Lœlïler.

D’après une aquarelle faite par M. Chicotot au laboratoire de la diphtOric à l'hôpital Trousseau.

Culture du racille par Lœffler. Ses caractères. — Lœffler retrouva cette bactérie dans toutes les fausses membranes de diphtérie vraie. Pour l’isoler, on ensemence, sur sérum solidifié, une fausse membrane diphtérique de la façon suivante : un fragment de cette fausse membrane est délayé dans un peu d’eau stérilisée, puis, chargeant avec cette eau un fil de platine stérilisé, on ensemence successivement en stries, deux ou trois tubes de sérum, sans recharger le fil de platine. Les tubes étant mis à l’étuve à 35 ou 37°, on observe déjà, douze heures après, de petites colonies punctiformes, d’aspect caractéristique. Elles sont grisâtres, transparentes, à centre plus opaque. Sur sérum, le bacille de Klebs-Lceffler pousse plus vite que les autres microbes. Ces colonies sont rarement pures. Pour obtenir le bacille à l’état pur, on prend un fragment de colonie, puis on délaye dans un peu de bouillon les microbes ainsi prélevés et, à l’aide d’un fil de platine trempé dans ce bouillon, on ensemence plusieurs tubes de sérum. Les colonies poussent isolément sur ces tubes et en partant de l’une d’elles, dont on a vérifié la pureté, on ensemence de nouveaux tubes où le bacille de Lœffler cultivera seul.

Sur gélose, ce bacille pousse, mais moins vite et moins bien que sur sérum ; au bout de trente à quarante heures, on voit de petites colonies blanches à centre plus épais.

Sur gélatine restant solide entre 23 et 24°, il se développe lentement et donne de petites colonies blanchâtres, très petites et ne liquéfiant pas la gélatine.

Culture en bouillon. — Le bacille de Lœffler se cultive bien dans les milieux liquides, surtout dans le bouillon de veau légèrement alcalin. Son développement ne trouble pas le bouillon, dans lequel il prend l’apparence de fins

flocons adhérents à la paroi dn tube. Il forme, au bout de quelques joues, si l’air pénètre bien dans le vase, un voile fin et ténu à la surface du liquide ; ce voile tombe au fond du vase.

Le bacille de Loeffler est indifféremment aérobie ou anaérobie : cependant, sa culture est moins abondante dans le vide.

Si on suit jour par jour la réaction du bouillon de culture, on voit celle-ci, d’abord alcaline, devenir acide au bout de quelques jours ; cette acidité persiste un certain temps : puis» si l’air a libre accès dans la culture, l’alcalinité reparaît, et dans les vieilles cultures, il se forme des dépôts de phosphate ammoniaco-magnésien, car le bacille oxyde la matière azotée du bouillon. Dans les cultures privées d'air, il ne se forme pas de cristaux. La virulence du bacille, peu considérable tant que le bouillon reste acide, devient plus grande à mesure que l’alcalinité du liquide reparaît.

Résistance du bacille de Loeffler. — Le bacille de Loeffler est résistant : dans le sérum et le bouillon, il conserve longtemps sa vitalité, six mois environ, et il est encore vivant dans les tubes scellés à la lampe plus d’un an après qu’on l’y a renfermé. Quand la culture reste acide, il périt assez AÛte : c’est ainsi que sur gélose glycérinée, où il donne une acidité prononcée, sa vitalité s’épuise bientôt. Desséché, il garde longtemps la propriété de végéter : à l’étuve à 37°, il meurt au bout de deux ou trois mois ; mais certaines cultures résistent mieux que les autres. Dans une fausse membrane, le bacille de Loeffler garde longtemps sa virulence, qui persiste pendant sept ou huit mois à l’abri delà lumière. Dette résistance du bacille explique sa propagation et les difficultés qu’on rencontre lorsqu’on veut le détruire et stériliser les appartements. Mais la persistance de sa

BACTERIOLOGIE CLINIQUE

vitalité tient à lui-même, et non à ce qu’il donne des spores, comme l'ont cru certains auteurs ; Babès, en elîet, en maintenant pendant plusieurs semaines à 20 ou 22°, des cultures sur gélatine, avait cru observer la formation de spores : en réalité, dans les cultures anciennes ou dans les cultures plus récentes où le bacille végète difficilement, il se colore mal et prend un aspect granuleux : mais ces grains ne sont pas des spores. On observe encore, dans les cultures anciennes, des formes d’involution : le bacille se renfle en forme de massue, se segmente en grains plus ou moins volumineux.

Une température humide de 05° le tue en quelques minutes : desséché, il résiste à 95 ou 100". La plupart des antiseptiques le tuent, surtout en milieu acide (acide phénique, sublimé).

Expériences de Loekfler. Inoculations. — Lœffler fit des expériences tendant à montrer que le bacille, isolé par lui et présentant les caractères que nous venons d’exposer, était bien l’agent actif de la diphtérie vraie. Il inocula ce microbe sous la peau des animaux et montra que le cobaye est le plus sensible de tous à l’action du bacille diphtérique. Les cobayes inoculés meurent en quelques jours, en présentant un œdème sanguinolent ou grisâtre, au point où l'on a pratiqué l’opération. Ils ont, en plus, de la pleurésie double et de la congestion des capsules surrénales. Les lapins résistent mieux à l’inoculation souscutanée, mais quelquefois ils succombent : les rats et les souris sont réfractaires.

Production expérimentale de fausses membranes. — Enfin, Lœffler reproduisit la fausse membrane avec ses caractères. Pour cela, il est nécessaire que la muqueuse sur

laquelle on opère soit lésée. Mais, si on excorie la muqueuse vaginale d’un cobaye femelle et si 1 on inocule le bacille sur cette écorchure, on voit se produire une fausse membrane en ce point. Il en est de même sur la muqueuse trachéale du lapin préalablement excoriée : le lapin est alors atteint d’un croup véritable, et quelquefois il succombe. Les mêmes expériences donnent des résultats analogues sur les poules et les pigeons. Si l’on inocule la conjonctive d’un animal avec le bacille de Lœffler on provoque la formation d’une fausse membrane conjonctivale : de même, si l’on touche avec une goutte d’une culture de Lœffler, le plaie produite par un vésicatoire sur l'oreille d’un lapin ou sur la peau dénudée, on assiste encore au développement d’exsudats membraneux.

Le bacille décrit par Lœffler était donc capable de reproduire la fausse membrane avec tous ses caractères : mais des doutes persistaient sur sa spécificité. En effet, d’autres microbes peuvent donner des fausses membranes : en premier lieu, le streptocoque. On savait déjà que ce dernier donne dans l’utérus des femmes en couches de véritables fausses membranes : or, on rencontre le streptocoque très souvent dans les enduits de la gorge des diphtériques, et au début des recherches microbiques, on lui attribua la production des fausses membranes.

Doutes sur la spécificité. — Le staphylocoque lui-même pouvait, dans certaines conditions, donner naissance à des productions analogues. De plus, non seulement une fausse membrane peut être produite par d’autres microbes que le Lœffler, mais encore on trouve parfois dans la gorge ou dans les losses nasales d individus sains un bacille ayant tous les caractères du bacille diphtérique, mais dépourvu de \iiulence et sans action sur les animaux. Lœffler lui-

BACTÉRIOLOGIE CLINIQUE lo

même décrivit ce bacille pseudo-diphtérique que, depuis, Roux et ô ersin ont rencontré dans la bouche d’enfants sains, n’ayant pas été atteints de diphtérie et habitant un village où jamais cette maladie n’avait été observée.

Pour admettre, par conséquent, la spécificité du bacille de Lœffler, il fallait noter, dans l’intoxication produite par ce microbe , les symptômes infectieux de la maladie humaine. Lœffler, restait dans le doute : car si, comme disait Hoffmann, on savait que le bacille se trouve souvent dans la diphtérie, on ignorait s’il en était la cause puisqu’on ne le voyait pas provoquer d’infection analogue à celle qu’on observe chez l'homme. Ceci tenait à ce que les premières cultures de Lœffler étaient relativement peu virulentes. Néanmoins, il réussit à produire des paralysies.

Injection du bacille daxs les veines. — Si on isole plusieurs échantillons de bacille de Lœffler, on en trouve facilement un dont la virulence est grande : si on l’injecte au cobaye et au lapin sous la peau, ces animaux meurent en vingt-quatre ou quarante-huit heures avec un enduit grisâtre au point d’inoculation et avec une dilatation énorme de tous les vaisseaux. La pleurésie, qui est la règle chez le cobaye, est rare chez le lapin. Souvent les urines sont sanglantes. Inoculé dans les veines, le lapin meurt en vingt-quatre heures et même en moins de temps ; il présente encore une dilatation considérable des vaisseaux et un état graisseux du foie qu’on retrouve chez les enfants morts de diphtérie toxique.

Production expérimentale de paralysies diphtériques. — Si on inocule dans les veines un lapin avec un bacille peu virulent, l’animal meurt au bout de quelques jours avec des paralysies véritables et ces paralysies se pro-

(luisent, non seulement à la suite (le l’inoculation dans les veines, mais encore après que l’inoculation a été faite dans la trachée : dans ce dernier mode d’expérience, si l’animal résiste quelques jours au croup, il se développe une paralysie du train postérieur, paralysie envahissante qui finit par tuer le lapin : cette paralysie peut paraître huit à quinze jours, un mois, après la guérison du croup.

D’autres animaux ont des paralysies diphtériques plus facilement encore. Le pigeon et la poule, quinze jours après l’inoculation, alors qu’ils sont guéris du croup, sont pris de troubles du mouvement ; l’animal ne peut ni voler, ni marcher, il maigrit et souvent il succombe. Quelquefois

11 se rétablit et peut même avoir une deuxième attaque de paralysie. Le chien peut également servir à ces expériences : s’il est jeune, même inoculé sous la peau, il présente une dégénérescence aiguë du foie ; il a un ictère prononcé et tous ses tissus sont infiltrés de bile. Des hémorragies se retrouvent dans les organes, en particulier dans les reins. En un mot, il présente le tableau d'une intoxication profonde.

L’inoculation du bacille de Loeffler reproduit donc expérimentalement les caractères cliniques de la diphtérie. Mais il restait une question fort importante à trancher. Comment agit le micro-organisme?

En effet, aussi bien dans les expériences que chez les individus morts de diphtérie, on ne trouve pas le microbe diphtérique dans les organes internes d’un animal tué par son inoculation. Rarement on en trouve, et en très petit nombre, dans les ganglions les plus voisins ; ces glandes renferment le plus souvent des streptocoques, des staphylocoques et autres microbes poussant en même temps que le Lœ filer et qui causent parfois le gonflement de ces organes : quelquefois même ces ganglions ne renferment

BACTERIOLOGIE CLINIQUE

aucun micro-organisme. De plus, sous la peau, la culture ne continue pas au point d’inoculation : les microbes sont les plus nombreux vers la sixième heure après l’inoculation et douze heures après leur nombre diminue. L’épanchement pleural ne renferme jamais le bacille diphtérique.

Ainsi dans la diphtérie, on meurt par empoisonnement et non par infection : la mort n’est pas le résultat de la pullulation du bacille de Lœffler dans l’organisme, mais le résultat de l’absorption d’un poison des plus violents que le bacille a sécrété. La maladie est toujours locale au début : la diffusion seule du poison dans l’organisme fait participer tous les organes à l’intoxication.

Toxine diphtérique. — Il fallait montrer ce poison diphtérique, et l’étude de cette toxine fut faite par MM. Roux et Yersin qui exposèrent leurs recherches dans trois importants mémoires (1888 et 1889).

Si on prend une culture de bacille de Lœffler dans du bouillon de veau, vieille de quinze à vingt jours, et si on la filtre sur une bougie Chamberland, on obtient un liquide très clair, privé de microbes. Si on injecte sous la peau 1 à 2 centimètres cubes de ce liquide à un cobaye, il meurt au bout de deux ou trois jours avec un œdème local, assez étendu, des urines sanglantes et des paralysies. Ce poison est donc très énergique. Si la culture est un peu plus ancienne et bien virulente, on peut tuer un cobaye avec un huitième, un dixième de centimètre cube, et même moins, du liquide filtré.

Le poison diphtérique peut donc donner la maladie sans l’aide des microbes. C’est lui qui, produit au niveau de la fausse membrane oii se cultive le bacille, empoisonne l’organisme. Très actif sous la peau, il 1 est encore plus dans les veines, et le lapin auquel on 1 injecte dans le sang

LA DIPHTÉRIE ET LA SKHU.MTHÉRAP1E. 2

présente les mêmes lésions que si on lui avait inoculé le bacille lui-même. Un chien, inocule dans une veine, meurt en moins de vingt-quatre heures avec des hémorragies multiples ; le cœur, les muscles, le foie présentant de la dégénérescence graisseuse et de Uictère. Si on injecte le bouillon de culture fdtré sous la peau, on peut provoquer un gonflement des ganglions voisins du lieu d’inoculation : ce gonflement est dû à une dilatation très grande des vaisseaux et à une active diapédèse des leucocytes.

L’injection de la culture de bacille diphtérique, privée de bacilles, reproduit le tableau de l’intoxication diphtérique si la dose est suffisante. Si la quantité injectée est moindre elle reproduira les paralysies. Un quart ou un cinquième de centimètre cube de ce liquide injecté à un cobaye ne le tue pas ; mais au bout de quelques jours ranimai présente une paralysie aux progrès de laquelle il succombe bientôt. Une petite quantité, inoculée au chien, le rend triste et lui donne un peu d’ictère, mais il guérit : au bout de huit à dix jours se déclare une paralysie qui disparaît ensuite lentement, en un mois et demi ou deux mois. Cette paralysie est identique à la paralysie diphtérique de l’homme.

Nature de la toxine diphtérique. — La toxine diphtérique, poison produit parle bacille de Lœffler, se rapproche des diastases : ce n’est pas un alcaloïde, ce n’est pas une ptomaïne. Elle est très fragile, la chaleur la détruit à 58" dans un tube privé d’air pour éviter l’action de l'oxygène. Si on chauffe à 50". pendant une heure, le bouillon filtré, 2 centimètres cubes ne tuent plus le cobaye. Au bout de deux heures, le poison diphtérique, n’est pas tout à fait détruit, il cause une escarre au point d’inoculation au cobaye, chauffé quelques instants à 100°, il est détruit en

partie, mais, malgré l’action de la chaleur, il conserve assez d’activité pour tuer un animal eu un ou deux mois, avec un amaigrissement considérable et quelquefois des paralysies. L’insolation prolongée au contact de l’air détruit tout le poison. Mais, en tube scellé et privé d’air, l’insolation reste sans effet. Ce poison se rapproche des diastases en ce qu’il agit à très petites doses et qu’il ne résiste pas à une température de 60°. Il offre beaucoup d’analogie avec les venins.

Une curieuse propriété de la toxine diphtérique, comme des diastases, est d’adhérer aux précipités qui se produisent dans un liquide où elle est en dissolution ; si on lave un précipité ainsi produit, il reste très toxique et tue les animaux comme le poison lui-même. Mais ce précipité n’a pas enlevé tout le poison au liquide, qui est encore assez actif. Notons que la bougie qui a servi à filtrer le bouillon de culture retient dans ses pores une notable partie du poison.

Ce précipité peut se conserver très longtemps à l’état sec, et la température de 100° ne lui fait pas perdre ses propriétés s'il a été préalablement desséché.

Pour montrer l’activité de la toxine diphtérique, on peut répéter l’expérience suivante. On provoque dans le bouillon de culture filtré un précipité de phosphate de chaux; puis on sèche ce précipité et on en introduit un centigramme sous la peau d’un animal, qui est tué comme si on lui avait injecté le bouillon lui-même. L’animal mort, on reprend au point d’inoculation le grain de phosphate de chaux et on l’inocule à un deuxième animal, qui meurt également. Et cependant le centigramme de précipité ne renferme qu’une toute petite quantité de poison, car si on le calcine, il perd deux dixièmes de milligramme de son poids et ces deux dixièmes de milligramme ne

représentent pas toute la toxine, car il y a un peu de matière organique entraînée. Il faut probablement des fractions de milligramme de toxine diphtérique pour tuer un homme.

La toxine diphtérique injectée sous la peau ou dans le sang n’agit pas immédiatement, car ce poison diffuse lentement : il dialyse difficilement. Cette diffusion lente a comme corollaire que le poison diphtérique s’élimine lentement, surtout par le rein. On le retrouve dans tous les organes, et le suc extrait , par exemple , de la rate d'un diphtérique peut, s’il est injecté à un cobaye, produire les mêmes troubles que la culture en bouillon filtrée et chauffée.

Ce poison est insoluble dans l’alcool, comme les diastases; on a essayé de l’isoler en ajoutant de l’alcool au bouillon de culture du Loeffier filtré et concentré ; il se forme un précipité qu’on peut redissoudre dans l’eau et précipiter à nouveau, mais ces précipitations successives altèrent la toxine et la rendent peu virulente.

Brieger et Frænkel ont essayé de l'obtenir pure : ils ont obtenu une pondre d’un blanc éclatant, très légère, amorphe et comme floconneuse, matière azotée se rapprochant beaucoup des albuminoïdes solubles par ses réactions : ils ont même donné une formule de cette toxine, mais ils ne l’ont pas obtenue réellement pure ; en effet, le poids de cette substance qu'ils devaient employer pour tuer un cobaye est de 10 milligrammes environ, alors que Houx et \ersin tuent un cobaye avec deux dixièmes de milligramme de la substance qu'ils ont isolée. Brieger et brænkel ont donné à cette substance le nom de toxalhumine. -

Lorsqu on lut en possession de ces importantes données slu P°*son diphtérique, on chercha à l’atténuer et à

immuniser contre lui les animaux sensibles à son action : Frænkel réussit à atténuer l’action du microbe de Lœffler en chauffant les cultures de 60 à 70°, ce qui tue le bacille et détruit le poison. Les cobayes inoculés avec ces cultures chauffées peuvent être inoculés avec des bacilles virulents. Ils résistent à l’inoculation, mais si on les garde longtemps, on les voit mourir pour la plupart ; encore ne résistent-ils qu’à l’inoculation sous-cutanée, car ils prennent la diphtérie sur la muqueuse de la trachée ou du vagin. Ces expériences ne pouvaient donner de résultat pratique pour l’homme.

Behring essaya cinq procédés d’immunisation des animaux. Le premier était le même que celui de Frænkel. Dans un deuxième il fit agir sur une culture de diphtérie du trichlorure d’iode au cinq millième. Cette culture fut injectée aux animaux; puis, au bout de quelques jours, il injecta une autre culture sur laquelle le trichlorure d’iode avait exercé moins longtemps son action que sur la première. 11 faisait ensuite une troisième inoculation, virulente, à laquelle le cobaye résistait.

La troisième manière d’immunisation employée par Behring consista à injecter des doses successivement croissantes du liquide de la pleurésie des animaux inoculés avec un bacille de Lœffler virulent, liquide, qui, en général, ne renferme pas de bacilles. Le quatrième procédé consista à inoculer le bacille diphtérique et à injecter une solution de chlorure d’iode presque immédiatement, moins de six heures après, autour du point d’inoculation. L’animal est malade, il guérit et résiste ensuite à une nouvelle inoculation virulente. Dans son cinquième procédé Behring atténua la virulence du bacille en mélangeant à la culture une certaine quantité d eau oxygénée : on peut vacciner un lapin avec une culture ainsi

atténuée et le rendre apte à résister à une inoculation

virulente.

L’immunisation des animaux contre la diphtérie était donc réalisée. L’application d’une méthode essayée en vain pour guérir une autre maladie toxique, le tétanos, allait permettre de trouver un admirable traitement de la diphtérie.

En effet, on était parvenu à immuniser des animaux contre le tétanos : Behring et Kitasato avaient constaté que le sérum du sang des animaux vaccinés contre le tétanos était doué de propriétés spéciales telles que, inoculé à des animaux auxquels on inoculait ensuite le bacille de Nicolaïer, il neutralisait la toxine tétanique. Mais cette antitoxine tétanique, si efficace avant l’explosion des accidents du tétanos, se montra inefficace contre le tétanos déclaré. Il n’en restait pas moins acquis que le sérum des animaux vaccinés contre cette affection renfermait une substance très active ayant comme effet d’empêcher le développement du tétanos. La sérumthérapie entrevue à propos du tétanos, devait être appliquée par Behring à la diphtérie (1890). 11 montra en effet que le sérum des animaux vaccinés contre la diphtérie renfermait une substance qui, inoculée à un animal avant ou après l'infection diphtérique, permettait à celui-ci de résister à la maladie et de guérir. On connaissait donc le contrepoison de la toxine diphtérique, on pouvait espérer la détruire dans le corps, alors qu’elle y est déjà formée. C’est ce qui est réalisé par l’injection de sérum antidiphtérique.