BACTÉRIOLOGIE CLINIQUE DU BACILLE DE LŒFFLER ET DES MICROBES ASSOCIÉS

La diversité même des microbes décrits dans les exsudais pharyngés avant la découverte du bacille de Lœffler, l’accumulation des preuves de spécificité qu’il a fallu produire pour démontrer le rôle effectif et spécial joué par ce microbe, donnent une juste idée des difficultés auxquelles on peut se heurter dans les recherches bactériologiques faites sur les angines. Cependant les travaux auxquels a donné spécialement lieu le bacille de Lœffler ont rendu sa recherche et son identification si sûres et si pratiques dans la majorité des cas, qu’il est vraiment permis de qualifier de cliniques les recherches bactériologiques qui ont pour but de démontrer sa présence et celle des microbes qui lui sont le plus souvent associés.

Ces recherches peuvent atteindre une complexité assez grande pour ne pouvoir être pratiquées que par un microbiologiste expérimenté. Il est toutefois possible, en réduisant à leur plus simple expression les procédés techniques, de les mettre à la portée de tous les médecins, tout en conservant à ces recherches un caractère de certitude rigoureusement exacte, dans la plupart des cas.

Deux procédés s’offrent au clinicien : ou bien examiner directement la fausse membrane et chercher à y recon-

naître le bacille de Lœffler, ou bien avoir, de prime abord, recours à la culture des microbes de la gorge par le procédé que nous indiquerons plus loin.

L’examen direct des microbes contenus dans la fausse membrane peut avoir une grande utilité. Pour le pratiquer on prend, à l’aide d’une pince, un fragment de fausse membrane, on le laisse sécher un peu de façon à ce qu’il perde une partie de son humidité ou bien on lui enlève celle-ci en l’appliquant sur du papier buvard. Puis on frotte ce fragment de fausse membrane sur une lamelle de verre bien essuyée de façon à faire un frottis : des fragments très ténus de la fausse membrane s’étalent sur la lamelle de verre et y forment une couche mince. On laisse sécher la préparation et on la fixe en passant trois fois de suite la lamelle dans la flamme d’un hec de Bunsen ou d’une lampe à alcool ; celte dernière pratique a pour résultat de faire adhérer la préparation à la lamelle, de telle façon qu’on pourra colorer, décolorer et laver celleci sans risquer d’enlever les débris de fausse membrane collés sur le verre. La coloration a lieu ensuite de la manière que nous indiquerons lors de l’examen microscopique des cultures.

La culture des microbes de la gorge est en effet indispensable pour déterminer d’une façon exacte s'il y a ou s’il n’y a pas du bacille de Lœffler dans une angine. Cette culture exige des soins particuliers, un milieu spécial et des instruments que nous allons décrire brièvement et aussi clairement que possible.

Préparation des tcbes de sérum coagulé. — Tout d’abord, avant de songer a cultiver les microbes en question, il !aut préparer le milieu sur lequel on ensemencera les exsudais de la gorge, et nous avons vu que le milieu de choix

est le sérum sanguin solidifié. En effet, le bacille de Lœffler pousse mieux sur ce milieu que sur tout autre et il s’y développe presque toujours plus énergiquement que tous les autres microbes. Enfin les colonies de ce bacille prennent sur le sérum un aspect caractéristique.

Le sérum utilisé est celui qui se sépare du sang d’un

Fig. 1. — Instrumentation pour la bactériologie clinique de la diphtérie au laboratoire de l’hôpital Trousseau.

1, Four Pasleur pour la stérilisation des tubes. — 2, F.tuve à plan incliné pour la préparation des tubes de sérum gélalinisé. — 3, Etuve d’Arsonval pour la culture des tubes.

animal qu’on vient de saigner. Pour l’obtenir, on recueille dans un vase en verre stérilisé le jet de sang qui sort de la carotide : on recouvre ce vase avec une cloche de verre et on laisse le sang reposer dans un endroit frais. Au bout de quelques heures le caillot se sépare du sérum qui surnage et on aspire ce dernier dans des pipettes stérilisées, à l’aide desquelles on répartit ce liquide dans des ballons stérilisés. Ces ballons sont scellés à la lampe et, comme dans la saignée il a pu se trouver que quelques impuretés soient entraînées dans le sang, on stérilise le sérum contenu dans ces flacons par la méthode de chaut-

lage discontinu : pour cela on le porte tous les jours à 50° dans une étuve, pendant une heure, et on répète ce chauffage pendant quinze jours quotidiennement. Ainsi préparé, ce sérum pourrait se conserver indéfiniment : pour l’utiliser il faut le répartir dans des tubes à expérience préalablement stérilisés, et le porter à une température telle qu’il se coagule dans une position qui donne une surface inclinée sur laquelle se feront les ensemencements.

Nous venons de dire que les tubes dans lesquels on mettra le sérum doivent être stérilisés : en effet, nous verrons plus loin que la température à laquelle il convient de coaguler le sérum est d’environ 70°. Il faut éviter de porter le sérum à une température plus élevée, et il est par conséquent indispensable que le sérum et les tubes destinés à le recevoir soient absolument privés de germes, car la plupart des microbes résistent à une température aussi peu élevée. La stérilisation des tubes à expérience s’opère de la façon suivante : les tubes sont bouchés avec un tampon de ouate ordinaire, suffisamment serré, et disposés dans un panier en fil de fer. On introduit ce panier dans le four à flamber de Pasteur : c’est un fourneau en tôle, à double enveloppe, que chauffe en dessous un fort brûleur à gaz. Un thermomètre, enfoncé et maintenu dans une ouverture du couvercle, plonge dans l'intérieur du four et permet de suivre l’ascension de la température : celle-ci doit monter entre 180° et :200° : en pratique, le degré de chaleur convenable est atteint lorsque 1 ouate qui bouche chaque tube est légèrement roussie et ceci peut être obtenu dans un four quelconque.

1 our répartir dans les tubes ainsi stérilisés et étant îcfioidis le sérum sanguin, on ouvre d’un trait de lime un des flacons de sérum et on aspire, à l’aide d’une pipette de Miquel, le liquide contenu dans le flacon. On répartit

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alors le contenu de la pipette dans les différents tubes, en mettant dans chaque tube environ 3 à 4 centimètres cubes de sérum : il faut prendre de grandes précautions pour éviter d’introduire des germes dans chaque tube et de déposer du sérum sur les bords du tube, car la coagulation de ce sérum ferait adhérer le tampon de ouate au verre et empêcherait de déboucher facilement le tube. L'ouverture du tube doit être passée dans la flamme avant l’introduction de la pipette et après que celle-ci est retirée. Le tampon de ouate doit être tenu à l’aide du petit doigt de la main droite et ne doit être déposé sur aucun objet, comme nous l’indiquerons plus loin à propos des ensemencements. Cette façon de déboucher et de reboucher les tubes est fort importante, car elle permet d’éviter bien des causes de contamination des milieux de culture.

Le sérum étant réparti dans les tubes stérilisés, ceux-ci sont mis dans une étuve à température constante dont l’action coagulera le sérum. La température de cette étuve doit être réglée à 70°, et il suffit d’un séjour de une heure et demie à deux heures pour que le sérum soit solidifié. Cette étuve à coaguler le sérum présente une disposition particulière : ses pieds de devant sont plus courts que ceux de derrière ; il en résulte que le fond, sur lequel on couche les tubes, est incliné et que le sérum, coagulé dans cette situation, donne un plan incliné lisse et solide sur lequel se feront les ensemencements. Un thermomètre, placé sur le fond de l’étuve, permet de contrôler la température, car le couvercle de l’étuve est en verre. Le sérum coagulé est jaune foncé, un peu transparent, ou bien blanchâtre et comme laiteux ; une petite quantité de liquide se sépare du sérum pendant sa coagulation et se collecte au fond du tube.

C’est sur la surface inclinée et lisse du sérum coagulé qu’on ensemence les microbes, contenus dans les fausses membranes ou dans la gorge du malade. En effet, il n est pas nécessaire de voir ce dernier ; une fausse membrane rendue par lui et conservée, sans adjonction d’aucun liquide, dans un tube stérilisé, peut être le point de départ de la culture. Il est évident que dans ce cas il faut éviter de plonger la production pseudo-membraneuse dans un liquide antiseptique qui tuerait les microbes ou dans de l’eau qui amènerait des microbes étrangers à la fausse membrane ; il est bon de se rappeler que les essences sont de puissants antiseptiques et que des flacons qui en ont contenu, doivent être évités pour l’envoi des fausses membranes.

Ensemencement des membranes, du mucus, des exsudats cutanés. — Pour ensemencer un tube de sérum on se sert d’une spatule en fer (sorte de fil de fer aplati à une extrémité), ou d’un gros fil de platine emmanché dans une baguette de verre. A défaut de spatule ou de fil de platine, un fil de fer assez mince recourbé en anse à son extrémité serait employé avec succès. La spatule (ou le fil est stérilisée par chauffage dans la flamme d’un bec de Bunsen ou d’une lampe à alcool, et on a soin de porter au rouge la partie qui sera introduite dans la gorge : on la laisse ensuite refroidir sans la déposer sur un objet quelconque qui pourrait la souiller, et il est bon de s’habituer à attendre un temps suffisant pour que la spatule ne soit plus chaude ; c’est en effet une faute que l’on fait souvent, de ne pas attendre assez longtemps et d’aller toucher le point o ii on veut prendre la semence avec une spatule trop chaude ; et nombre d’ensemencements qui restent stériles ne doivent cette stérilité qu’au fait que le fil,

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insuffisamment refroidi par un expérimentateur novice, a tué les microbes qu’il a touchés.

Pour prélever la semence des cultures, on va, avec l’extrémité de la spatule, gratter légèrement la surface d’une fausse membrane ou le point suspect de la gorge du malade. S’il n’y a pas ou s’il n’y a plus de fausses membranes, il faut toucher soit l’orifice d’une crypte amygdalienne, soit le sillon qui sépare le pilier postérieur ou le pilier antérieur de l’amygdale, et y recueillir un peu de mucus qui s’y trouve toujours. Les produits du jetage qui s’écoule des narines, les exsudats cutanés, anaux ou vulvaires serviront de la môme manière à charger de semence le fil de platine ou la spatule.

Il est bon d’insister quelque peu sur la façon dont la spatule chargée de microbes doit être introduite dans le tube de sérum et sur la façon dont elle doit être promenée à la surface du milieu de culture. Tenant la spatule entre le pouce et l’index de la main droite, on prend par le fond le tube de sérum, de la main gauche, en le tenant incliné. On débouche ce tube à l’aide du petit doigt de la main droite qui retiendra le tampon de ouate jusqu’à ce qu’on puisse reboucher le tube ensemencé et ce tampon ne doit être déposé sous aucun prétexte. L’ouverture du tube débouché, toujours maintenu incliné, est présentée à la flamme d’un bec de Bunsen ; puis la spatule est introduite dans le tube en évitant d’en toucher les bords et conduite jusqu’au fond de celui-ci. Elle est ensuite ramenée vers l’orifice en appuyant légèrement sur la surface du sérum la partie chargée de semence : on trace donc une raie à la surface du sérum. Ce mouvement est répété plusieurs fois et on fait ainsi plusieurs stries parallèles sur la face lisse du sérum coagulé. On retire alors la spatule, on flambe de nouveau l’orifice du tube, puis on

présente à la flamme le tampon de ouate toujours tenu par le petit doigt de la main droite et on bouche rapidement le tube ensemencé. On répète ensuite la même opération pour un deuxième et même un troisième tube, sans recharger la spatule ; mais, dans la pratique, un seul tube suffit en général pour obtenir une culture dont l’examen fixera le diagnostic.

Développement des cultures sur sérum coagulé. — Le tube, étant ensemencé, doit être maintenu à une température constante grâce à laquelle le développement du bacille de Lœffler se fera rapidement. On le porte, donc, après l’avoir étiqueté et daté, dans une étuve réglée à 37° : Nous avons vu en effet que la température optima de développement de ce microbe est comprise entre 35 et 37° ; grâce à cette chaleur le bacille végète rapidement et en général quinze à seize heures après l'ensemencement on voit déjà sur la surface du sérum de petites taches très nettes, qui sont des colonies du bacille de Lœffler : vingt-quatre heures après l’ensemencement, ces colonies ont pris, dans bien des cas, un aspect considéré comme caractéristique.

Aspect des cultures a l’oeil nu. — Lorsque le bacille de Lœffler est fort abondant, par rapport aux autres microbes, dans la gorge où a été prélevée la semence, il se peut, surtout si on examine la culture vingt-quatre heures après l’ensemencement , que ce seul examen permette d affirmer 1 existence du bacille diphtérique. Dans ce cas se sont développées à la surface du sérum de petites colonies arrondies, saillantes, à contours nets et réguliers, dont le centre est plus élevé et plus opaque que la périphérie : vues a la lumière réfléchie, elles sont de cou-

BACTERIOLOGIE CLINIQUE

leur blanc grisâtre un peu terne, et elles sont blanches si on les regarde par transparence à travers le sérum. Si on a eu soin d’ensemencer deux tubes sans recharger la spatule, il est rare que le deuxième ne donne pas des colonies séparées sur lesquelles on pourra étudier les caractères des colonies diphtériques. Mais si on n’a ensemencé qu’un tube et si la quantité de microbes prise comme semence a été considérable, il arrive que le développement des colonies donne, par leur confluence, une couche blanc grisâtre, d’aspect peu humide ou des traînées dans lesquelles on ne peut dislinguer les colonies : il faut alors employer la loupe pour rechercher les caractères de ces dernières, et l’emploi du verre grossissant doit être aussi recommandé lorsque l’examen du tube a lieu quinze ou seize heures après l’ensemencement, et que les colonies sont punctiformes.

Tel est l’aspect d’une culture de bacille de Lœffler pur : nous verrons plus loin que dans cette culture on peut trouver des bacilles de différentes longueurs, longs, moyens ou courts . Les cultures sur sérum du bacille long el du bacille moyen ne se distinguent pas entre elles; il en est souvent de même de celles du bacille court ; parfois cependant on voit à la surface du sérum des colonies plus blanches, d’aspect plus humide, qui se développent à une température bien inférieure à celle qu’exige le bacille de Lœffler typique : on trouve dans ces colonies un bacille court et trapu ressemblant au bacille de Lœffler et surtout au bacille pseudo-diphtérique de Hoffmann ; cultivé dans le bouillon, ce bacille garde sa forme. Nous verrons plus loin qu’on peut douter de sa spécificité.

Culture de Lœffler associée. • — Mais souvent la spatule, en prélevant la semence dans la gorge, ramène, en même

temps que des bacilles de Lœffler, des échantillons des microbes variés qui peuvent se rencontrer dans les angines : la plupart de ces espèces de microorganismes n’ont pas le temps de se développer d’une façon sensible en vingt-quatre heures, le sérum n’est pas un milieu tris favorable à leur développement et la température de 37° leur convient moins qu’au bacille de Lœffler. Pour toutes ces raisons il y a beaucoup de chances pour que les colonies bien développées sur sérum au bout de dix-huit à vingt-quatre heures, soient constituées par du Lœffler. Mais d’autres microbes peuvent donner des colonies dans le môme laps de temps, si le bacille diphtérique était associé, dans la fausse membrane, au streptocoque, au staphylocoque, etc. Dans ce cas, entre les colonies principales ayant les caractères des colonies du bacille de Lœffler, on voit d’autres colonies plus ou moins nombreuses, plus ou moins volumineuses. Nous entendons parler des cultures examinées de seize à trente-six heures après l’ensemencement, car plus tard il se développe à peu près toujours dans les cultures d’autres microbes que le Lœffler.

Les colonies autres que celles du bacille de la diphtérie, qui se développent après l’ensemencement des exsudats pharyngés sur sérum, sont surtout celles des staphylocoques, des streptocoques et beaucoup plus rarement du pneumocoque, du tétragène et des coliformes. Les staphylocoques et les streptocoques sont de beaucoup les plus importants de ces microbes, surtout le streptocoque, par suite du rôle qu’on lui a fait jouer dans l’exaltation de la virulence du bacille de Lœffler in vitro : il était donc naturel d attacher de 1 importance à son association avec le bacille diphtérique. Le streptocoque, au bout de vingtquatre heures, forme entre les colonies de Lœffler et sur-

tout sur les bords du sérum, de petites colonies blanches, bien moins volumineuses que celles du bacille de la diphtérie et très peu saillantes. Le staphylocoque pousse sur sérum souvent presque aussi énergiquement que le bacille de Lœffler. mais ses colonies, au bout de vingt-quatre heures, sont très blanches, très opaques, à aspect humide et gras : l’opacité de la colonie est totale alors que les colonies de diphtérie sont plus opaques au centre. Au bout de vingt-quatre heures le pneumocoque forme sur sérum une couche muqueuse, transparente, très peu développée et c’est l’examen microscopique qui le fait reconnaître et non l’examen direct de la culture : il en est de même des coliformes, dont les colonies blanchâtres, opaques et humides, sans bords réguliers, sont cependant parfois assez nettement visibles.

Conservées plusieurs jours à l’étuve, ces cultures changent d’aspect : les colonies de Lœffler deviennent plus étendues, puis cessent de croître assez rapidement. Le staphylocoque s’étend avec rapidité et envahit toute la culture : le streptocoque est plus discret et ses colonies sont toujours peu importantes.

Procédés d’examen microscopique. — Quelque typique que puisse être une culture, il est toujours nécessaire d’en faire un examen microscopique afin de vérifier les données de l’examen à l’œil nu ou à la loupe : l’emploi du microscope et des réactifs colorants est donc indispensable au médecin qui a peu l’habitude de ce genre de recherches. Cet examen microscopique est en réalité fort simple : nous allons indiquer dans tous ses détails une des manières, la plus pratique croyons-nous, d’y procéder.

Il faut commencer par préparer une lamelle couvreobjet sur laquelle on étendra la colonie prélevée dans

F intérieur du tube. On saisit cette lamelle de verre entre les mors d’une pince à pression continue de Cornet, pince dont l’avantage est de permettre le maniement de cette mince lamelle sans la briser et sans se souiller les doigts. On dépose ensuite une gouttelette d’eau stérilisée sur une face de la lamelle : la quantité d’eau ainsi déposée doit être très minime pour que la préparation ne soit pas longue à sécher. Puis, on flambe un fil de platine recourbé en anse à son extrémité : pendant qu’il refroidit sans contact pouvant faire cesser son asepsie, on prend de la main gauche le tube à culture qu’on veut examiner, on le débouche avec le petit doigt de la main droite, on en flambe l’orifice et on y introduit le fil de platine. Avec l’extrémité de celui-ci on va toucher une colonie examinée d’avance et reconnue comme devant être formée de bacilles de Lœffler: puis, retirant avec précaution le fil de platine, on rebouche le tube et on dilue, dans la gouttelette d’eau déposée sur la face supérieure de la lamelle, la colonie adhérente au fil de platine, en frottant quelques instants. On laisse sécher la préparation, ce qui ne demande qu’un temps très court.

Les microbes forment donc une mince couche sur une face de la lamelle : on fixe cette couche en passant trois fois la lamelle dans la flamme d'un bec de Bunsen ou d'une lampe à alcool, rapidement, de façon à ne pas griller les microbes et à faire seulement adhérer la préparation au verre.

Coloration dus microbes. — Il faut alors colorer celle-ci : bien des matières colorantes peuvent être employées , mais une des plus commodes, et qui donne constamment de bons résultats, est la solution de violet de gentiane anilinée. Cette solution ne se conservant que peu de temps doit être souvent renouvelée. Pour la produire on mélange

à 100 centimètres cubes d’eau distillée 3 centimètres cubes environ d’huile d’aniline blanche : on agite vivement et l'eau dissout la plus grande partie de l’huile. Néanmoins il reste en suspension dans l’eau un grand nombre de gouttelettes d’huile qui lui donnent un aspect laiteux et qu’il faut séparer de l'eau saturée d’aniline en filtrant sur un filtre en papier mouillé. Cette précaution d’humecter préalablement le filtre est destinée à empêcher les gouttelettes d'huile de traverser le papier. On mélange à l’eau anilinée filtrée 10 p. 100 environ d'une solution alcoolique concentrée de violet de gentiane et la matière colorante est prête à être employée. On en fait tomber quelques gouttes sur la préparation et on laisse le réactif colorant agir pendant trois à quatre minutes pour que la couleur pénètre les microbes. On peut activer la coloration en chauffant légèrement.

Lorsque les microbes sont colorés, on lave à l’eau, puis rapidement à l’alcool absolu pour enlever l’excès de couleur, puis à l’eau pour empêcher l’alcool de trop décolorer. On renverse ensuite la lamelle sur une lame de verre, on essuie la face supérieure et on examine au microscope. Dans ce cas, tous les microbes quels qu'ils soient sont également colorés : ils peuvent par leur abondance gêner la constatation des microbes les plus importants à reconnaître, et de plus certains bacilles peuvent être pris pour du Lœffler. Nous avons un moyen de rendre la préparation plus claire et de décolorer tout ce qui est microbe banal en employant la méthode de Gram.

Celle-ci est basée sur l’emploi delà solution iodo-iodurée dont voici la formule :

I gramme.

Iode métallique . .

lodure de potassium Eau distillée . . .

L’action de cette solution est telle que, si on la (ait agir après une matière colorante, elle fixe la couleur sur certains microbes de telle façon que l’action décolorante de l’alcool a beaucoup de peine à s’exercer sur ces microbes, si on lave la préparation à l’alcool , alors que d’autres se décolorent facilement. Lorsqu’un microbe, après l’action de la solution de Gram, ne se laisse pas ou se laisse très difficilement décolorer par l’alcool, on dit que ce microbe se colore par le Gram ou qu'il prend le Gram. Il en est ainsi pour le bacille de Lœffler, le streptocoque, le staphylocoque, le coccus Brisou, le pneumocoque de Talamon-Fraenkel , c’est-à-dire pour presque tous les microbes que l’on tient à constater dans la diphtérie : le colibacille se laisse décolorer par le Gram. Cette méthode apporte donc un élément précieux de diagnostic de l’espèce microbienne et de plus, en permettant de décolorer les microbes banaux, elle laisse en évidence ceux qui nous intéressent le plus dans cette étude, Lœffler, streptocoque et staphylocoque.

On emploie la solution de Gram de la façon suivante; lorsqu’on juge la coloration suffisante , on lave la prépation en laissant tomber à sa surface quelques gouttes de la solution iodée, qu’on fait agir pendant une à deux minutes : la préparation prend une teinte noirâtre. On la lave alors à l’alcool absolu, et quand on juge la décoloration suffisante, on lave la lamelle à l’eau distillée, on la renverse sur une lame de verre, on sèche sa face supérieure, et on l’examine comme précédemment, avec un objectif à immersion. La coloration du frottis de fausse membrane dont nous avons parlé plus haut se fait également par la méthode de Gram.

Examen d’une préparation microscopique. — Lorsqu'on

examine la préparation ainsi obtenue, on constate parfois, surtout si l’examen a lieu au plus tard vingt-quatre heures après l’ensemencement, que la lamelle ne porte que du bacille de Lœffler : ce bacille n’a pas toujours les memes caractères morphologiques et on est convenu de classer ses divers types en se basant sur la longueur des bâtonnets : on a donc trois variétés du bacille de Lœffler, le bacille long, le bacille moyen, le bacille court.

Le bacille long de Lœffler se rencontre le moins souvent des trois. 11 se présente sous forme de longs bâtonnets arrondis aux deux extrémités et souvent recourbés légèrement sur eux-mêmes : parfois le centre ou une extrémité se colore mal et il semble que le bacille est segmenté et granuleux. Ce microbe est disposé sous forme d’amas, comme de petits tas d’aiguilles jetées sur une surface plane, ou bien encore quelques-uns, en s’entrecroisant, forment comme les rayons d’une roue. Cet enchevêtrement du bacille long est typique : lorsque la colonie a été mal étendue sur la lamelle et que la préparation est trop épaisse, cette disposition des microbes donne l’apparence d'une sorte de feutrage.

Les bacilles moyens sont ceux que l’on rencontre le plus fréquemment : ils sont disposés quelquefois en amas, sans présenter cependant le même enchevêtrement que les bacilles longs ; le plus souvent ils sont rangés parallèlement les uns à côté des autres. Leur longueur est d’un tiers environ inférieure à celle du bacille précédent, leur largeur étant à peu près la même. Ils sont légèrement incurvés sur eux-mêmes. Parfois leur centre se colore moins bien que leurs extrémités arrondies qui sont un peu amincies.

Les bacilles courts de Lœffler sont rarement à l’état pur. Ce sont des bâtonnets environ moitié plus courts que

les précédents, et aussi larges, ce qui leur donne un aspect trapu : leurs extrémités sont souvent légèrement renflées. Ils sont le plus souvent disposés en rangées parallèlement les uns aux autres : quelquefois deux d’entre eux sont placés bout à bout et, dans ce cas, le plus souvent ils

Fig. 2. — Bacilles de Lœffler longs et moyens. (Préparation de M. Tollemer, dessinée par M. Clùcotol. )

forment un angle plus ou moins obtus. Parfois, en se réunissant, ils figurent assez exactement un V.

Les bacilles longs, moyens et courts existent rarement dans les cultures à l’état absolument pur. Le plus souvent il } a une prédominance d’une de ces variétés et en examinant quelque peu la préparation, on trouve quelques bacilles longs dans une culture de bacilles moyens ou un

certain nombre de bacilles courts : parfois les trois ordres de bacilles se rencontrent sur la même lamelle.

Nous avons vu, à propos des cultures, qu’il était en somme très rare que l’ensemencement n’ait introduit dans le tube de culture que du bacille de Lœffier. Dans les

Fig. 3. — Bacilles courts.

Préparation de M. Tollemer, dessinée par M. Chicolot.)

diphtéries où il est associé à d’autres microbes, il est très fréquent de conslater que le bacille n’existe pas seul sur la lamelle, et cela vingt-quatre heures après l'ensemence-

ment.

Les microbes que l’on peut trouver ainsi superposés à la préparation sont très variés. Les uns, cocci plus ou moins volumineux, diplocoques sans caractères spéciaux, sont

considérés comme ne jouant qu’un rôle secondaire ; ce rôle, s’ils en ont un, serait d’atténuer en quelque sorte la virulence du bacille de Lœffler et leur présence aurait une certaine valeur en ce sens que les cas où on les rencontre seraient en général des angines diphtériques bénignes. Il

Fig. 4. — Kacilles de Lœffler longs et moyens et staphylocoques. (Préparation de M. Tollemer, dessinée par M. Chicolot.)

en est de même du petit coccus Brisou, ainsi appelé du nom de 1 enfant dans la gorge duquel Roux, Yersin, B. Martin, 1 ont trouvé à diverses reprises. Le Brisou forme des colonies qui, au bout de vingt-quatre heures, sont aussi yisibles que celles du bacille diphtérique ; mais leur surface est plus humide, et elles paraissent translucides si on h s examine en interposant le tube entre la lumière et

les yeux, car leur centre n’est pas plus épais que leurs bords : au microscope, le coccus Brisou se montre sous forme de points isolés ou groupés deux par deux.

D’autres microbes associés au Lœffler sont plus importants à étudier, car ils peuvent avoir une virulence propre qui oblige à compter avec eux. Ce sont les staphylocoques, les streptocoques, le pneumocoque, le colibacille.

Le staphylocoque est caractérisé par sa disposition régulière en petits groupes placés les uns à côté des autres, rappelant ainsi l'aspect d une grappe de raisin ou de grains de plomb pressés les uns à côté des autres, sur une lame de verre. Il forme de petits amas entre les lots de bacilles diphtériques, ou il est mélangé à ceux-ci qu’il submerge en quelque sorte.

Les streptocoques constituent des chaînettes plus ou moins longues : parfois ils se présentent en forme de diplocoques qui peuvent former de courtes chaînettes de quatre à six éléments, mais on peut trouver des chaînettes beaucoup plus longues ; l’aspect de ces chaînettes est un peu variable, les grains qui les composent peuvent être plus ou moins volumineux et il existe très probablement des races spéciales de streptocoques dont la virulence et le rôle pathologique doivent varier.

Le streptocoque peut être plus ou moins abondant, et on peut trouver de longues chaînettes vingt-quatre heures après l’ensemencement ; quelquefois il ne devient évident qu'au bout de quarante-huit heures. Il en est de même du staphylocoque qui pousse énergiquement dès le début dans certains cas et, dans d’autres, tarde un peu pour se développer. Il est probable que la rapidité et l’abondance du développement du staphylocoque et du streptocoque ont une certaine signification au point de vue de la valeur de leur association au bacille de Lœffler. S’ils poussent

abondamment et énergiquement sur le sérum, c’est qu'il s sont abondants dans la gorge du malade et que par conséquent ils peuvent, s’ils sont virulents, ajouter à la gravité de la maladie.

Le pneumocoque se rencontre assez rarement dans les

Fig. 5. — Bacilles de Lœfller moyens et streplocoqnes. (Préparation de M. Tollemer dessinée parM. Cliicolot.)

préparations, du moins avec quelque abondance : il a la forme caractéristique de grains de blé ou de fers de lance, îéunis en diplocoques par leur extrémité arrondie, leur bout pointu étant dirigé en dehors. Les deux cocci constituant le diplocoque forment souvent un angle très obtus, thi sait que, dans les cultures, le pneumocoque de Talamon-b r.enkel n esl pas encapsulé. Il ne semble pas jouer

un rôle actif dans l’évolution de l’angine ; peut-être sa présence peut-elle prédisposer aux broncho-pneumonies.

Le colibacille se décolore par la méthode de Gram : aussi faut-il le chercher par la coloration simple. Joue-t-il un rôle dans l’évolution de l'angine? Ceci est douteux : cependant nous l’avons rencontré associé au Lœfller dans un cas d'angine toxique où le streptocoque ne put être rencontré malgré des cultures multiples.

Recherche de la virulence du Loeffler et des microbes associés. — Le diagnostic bactériologique du bacille de Lœfller s'appuie donc sur la rapidité du développement des cultures sur sérum, sur les caractères des colonies, sur les caractères morphologiques du bacille et sur ce fait qu’il reste coloré par la méthode de Gram. Il n’y a pas de diphtérie vraie sans bacilles.

Mais parfois on rencontre dans la gorge d’enfants sains un bacille qui ne diffère du bacille diphtérique qu’en ce qu’il n’est pas virulent. Est-ce un bacille diphtérique dénué de virulence? La chose est possible. En effet, on peut atténuer et rendre inoffensif le bacille diphtérique qui ressemble alors tout à fait au bacille pseudo-diphtérique ; mais on n’a pu, jusqu’à présent, rendre virulent le dernier bacille. Peut-être, toutefois, certaines conditions 'rougeole, scarlatine! permettraient-elles le retour à la virulence de ce bacille chez les sujets qui en sont porteurs (Houx et Yersin).

La constatation du microbe diphtérique dans une angine n'est pas toujours suffisante, car nous venons de voir que s’il n’y a pas de diphtérie sans bacilles de Lœfller, il peut y avoir des bacilles de Lœffler sans diphtérie : il peut donc être fort utile de rechercher quelle est la virulence du bacille isolé dans un cas donné. A la vérité la clinique

nous semble ici reprendre ses droits et l’état du malade tranchera souvent la question. S’il présente le tableau de l’angine toxique, nul doute que les microbes qu’il a dans la gorge ne soient très virulents et la gravité de l’affection correspondra au degré de toxicité des produits élaborés darçs les fausses membranes.

Mais, dans les angines associées, on peut avoir intérêt à savoir quelle est la virulence des divers microbes, pour essayer de débrouiller le rôle de chacun d’eux dans la production des phénomènes morbides. Il est pour cela nécessaire de les cultiver dans du bouillon afin de pouvoir, en injectant la culture à un animal, juger de son degré de toxicité.

Pour cela il faut les avoir en culture pure et par conséquent commencer par les isoler les uns des autres.

Nous avons déjà parlé du procédé d’isolement du Loeffler. Lorsqu’on veut isoler le bacille contenu dans une première culture impure, on prélève à l'aide du fil de platine stérilisé une petite parcelle d’une colonie dans laquelle un examen microscopique préalable a fait reconnaître la présence du bacille de Loeffler, on délaie cette parcelle de colonie dans quelques gouttes de bouillon stérilisé, et, avec un fil de platine stérilisé trempé dans ce bouillon, on ensemence un tube de sérum en traçant, à la surface de ce milieu solide, plusieurs stries parallèles. On répète la même opération pour un deuxième et un troisième tube sans recharger le fil de platine, et on met les trois tubes à l’étuve, à 37". Il se développe en vingtquatre heures des colonies isolées peu nombreuses, surtout dans le troisième tube.

Choisissant une des colonies les plus caractéristiques de celui-ci, on vérifie sa pureté en prélevant une parcelle, puis on ensemence du bouillon de veau alcalinisé

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avec cette même colonie. Ce bouillon est mis à l’étuve à 37° et le bacille de Lœffler y pousse rapidement. La réaction du liquide, d’abord alcaline, devient acide, de petits grumeaux de microbes se développent et s’accolent aux parois du verre ; puis la réaction devient de nouveau alcaline et la virulence de la culture peut être expérimentée. Si on inocule sous la peau une petite quantité de cette culture à un cobaye il meurt en quelques jours avec un œdème sanguinolent au point d’inoculation et il présente les lésions que nous avons étudiées à propos des expériences de Lœffler. La rapidité de la mort, les phénomènes d'infection plus ou moins aigus, les paralysies qui surviennent si l'animal survit quelque temps, permettent de juger de la toxicité de la culture.

Pour isoler le staphylocoque il suffit de faire une culture sur plaque de gélatine à 20° ; le staphylocoque se développe facilement à cette température à laquelle le bacille de Lœffler ne végète pas. Il se développe de petites colonies qui liquéfient la gélatine. On prélève ensuite une parcelle de colonie du staphylocoque et on la porte dans du bouillon où le microbe cultive ; en général l’inoculation de la culture de staphylocoque donne un abcès plus ou moins étendu, rarement une infection généralisée.

Pour isoler le streptocoque, on ensemence la culture mixte de Lœffler et de streptocoque sur un tube de gélose. A la température de 30 à 33° on obtient de petits mamelons blancs de 2 à 3 millimètres de diamètre, se développant sur toute la surface du tube. Le bacille de Lœffler cultive mal sur gélose où ses colonies restent punctiformes. On ensemence sur un nouveau tube une des colonies de streptocoques et, à l’aide d’une des colonies qui se développent pures dans ce nouveau tube, on ensemence un tube de bouillon. La virulence de ces cultures est extrê-

mement variable ; parfois leur inoculation au lapin ne provoque que quelques petits abcès ; d'autres fois elle produit une inflammation très vive, un véritable phlegmon ou bien une infection purulente rapidement mortelle.

On peut observer tous les degrés dans la virulence des microbes isolés dans une angine diphtérique. On admet en général que l’association des microbes dans la gorge peut avoir une grande importance, en particulier celle du streptocoque et du bacille de Lœ filer. Roux et Yersin sont en effet arrivés à rendre très virulentes des cultures de bacille diphtérique peu actives, en associant au Lœffler un streptocoque très virulent et en inoculant le mélange à des cobayes. En est-il de même dans la gorge d’un malade atteint de diphtérie, où la virulence se montre alors que les microbes ont été fort peu de temps associés ? Il est certain qu’on rencontre fréquemment dans des angines d’intensité moyenne un streptocoque abondant associé à du Lœiïler et que néanmoins les malades guérissent facilement ; il est encore possible que l’action du streptocoque dans les cas où il est très virulent s’exerce surtout par la rapidité avec laquelle il provoque des troubles généraux importants.

Certaines angines à streptocoque éveillent par la violence et la brusquerie de leur début l’idée d’une violente infection : le poison sécrété par le streptocoque diffuse donc rapidement dans l’organisme. Cette infection si aiguë ne peut-elle, en diminuant la résistance de l’organisme d’une façon soudaine et considérable, le rendre beaucoup plus sensible à l’intoxication par le poison diphtérique qui s’absorbe et diffuse plus difficilement que le poison streptococciquc ? Les variations si grandes dans la virulence du streptocoque expliquent qu’on puisse le rencontrer dans les angines diphtériques bénignes.

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Les bacilles de Lœffler peuvent être également virulents quelle que soit leur longueur ; si les bacilles longs et moyens sont le plus souvent virulents on peut en isoler d’à peu près inactifs et même de complètement inoffensifs. En revanche, le bacille court, souvent peu virulent, peut, dans certains cas, posséder une virulence considérable.

Le professeur Spronck, d’Utrecht, a mis en doute la spécificité d'un bacille court de la diphtérie qui ne tue pas les animaux, mais leur donne de l’œdème. En effet l’injection de sérum antidiphtérique n’empêche pas l’œdème de se produire lorsqu’on inocule une culture de ce bacille à un animal, ce qui a lieu pour le bacille de Lœffler. Spronck en conclut que ce bacille court n’est pas un bacille diphtérique.

Pour L. Martin certains bacilles courts sont des bacilles diphtériques dégénérés; il a pu, en partant d’une culture de bacille long typique, datant de huit mois, reproduire un bacille court. Pour cela, la culture fut faite dans du bouillon de veau récemment préparé et étendu sur une couche de gélose, dans une boîte de Pétri. La culture de ce bacille court, inoculée au cobaye, ne le tue pas, mais lui donne de l’œdème. Inoculée au moineau, elle le tue; mais l'inoculation préventive de sérum antidiphtérique empêche l’action de cette culture de tuer l’oiseau. Cette intéressante expérience prouve donc bien que certains bacilles courts peuvent être diphtériques, comme celle de Spronck démontre que certains autres ne sont pas spécifiques.

Il nous semble certain, que, si on confronte soigneusement les résultats bactériologiques et les constatations cliniques, on arrivera facilement à la conviction que tous les bacilles courts qui donnent en vingt-quatre heures des

colonies blanches sur sérum et se colorent par le Gram ne sont pas tous des bacilles de la diphtérie. Il faut donc être très réservé sur le diagnostic de diphtérie si la culture ne donne que des bacilles courts en culture pure, sans aucun mélange de bacilles moyens ou longs.