Fixation et durcissement

. Le but de la fixation est de conserver absolument la structure cellulaire naturelle. L'histologie normale de l'organe auditif et surtout les dispositions anatomiques compliquées du labyrinthe membraneux, ne peuvent en aucune façon être étudiées avec fruit, sans que la pièce soit traitée au préalable par les moyens de fixation. C'est surtout ici, où il s'agit de faire ressortir aussi nettement que possible, dans l'image microscopique, des éléments cellulaires protoplasmatiques bien déterminés, qu'il faut recourir aux méthodes les plus délicates de la technique histologique, non-seulement pour faire voir la structure microscopique des organes extrêmement délicats de l'oreille, mais encore tout particulièrement pour faire ressortir les éléments protoplasmatiques plus importants. Outre les méthodes de fixation habituelles des pièces, leur imprégnation par des sels métalliques (osmique, or) trouve ici un emploi étendu ; les éléments nerveux de l'oreille interne, les terminaisons cellulaires du nerf auditif surtout, grâce à leur réaction chimique particulière se présentent ainsi à l'examen sous un autre aspect et avec une coloration tout à fait spéciale.

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Plus la pièce est fraîche , plus les images obtenues par le traitement fixateur, sont fidèles à la nature Le's imprégnations métalliques surtout, pour donner des résultats , doivent être faites sur des organes auditifs absolument frais. Les méthodes d'aurification des coupes employées en neurohistologie (Freud) ne trouvent en oto-histologie qu'un usage très limité, car la décalcification préalable et indispensable de la pièce, enlève d'habitude au protoplasme cellulaire ses propriétés réductrices.

Il faut adopter comme règle générale, que les organes auditifs dont il s'agit, doivent être placés directement dans le liquide fixateur, sans avoir été lavés à l'eau et après avoir été débarrassés des parties inutiles fixées à l'extérieur. Comme la plupart des substances employées peuvent servir en même temps comme agents de durcissement, de conservation et même de décalcification, il faut laisser les organes auditifs soumis à la préparation dans la solution en question, jusqu'à ce que l'on ait pu s'assurer que le durcissement des parties molles ou la décalcification a atteint le degré suffisant.

1. Acide chromique et ses sels. L'acide chromique en solution aqueuse de 0,1 à 1 °/0 possède aussi bien des propriétés de fixation que de durcissement, de conservation et de décalcification et constitue par conséquent un agent précieux pour notre but. Le seul désavantage qu'il présente, mais seulement lorsqu'on l'a employé pendant fort longtemps, c'est que les pièces prennent souvent une coloration verdâtre foncée d'oxyde chromique réduit ; les parties molles de l'organe auditif perdent ainsi en partie leur propriété et se laissent imprégner par les couleurs de carmin, d'hématoxyline et d'aniline.

Les plus employés comme agents fixateurs, sont le bichromate de potasse et d'ammonium en solution à 2% et le liquide de'Miiller ou mélange de deux parties de bichromate de potasse, une partie de sulfate de soude et cent parties d'eau. En renouvelant tous les jours ces liquides, dont il faut employer de grandes quantités , on obtient au bout d'une à trois semaines, souvent déjà en peu de jours, une fixation durable des tissus de l'organe auditif et l'on procède ensuite à la décalcification.

2. Le liquide fixateur de Tafani jouit en oto-histologie d'une réputation particulière. Il est formé de 80 parties d'une solution aqueuse de bichro mate de potasse à 0,4 % et de 20 parties d'une solution aqueuse d'acide hyperosmique à 1 0/o. Les deux liquides ne doivent être mélangés qu'au moment de l'emploi. Après que la pièce , placée dans la solution, y est restée 24 heures , la fixation et la réduction de l'acide osmique sont suffisantes.

3. Le liquide fixateur à l'acide chromique et à l'alcool, moins coûteux , proposé par Vlakovits, que j'emploie souvent pour la fixation de pièces pathologiques , rend également de bons services ; il est composé d'une partie d'une solution aqueuse d'acide chromique à 5% et de 16 parties d'alcool à 90° ; en 24 heures il produit une fixation suffisante. Le durcissement consécutif doit se faire dans l'alcool.

Le mélange suivant, proposé par Urban Pritchard, constitue un liquide fixateur fort recommandable pour les organes auditifs normaux et patholo-

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giques : acide chromique cristallisé 1 gramme , eau distillée 20 grammes , alcool à 90° 180 grammes ; l'objet y est laissé pendant sept à huit jours.

4. Avec le liquide de Zencker, le durcissement dure 24 heures. Il est composé d'un mélange de sublimé 5,0 , bichromate de potasse 2,5 , sulfate de soude 1,0, eau distillée 100,0, acide acétique glacial 5,0. Quand la fixation est complète , les pièces sont lavées à fond dans de l'eau et durcies dans de l'alcool à 30, 60 , et 90°. Ce liquide permet la coloration avec toutes les substances colorantes en usage, de même que celle des bactéries. La coloration des gaines de la moelle, suivant Weigertet Biondi, n'est cependant obtenue que si le sublimé en excès a été enlevé soigneusement par l'alcool iodé.

5. La formaline est actuellement le liquide le plus en usage en oto-histologie et le moyen de durcissement le plus pratique. Elle est employée en dilution à 10 °/0 et elle durcit en 4-5 jours. Après un lavage à fond dans l'eau, la préparation est durcie dans de l'alcool à 30, 60 et 70 °/0.

Les avantages de cette méthode de durcissement sont : 1° la rapidité du procédé; 2° le maintien exact de la coloration naturelle de toutes les parties.

6. L'acide picrique doit encore être mentionné ; il est employé comme moyen de durcissement dans une solution aqueuse , à saturation ; dans les examens oto-histologiques , il n'est pas recommandable , parce qu'il ne peut être employé que pour de très petites pièces.

7. Dans mon laboratoire , j'emploie le plus souvent comme liquide de fixation un mélange de deux parties de formaline et d'une partie de liquide de Millier. Les résultats de cette méthode dépassent ceux de toutes les autres.

8. Pour les recherches d'histologie pathologique , surtout lorsqu'il s'agit de l'étude de prolifération cellulaire pathologique , la méthode de fixation de Flemming , généralement employée pour démontrer la division des noyaux, doit être spécialement recommandée. La solution de Flemming est composée de 15 parties d'une solution d'acide chromique à 1 %, 4 parties d'une solution d'acide osmique à2°/0, et une partie d'acide acétique glacial. Les tissus à l'état aussi frais que possible y sont laissés pendant 2-3 jours, puis décalcifiés après avoir été bien lavés, enfin durcis dans l'alcool ; alors on fait des coupes et on les colore à l'aide de couleurs d'aniline colorant les noyaux. (Voyez technique de la coloration.)

9. La fixaton par le sublimé donne aussi de bons résultats dans certains cas , où il s'agit de figurer la division des noyaux. Les pièces ne restent que quelques heures dans un mélange d'une solution de sublimé à 8,5%, à saturation par la chaleur et d'une autre de chlorure de sodium à 0,5 °/0. Alors elles sont lavées à fond et durcies dans l'alcool à 30,70 et 90 %. Après avoir enlevé le mercure de la préparation , il faut prendre de très grandes précautions avant la décalcification.

10. La solution d'acide nitrique à3°'0, recommandée par Altmann, donne aussi de bons résultats ; en raison de ses remarquables propriétés décalcifiantes elle paraît surtout appropriée à des recherches oto-histologiques. (La coloration consécutive doit se faire par l'hématoxyline. )

Imprégnation des préparations de l'oreille par l'or 199

11. Imprégnation par des sels métalliques. Pour les études oto-histologiques , on traite surtout les pièces par l'or et l'acide osmique. En effet , l'action des combinaisons d'or et d'acide osmique sur les tissus ne se borne pas à fixer parfaitement les éléments de structure, mais de plus, et ceci est d'une importance toute spéciale pour l'examen histologique du labyrinthe et de l'appareil de transmission, le métal se dépose sous l'orme de fines granulations dans certains éléments des tissus (nerfs, cellules épithéliales , etc.), grâce à leurs propriétés réductrices ; ces éléments apparaissent alors dans l'image microscopique fort bien différenciés. Aussi employons-nous surtout les imprégnations métalliques pour la préparation des vaisseaux et des nerfs du tympan, de la muqueuse de la caisse et de la trompe et des terminaisons nerveuses dans les saccules, les ampoules et l'organe de Corti. Les parties de tissus, que l'on veut soumettre à l'imprégnation métallique, doivent être placées dans le liquide fixateur en question, à l'état aussi frais que possible , sans avoir été soumises au préalable à un autre traitement (alcool, acide chromique, etc.). Le liquide fixateur doit être conservé dans une bouteille brune et dans un endroit obscur, pour être soustrait à l'action altérante de la lumière du jour.

I. Aurification. Comme réactif on emploie exclusivement le chlorure d'or en solution aqueuse à '/2-l°/o- Pour activer la réduction, après que la solution métallique a produit son action, on emploie un acide organique faible (acide formique ou acide acétique).

L'effet le plus caractéristique du chlorure d'or, c'est de colorer les cylindresaxes des nerfs et les terminaisons nerveuses du labyrinthe en violet foncé jusqu'au rouge noir foncé. Les vaisseaux et les nerfs du tympan et de la muqueuse de la caisse, le protoplasme cellulaire des divers épitheliums et endothéliums (muqueuse, tympan, labyrinthe membraneux, etcô se colorent de même ; il faut cependant pour cela qu'on les examine à l'état absolument frais.

Méthodes : a) Les organes auditifs frais ou des parties de ces organes sont d'abord placés dans une solution de chlorure d'or à 0,5 °/0. La durée du séjour dans cette solution dépend de la nature du tissu auquel on a affaire et du volume de la pièce. Les membranes, le tympan, la muqueuse de la caisse tympanique et de la trompe, les saccules et les canaux demi-circulaires y sont laissés pendant un quart d'heure ; les tissus plus volumineux, la trompe d'Eustache, la cavité tympanique, la pyramide, pendant une demi-heure jusqu'à une heure entière. Ensuite les pièces traitées par l'or sont exposées à la lumière, conservées pendant 24 heures dans un liquide qui renferme 10 goutte d'acide formique pour 10 grammes d'eau. Pour les tissus riches en sels de chaux, la solution de sel d'or doit être plus forte ; pour- l'organe de Corti, elle doit être environ à 5 °/0. Les pièces prennent à la surface une teinte violette foncée.

b) Une autre méthode consiste à placer les parties de l'organe auditif dans une solution de chlorure d'or à 0,5 °/0, à laquelle on ajoute une petite quantité d'acide acétique et à les y laisser pendant un quart d'heure à une heure, jusqu'à ce qu'elles aient pris une coloration jaune paille. On lave ensuite la pièce dans l'eau distillée et on la conserve pendant 24 à 48 heures dans de l'eau acidulée par l'acide acétique, dans

200 et l'acide osmique au point de vue histologique.

un endroit clair, jusqu'à ce que la réduction voulue ait été obtenue. La couleur de la pièce est alors devenue bleu rouge foncé, violet, bleu ou gris foncé. Durcissement consécutif dans l'alcool.

c) Le docent docteur E. Berger, à Paris, suit le mode d'aurification suivant, que j'ai employé avec avantage pour les organes de Corti de jeunes animaux fraîchement tués. Les organes auditifs frais sont placés dans une solution dont la composition est la suivante : 1 °/0 de chlorure d'or, 1 °/0 d'acide chlorhydrique, 23 0/o de glycérine et 75 °/0 d'eau distillée. Les pièces y demeurent de 6 à 8 heures jusqu'à coloration bleu foncé, puis on les lave à l'eau et on les durcit consécutivement dans l'alcool. Je décalcifie ensuite les pièces à l'aide d'une solution saturée d'acide picrique.

d) On obtient aussi une bonne réduction par l'emploi de l'alcool amylique (une goutte pour 10 grammes d'eau) ; on l'emploie comme moyen de réduction seul ou combiné avec l'acide acétique ou formique, après imprégnation par l'or.

Stôhr fait bouillir 8 centimètres cubes d'une solution de chlorure d'or à 1 °/0 avec 2 centimètres cubes d'acide formique dans une éprouvette et laisse refroidir ensuite. L'objet est placé dans l'obscurité pendant une heure dans ce mélange, puis lavé à l'eau distillée et exposé à l'air dans un mélange de 10 centimètres cubes d'acide formique et 40 centimètres cubes d'eau distillée. La réduction est accomplie après 24 à 48 heures. Conservation de la pièce dans l'obscurité, dans l'alcool à 70 % puis à 90 °/'o pendant huit jours.

L'imprégnation par l'or, de même que celle par l'acide osmique n'atteint que les couches superficielles, car les modifications chimiques qui résultent des réactions spéciales des tissus empêchent les solutions de sels métalliques de pénétrer plus avant dans la profondeur. Aussi, si l'on veut obtenir de bonnes images par réduction, on doit , avant tout, veiller à ce que le tissu à traiter par l'or soit suffisamment en contact avec la solution de chlorure d'or. Pour l'examen du revêtement de la cavité tympanique et des organes membraneux du labyrinthe, il faut donc ouvrir ces cavités d'une manière convenable, sans léser les parties importantes. Cela se fait, pour la cavité tympanique, à la voûte de la caisse du tympan ; pour le labyrinthe, au canal demi-circulaire supérieur, éventuellement par une piqûre dans la membrane de la fenêtre ronde.

S'il s'agit simplement de traiter par l'or le tympan ou la muqueuse isolée de la cavité tympanique et de la trompe, la surface libre de ces organes, pour rendre possible l'action directe de la solution métallique, doit être d'abord débarrassée des sécrétions et des dépôts épithéliaux accidentels , en y appliquant à l'aide du pinceau une solution indifférente de chlorure de sodium (;o,6 °/0).

Le durcissement consécutif des tissus traités par l'or se fait dans l'alcool ; la décalcification éventuelle des rochers moins consistants (animaux jeunes, embryons) par l'acide picrique, des rochers résistants par l'alcool ou l'acide nitrique (voyez méthodes de décalcification).

II. Traitement par l'acide osmique. L'acide osmique en solution à0,5-2°/o, pour la fixation et la réduction de tissus frais de l'organe auditif, est employée lorsqu'il s'agit de démontrer des vaisseaux

Imprégnation des préparations de l'oreille par or, etc. 201

sanguins, des fibres nerveuses à moelle et la dégénérescence graisseuse pathologique d'éléments cellulaires. Comme les corpuscules rouges sont colorés en brun foncé par l'acide osmique, les vaisseaux qui en sont remplis se détachent du reste des tissus sous l'aspect de cordons d'un brun noir foncé. Tous les tissus contenant de la graisse prennent, par la réduction à l'acide osmique, une coloration bleu noirâtre ; la moelle des nerfs et les cellules contenant de la graisse doivent être rendues ainsi parfaitement reconnaissables. Comme dans le traitement par le chlorure d'or, la réduction • par l'acide osmique se borne principalement aussi à la surface de la préparation ; il faut donc observer ici aussi toutes les précautions que l'on prend en traitant par l'or. Le changement de coloration se produit le mieux sur les pièces fraîches, beaucoup moins bien sur les pièces durcies, surtout sur celles traitées par l'alcool, parce que celui-ci enlève aux tissus une partie de leur contenu graisseux.

Règle : Les parties de l'organe auditif en question ou tout l'organe sont placés dans une petite quantité (1 à 8 centimètres cubes) proportionnée au volume de l'objet à examiner, d'une solution aqueuse d'acide osmique à 1-2 % et y restent, dans un endroit obscur, jusqu'à ce que le durcissement et la coloration en bleu se soient produits (1-24 heures). Ensuite pendant quelques heures, lavage répété et intensif dans de l'eau distillée, à renouveler souvent, à laquelle on ajoute quelques gouttes d'acide acétique ; puis lavage d'égale durée dans une solution à 6 °/0 de sel marin. Les parties molles sont ensuite conservées dans de l'alcool graduellement plus concentré, les parties osseuses sont décalcifiées d'après une des méthodes à décrire plus tard.

III. Le chlorure de palladium agit sur les nerfs et le protoplasme de la même manière que le chlorure d'or. Le docteur Schônlein, de Halle, a proposé une méthode combinée par l'acide osmique et le palladium pour la fixation et la coloration par réduction du labyrinthe membraneux.

Voici la méthode: Le limaçon isolé par la préparation, est placé dans une solution d'acide osmique à (/2 °/0 , après qu'on a enlevé l'étrier de la fenêtre ovale et y reste pendant 24 heures. Il est ensuite lavé et placé dans une solution de chlorure de palladium à 0,1 °/00 , à laquelle il faut ajouter 10 gouttes d'acide chlorhydrique. Cette solution sert en même temps à la décalcification. La solution doit être bien agitée plusieurs fois par jour et additionnée tous les jours d'une goutte d'acide nitrique , jusqu'à ce que la décalcification soit parfaite. La durée de l'opération varie de trois à six semaines, d'après la dureté de l'os. Ensuite lavage à fond, durcissement dans l'alcool absolu , montage dans la celloïdine et préparation de coupes microscopiques.

Les sels d'acide chromique, décrits plus en détail au commencement de ce chapitre, donnent en même temps aux parties molles de l'organe auditif la dureté nécessaire pour que l'on puisse pratiquer des coupes. Plus la quantité de liquide employée est grande , plus on renouvelle rapidement celui-ci, plus aussi le durcissement est complet. On se sert rarement, en oto-histologie, du durcissement rapide par l'alcool absolu qui produit des coagulations gênantes ; en renouvelant deux à trois fois le liquide , la pièce est absolument durcie et se laisse couper après un seul jour.

202 Méthodes de décalcification.

Après fixation suffisante , la pièce est lavée à fond dans l'eau distillée et placée pour achever de la durcir et la conserver , soit dans l'alcool de plus en plus concentré , soit dans un liquide à décalcification pour être décalcifiée éventuellement. (Voyez « Décalcification ».)