Analyse des extraits alcooliques

On dose immédiatement les sucres réducteurs libres R;'par la méthode de BERTRAND [9;] ; une première lecture au polarimètre

donne la déviation initiale x. Un second dosage, exécuté après hydrolyse par la sucrase, indique la quantité R: de réducteur présent après action de ce ferment ; la différence R,-R; correspond au sucre interverti libéré par l’invertase. Le plus souvent, les extraits végétaux renferment le mélange banal : saccharose, glucose, lévulose ; dans ce cas, le pouvoir réducteur, après traitement par les acides forts dilués (R;,) est le même qu'après hydrolyse par sucrase : R: — Rè

Les méthodes permettant d'apprécier les proportions relatives de ces trois sucres dans leurs mélanges ont été maintes fois exposées (H. CoziN [18]). Mais quand la liqueur renferme en plus quelqu'autre glucide non tributaire de la sucrase, R;, est supérieur à R,. I y a lieu alors d’apporter quelques modifications à la marche générale de l'analyse.

Il faut avant tout isoler le glucide inconnu à l’état cristallisé pour l'identifier. Cela fait, il reste à établir une méthode rapide de dosage permettant de suivre les variations de ce principe dans les organes végétaux où sa présence a été reconnue.

Cette difficulté se présente précisément pour les analyses de Haricot et de Bolbostemma: la première de ces plantes renfermant du stachyose, la seconde du maltose ; voici de quelle façon nous l’avons résolue :

a) Mélange de slachyose, de saccharose et de sucres réducteurs. — Le stachyose, comme l’a montré Ch. TANRET [86], est un tétrasaccharide qui se dédouble, sous l’action des acides faibles ou de la sucrase, en une molécule de manninotriose et une molécule de lévulose. On obtient le même résultat en traitant ce sucre à l’ébullition pendant quelques minutes par les acides forts {rès dilués ; mais, si l’attaque est prolongée, le manninotriose se scinde, à son tour, en deux molécules de galactose et une molécule de glucose. L’hydrolyse totale du stachyose est donc représentée par l'équation :

C22H32021 + En H20O = CSH12206 + CSH205 + 2 (CSHE20f) Stachyose Lévulose Glucose 2 Galactoses Aussi un extrait de plante renfermant du stachyose déjà

hydrolysé par la sucrase verra-t-il son pouvoir réducteur augmenter de façon notable sous l'action: prolongée: de l’acide- chlorhydrique

dilué. Par contre, son pouvoir rotatoire diminuera, les produits de l'hydrolyse totale du stachyose ayant un pouvoir rotatoire moyen [an | — + 3009, très inférieur à celui du mélange équimoléculaire de lévulose et de manninotriose [an | — + 990,3.

L'hydrolyse du stachyose sous l’action des acides forts est incomparablement plus pénible que celle du saccharose ; pour qu'elle soit totale, il faut plusieurs heures de chauffe en présence d'acide chlorhydrique N7/5. Ce traitement a l'inconvénient d’altérer les produits d'hydrolyse, le lévulose surtout (1) ; aussi, dans la pratique, est-il préférable d'opérer l’hydrolyse du manninotriose au moyen de l’émulsine des amandes (VINTILESCO: [89]), surtout si l’on: a à doser le stachyose dans un extrait renfermant, en outre, des hexoses et du saccharose.

L'essentiel est de remarquer que la différence R;,-R: représente le pouvoir réducteur total des produits de l'hydrolyse complète du stachyose, diminué de celui du mélange équimoléculaire de lévulose et de manninotriose résultant du dédoublement da tétrasacaharide par la sucrase.

Soit une solution de stachyose pur à 1 °, son pouvoir réducteur est nul, observée au tube de 2 dm. et à la température de 150 elle dévie la lumière polarisée à + 2097. Onla soumet à l’action de la sucrase, il se forme 0 gr. 270 de lévulose et Ogr. 755 de manninotriose, la déviation polarimétrique devient + 2002, le pouvoir réducteur est égal à celui d’une solution de glucose à 0 gr. 5199/ (2).

On fait agir ensuite l'émulsine jusqu'à hydrolyse complète du manninotriose. On a, dès lors, un mélange de lévulose (0 gr. 270), de glucose (0 gr. 270) et de galactose (0 gr. 540), dont le pouvoir réducteur est sensiblement égal à celui de 1 gr. 08 de glucose et donnant aw tube de 2 dm. une déviation de + 0066.

La. différence R, - R; pour une solution de stachyose à L gr. % étant 1,080 — 0,519: — 0,561, il suffira donc,pour connaître la teneur

(4) Ch. TaxrEeT [86h] a. observé qu'après. 3 heures d’ébullition avec SO4H2 à 3 % le pouvoir rotatoire [æp] du galactose tombe à + 779,5, celui du glucose à + 50°, celui-dwlévulose devient — 6302, après 2 heures de chaufle seulement, — 55° après 3-heures. et — 45° après 4 heures.

2 Un gramme de manninotriose réduit comme 0,33 de glucose, en sorte que le pouvoir réducteur du mélange équimoléculaire de- lévulose et de manninotriose est sensiblement la moitié de celui du glucose.

en stachyose d’une liqueur renfermant ce glucide seul ou en mélange avec du saccharose et des hexoses, de multiplier par le coefficient

— 1,78 l'augmentation du pouvoir réducteur exprimée en

0,561 glucose que provoque l'émulsine ou les acides forts sur cette liqueur préalablement traitée par la sucrase.

Lorsque le saccharose est accompagné de stachyose, il est bien évident qu’on ne peut calculer la proportion du sucre de canne qu'une fois connue celle du tétrasaccharide, car, dans la différence Re - PR, il faut tenir compte du lévulose enlevé au stachyose par la sucrase ainsi que de la réduction due au manninotriose.

Comme une molécule-gramme de stachyose, 666, donne, sous l'action de l’invertine, 684, du mélange équimoléculaire de mannino-

triose et de lévulose réduisant sensiblement comme FR glucose, on multipliera la quantité de stachyose trouvée auparavant par le oo — 0,513 et l’on soustraira le nombre ebtenu de la

différence R2 - R, ; le résultat final multiplié par 0,95, pour tenir compte de l’eau d’hydrolyse, donnera la teneur en saccharose.

b) Mélange de maltose, hexoses et saccharose. — Rien de plus simple que de titrer une solution de maltose pur, ce sucre étant directement réducteur, il suffit de doser par la méthode de G. BERTRAND [9] et de se reporter aux tables dressées par cet auteur. Mais lorsque le maltose est accompagné d’hexoses et de saccharose, comme il arrive dans notre cas, comment l’évaluer indépendamment des autres glucides ?

L. LE GRAND [50] a préconisé pour le dosage des disaccharides réducteurs, lactose et maltose en présence d’hexoses, l’emploi simultané des liqueurs de Barfoed et de Fehling. L’acétate de cuivre, en solution acétique, n’est réduit ni par le sucre de lait ni par le maltose, alors qu'il l'est par les autres sucres réducteurs ; la liqueur cuprosodique, au contraire, est attaquée à la fois par les hexoses et pa les disaccharides réducteurs. Après avoir dosé d’abord la totalité des sucres par la liqueur de Febling, puis les hexoses par la liqueur de Barfoed, on doit théoriquement connaître par différence la quantité de maltose présent. \‘

En réalité, ce dernier sucre n'est pas complètement sans action sur la liqueur cupro-acétique, il la réduit faiblement (NoTTIN [63]).

Il n’est pas non plus sans inconvénient de calculer le maltose par différence entre les résultats obtenus par deux sortes de manipulations non identiques bien qu’assez voisines ; les chances d’erreur sont plus grandes que si l’on partait de dosages effectués dans des conditions tout à fait semblables.

La méthode de LE GRAND est donc peu indiquée pour apprécier de faibles quantités d'hexoses à côté de masses de maltose. Il serait encore plus imprudent de se baser sur elle pour caractériser des traces de maltose dans un mélange complexe.

Enfin, il faut encore ajouter qu'en présence de sels alcalins ou alcalino-terreux, aux concentrations supérieures à 1 pour 1000, la liqueur de Barfoed à l’ébuilition précipite de l'acétate basique de cuivre et qu’alors la liqueur n’est plus réduite par le sucre (LE GRAND. [50|]).

Pour toutes ces raisons il convenait de s'adresser à une méthode plus simple.

Un procédé biochimique assez exact, mais long pour doser le maltose en milieu complexe, consiste à ensemencer les liqueurs étudiées avec une levure incapable d'utiliser le maltose, tout en consommant les autres sucres. La différence entre le pouvoir réducteur d’un témoin stérilisé et celui de la solution fermentée permet de doser directement le maltose. Cette méthode n’a été utilisée ici qu'à titre de contrôle (1).

Il est infiniment plus simple de déduire la teneur en maltose de l'augmentation du pouvoir réducteur à la suite de l'addition de maltase (2). Nous nous sommes servi à cet effet de la poudre fermentaire préparée avec le mycélium du Mucor Boulard. Celle-ci renfermant en outre de la sucrase ne doit être utilisée que sur des liqueurs préalablement traitées par l'invertase.

(1) Les levures suivantes remplissent cette condition : Saccharomyces Marxianus Hansen, Willia anomala Steuben, Willia Saturnus Kilocker, Saccharomycodes Ludwigit Hansen. Trois de ces levures nous ont été aimablement procurées par M. Guilliermond, à qui nous adressons nos remerciements.

(2) Ici encore l’emploi des acides forts est à rejeter : l'hydrolyse du maltose néces-

site une attaque énergique qui ne va pas sans altération des autres glucides.

FRANQUET. — Genèse de l’amidon

Pour estimer à quelles quantités de maltose correspondent les diverses valeurs de la différence R;—R; (R; étant le réducteur après traitement par la poudre de Mucor et R, le réducteur après action de la sucrase), le mieux est de construire une courbe en utilisant les tables établies par G. BERrRAND [9] pour le maltose et le glucose. Un exemple montrera comment peut se calculer chaque point de cette courbe. Soient 10 mgr. de maltose anhydre: d’après les tables, ils précipitent directement 11 mgr. 2 de Cu (r2) : la poudre de Mucor les transforme en 10 mgr. de glucose donnant 21 mer. 4 de Cu (r,). L'hydrolyse de 10 mgr de maltose se traduit donc par un accroissement du pouvoir réducteur (r; —r2) égal à 19 mgr 2 de Cu. En continuant de même pour des poids connus de maltose compris dans les limites de sensibilité de la méthode de BERTRAND on peut dresser la table suivante donnant immédiatement pour certaines valeurs de la différence r; - r2, les quantités correspondantes de maltose

Fe maltose TT, maltose 10,2 mgr. —— 10 mpgr. 49,8 mgr. D9Èn.

ATOM — 45 » A4) —— V0 44,9» —— 50 » TA on , — 95 »

Les chiffres intermédiaires se trouvent facilement par interpolation ou plus simplement en utilisant un graphique coté établi une fois pour toutes au moyen de ces données.

On: peut ainsi Connaître, avec une approximation suffisante pour des recherches physiologiques, la teneur en maltose de liqueurs renfermant ce sucre en mélange avec des hexoses ou avec d’autres glucides plus condensés, à condition qu'ils soient respectés par la poudre de Mucor, ou en cas contraire, qu'ils aient été hydrolysés préalablement par des ferments appropriés.

Enfin on peut vérifier les résultats obtenus par voie chimique au moyen du polarimètre. Pour connaître le pourcentage en maltose d’une solution il suffit de diviser la différence observée au tube de 2 dm («, étant la déviation lue après action de la sucrase et

la déviation après hydrolyse par la maltase) par le coefficient 1,5048 qui est le changement d2 déviation se produisant dans l’hydrolyse d’une solution à 1 %, de maltose pur.

Quant au dosage polarimétrique du saccharose accompagnant le maltose, il ne présente aucun: difficulté : en divisant, comme dans le cas général, 4, — x, par 1,8498 — 0,058 { on obtient le pourcentage en sucre de canne.

Pour ce qui est des hexoses libres, on peut les apprécier en bloc, le maltose une fois connu, en retranchant de la réduction initiale r, la part qui revient au maltose.

c) Recherche des pentoses. — La plupart des traités classiques enseignent que les pentoses ne se montrent jamais à l’état libre chez les plantes mais qu'ils s’y trouvent seulement engagés dans jes molécules de polyoses complexes comme les gommes et les pentosanes. Néanmoins, en 1916, Davis et SawvEer [27] signalaient, dans les feuilles de Pomme de terre et de Betterave, la présence de pentoses libres dont la proportion ne descendrait guère au dessous de 1/20 et pourrait s'élever juqu'à 1/10 et même 1/4 du sucre total.

I y avait donc lieu de contrôler cette assertion : car si le réducteur présent dans les tissus des limhes et des pétioles n’est pas constitué uniquement de glucose et de fructose comme on le croyait jusqu'alors, mais comporte en outre de l’arabinose (4n — + 102,6) ou du xylose (œ» — <+18,8) en proportion aussi importante que l’affirment les auteurs anglais, il n’est pas possible de calculer au

moyen des données polarimétriques le rapport : "2% La yen des nnees ? ] rique: PI * fructose

valeur de ce quotient est une donnée de première importance dans les questions qui nous occupent, aussi avons-nous tenu à vérifier de très près les assertions des auteurs anglais.

Disons, sans plus attendre, que nous ne saurions les contresigner. Les pentoses, s'ils existent à l’état libre dans la feuille de Pomme de terre, ne s’y trouvent jamais qu’en doses infimes.

Davis et SAWYER dosent comme pentoses, dans les extraits alcooliques des feuilles, tout ce qui réduit la liqueur cupro-sodique après action des levures ordinaires de brasserie ou de boulangerie ; les résultats ainsi obtenus correspondraient, au cinquième près, à ceux que donne le procédé KROEBER-TOLLENS qui consiste,

comme chacun sait, à peser, à l’état de phloroglucide, le furfurol produit dans l'attaque des sucres par l'acide chlorhydrique.

Ces méthodes ne sont pas contestables dans leur principe ; reste à savoir si elles comportent le degré d’exactitude qu'on leur prête. Les levures communes ne touchent pas aux pentoses, c’est entendu ; il n'empêche qu'un résidu de fermentation est un milieu complexe qui peut renfermer d’autres substances réductrices que les pentoses. Quant au produit de condensation du furfurol et de la phloroglucine, il se présente sous forme d'une matière résinéuse, de couleur foncée, sans aucune propriété saillante, au point que bien des auteurs remplacent désormais la phloroglucine par la semi-oxamide ou l'acide barbiturique.

Rien ne saurait dispenser, dans ces sortes d'analyses, de caractériser les produits par leurs réactions spécifiques.

Il n’est pas facile de reconnaître directement, à côté d'une masse de sucre interverti, la présence de petites quantités de pentoses, la coloration bleue typique que donnent ces derniers avec l’orcine chlorhydrique (G. BERTRAND [9,]) se trouvant plus ou moins masquée par la coloration rouge due à l’action du réactif sur les hexoses. Cependant, même dans ces conditions, le procédé au 8-naphtol (P. THomas [88]) permet encore d’apercevoir les pentoses.

Le plus sûr, en pareil cas, est de doser le furfurol résultant de l'attaque du mélange par l'acide chlorhydrique. Sans doute, les pentoses ne sont pas seuls à fournir de l’aldéhyde furfurique, mais les hexoses en produisent si peu qu'aucune confusion n’est possible.

Pour évaluer de petites quantités de furfurol, rien ne vaut le procédé colorimétrique si parfaitement mis au point par FLEURY et PorrotT [31|.

Le matériel était fixé, séance tenante, par l'alcool bouillant, pour être ensuite, en même temps que l'extrait alcoolique, desséché vers 1009. On épuisait alors par l'alcool à 960 à l’ébullition, et, après concentration des liqueurs sous pression réduite, défécation complète à l'extrait de Saturne, élimination de l’excès de plomb par l'acide sulfurique, les sucres étaient dosés avant et après inversion.

La recherche des pentoses se faisait par la réaction au B-naphtol et par le procédé au furfurol.

Dans un cas comme dans l’autre, les opérations étaient effec-

tuées tout d’abord, sur les liqueurs telles quelles, puis en présence de quantités croissantes d’arabinose, et de xylose. Dans ces condiüons, il était aisé de déterminer par comparaison le rapport pondéral des pentoses libres aux hexoses ou plus exactement une limite supérieure de ce rapport.

La réaction au 6-naphtol est des plus faciles. Dans un tube à essai, on verse 3 ou 4 cm° d’une solution sulfurique du produit (0 g. 3 de B-naphtol dans 100 em° de SO*H? pur et concentré) et l’on dépose au-dessus avec précaution, pour éviter le mélange, 1 emÿ environ de la solution à étudier. La présence de pentoses libres, même à la faible concentration de 1, 2 décigrammes par litre, provoque, à la surface de séparation des deux liquides, la formation d’un anneau bleu ; les autres sucres ne donnent rien de tel.

La méthode au furfurol comporte tout d'abord l'attaque de la matière sucrée par l'acide chlorhydrique (D — 1,06), l’aldéhyde furfurique passe à distillation ; on arrête l'opération dès que le distillat ne colore plus l’acétate d’aniline. Il convient, pour éviter de trop grandes dilutions, d'employer une colonne à fort pouvoir séparateur. Le furfurol est dosé par le procédé colorimétrique à l’orcine, On introduit dans une éprouvette 4 em* de réactif acéto-orcinique (orcine Î gr., acide acétique cristallisable exempt de furfurol 1.600 cm) et l’on ajoute rapidement 5 cm° d'acide chlorhydrique (D — 1,19) renfermant des traces de perchlorure de fer. On porte ensuite au Bain-Marie bouiilant, exactement une minute, après quoi on laisse reposer durant une demi-heure ; c’est alors que la coloration présente le maximum d'intensité.