Alcool, huile, baume
Les bacilles vivants, lors de la fixation, sont teints en bleu foncé, les bacilles morts avant la fixation offrent une coloration métachromatique jaune safranine, plus rarement rouge safranine. Entre ces deux extrêmes, existe un groupe intermédiaire de microorganismes dont la fin sera prochaine ; ils sont colorés en jaune safranine et ponctués de grains bleus.
Unna croit que l’on peut transformer, par la médication antilépreuse, les bacilles bleus en bacilles jaunes. L’examen bactériologique pourrait donc fournir d’utiles indications sur l’efficacité de la thérapeutique.
Les arguments donnés par Unna pour démontrer la valeur de sa méthode sont les suivants : 1° Par ce mode de coloration il est possible de discerner un nombre de bacilles beaucoup plus considérable que par le procédé ordinaire et les bacilles colorés en jaune sont situés dans les points où il y a des masses muqueuses non colorées ; — 2° les bacilles jaunes sont particulièrement abondants à l’intérieur des globi ; — 3° la clinique montre que les lépromes anciens contiennent beaucoup plus de bacilles jaunes que les lépromes récents ;
— 4° dans les lépromes non traités, jamais la totalité des bacilles n’est jaune, tandis que dans ceux qui ont été traités, les bacilles jaunes prédominent ou même existent exclusivement ; de
plus, les amas bacillaires qui sont greffés sur l’endothélium des capillaires sont constamment bleus dans les cas non traités, même si dans le tissu de voisinage tous les bacilles sont colorés en jaune ; mais, après traitement, les bacilles de l’endothélium peuvent être jaunes.
Babes a objecté à Unna que les aspects variables offerts par le bacille sont dus aux modes de coloration, et qu’on peut observer aussi bien ces aspects avec d’autres procédés si l’on prolonge l’action du bain colorant.
T. et Y. Aoki pour établir la discrimination entre les bacilles vivants ou morts, font une double coloration par la méthode érythrosine-bleu de méthylène ; les bacilles morts se colorent par le bleu de méthylène, non pas en bleu, mais en bleu-violet foncé, l’opposition avec les bacilles vivants teintés en rouge vif serait très tranchée. Dans les cas énergiquement traités ou dans les vieux lépromes, les bacilles rouge vif sont en quantité beaucoup plus faible que les bacilles bleu violet foncé.
La méthode « érythrosine-bleu de méthylène », s’effectue de la façon suivante : 1° Des frottis en couche mince et desséchés à l’air sont colorés, pendant cinq minutes, dans une solution d’érythrosine à 80° (érythrosine 1,0 ; acide picrique 0,15 ; eau distillée 100). Soigneux lavage à l’eau ; — 2° faire séjourner, une minute, les frottis dans une solution de potasse caustique (potasse caustique : 5, alcool absolu 30, eau distillée 70). Lavage à l’eau ; — 3° coloration, une minute, dans la solution suivante : potasse caustique 1, solution alcoolique saturée de bleu de méthylène 15, eau distillée 100.
Aucun mode de coloration ne permet, à mon avis, d’affirmer qu’un bacille était vivant ou mort avant sa fixation. Un fait unique prouve la vitalité d’un microorganisme : c’est sa multiplication. Or, si la culture et l’inoculation de la lèpre n’ont pu jusqu’à présent être complètement réalisées, il est certain que le bacille spécifique sur milieu artificiel donne souvent des indices de prolifération et que son inoculation peut produire une greffe locale passagère.
J’ai la conviction que des essais de culture et d’inoculation dirigés en ce sens pourraient fournir des notions précises touchant la vitalité des bacilles contenues dans un foyer et, par conséquent, contribuera éclairer l’étiologie et la prophylaxie. Pour ne citer qu’un exemple, la peau de beaucoup de lépreux de forme tégumentaire, bien qu’elle n’offre aucune solution de continuité, est couverte de bacilles déversés à la surface par la mue épidermique et les sécrétions glandulaires. Ces bacilles sont-ils vivants ou morts ? On conçoit combien il importe d’être fixé à cet égard. La solution de ce problème permettrait d’évaluer les risques de contamination et de prendre en connaissance de cause des mesures efficaces et rationnelles. Si les bacilles éliminés par la peau dont l’épiderme est intact, sont vivants, il faut considérer ces porteurs de germe comme étant en état de lèpre ouverte.
COMMENT DISTINGUER LE BACILLE DE LA LÈPRE DU BACILLE DE LA TUBERCULOSE ?
Vainement on chercherait à différencier ces deux micro-organismes en se basant sur leurs caractères morphologiques (dimensions ou forme, état homogène ou granuleux, etc.), sur leur mode de coloration (l’un et l’autre de ces bacilles peuvent être acido-et alcoolorésistants, ou privés de ces propriétés), de leur constitution chimique (acides gras, lipoïdes, etc.). Un caractère objectif, il est vrai, peut permettre de les distinguer l’un de l’autre, c’est le groupement des bacilles de la lèpre rangés côte à côte et en bon ordre dans
une glée qui les agglutinent en masses plus ou moins considérables. Mais ce signe différentiel fait défaut quand les bacilles sont en petit nombre.
Kobayashi, pour établir le diagnostic bactériologique différentiel, se base non pas uniquement sur un mode de coloration, mais sur un ensemble de caractères : Abondance des bacilles ; — leur siège et leur intrication ; — leur forme ; — leur incurvation ; — la taille des granulations ; — leur siège. Quant aux dimensions des bacilles de la lèpre et de la tuberculose, elles diffèrent peu. Il a été déjà dit que le bacille de Hansen était plus long dans ses localisations cutanées et viscérales que partout ailleurs.
D’après les mensurations d’EASTwooD, les dimensions du bacille de la tuberculose mesurées dans 96 cas ont été : pour le plus court 0,5 y et pour le plus long 8 y, pour le plus grêle : en moyenne de 1,23 y à 4,12 y. D’après ces chiffres, le bacille de Koch serait un peu plus long que le bacille de Hansen, mais les écarts sont tels pour chacun de ces bacilles qu’on ne peut pas considérer la taille comme un moyen de différenciation. D’après le même auteur, le bacille de la lèpre est légèrement arqué et ses extrémités se terminent en pointe. Le bacille de la tuberculose au contraire serait rectiligne ou en forme de clavicule et ses deux extrémités affecteraient la forme de crosse. En réalité, c’est à la culture et à l’inoculation expérimentale qu’il faut demander d’établir une distinction certaine entre ces deux germes. Seul le bacille de Koch peut réaliser des cultures susceptibles d’être repiquées et des infections capables de se généraliser.
Diverses formules qui mettent en évidence certains détails de structure ou fournissent des renseignements sur la constitution chimique du bacille ont déjà été signalées (pp. 120-124, passim).
Pour établir le diagnostic, pour étudier la dissémination et la répartition du bacille dans l’organisme ou pour apprécier les résultats de la thérapeutique, on se sert habituellement du liquide de Ziehl, solution hydro-alcoolique de fuchsine basique additionnée d’acide pliénique qui remplit l’office de mordant. Si les bacilles proviennent d’un foyer récent, il suffît de laisser la préparation dix minutes dans le bassin colorant, puis, après lavage à l’eau, de décolorer rapidement par l’acide nitrique au tiers ou par l’acide sulfurique au quart.
On a dit que le microorganisme de la lèpre se colore plus facilement et plus rapidement que celui de la tuberculose et qu’il retient mieux les couleurs d’aniline ; celà est vrai, d’une façon générale, lorsque le revêtement du bacille est intact. Dix à vingt minutes suffisent ordinairement pour colorer un frottis ou une coupe, si l’on chauffe jusqu’à dégagement de faibles vapeurs ; mais si la préparation provient d’un foyer ancien dont les bacilles sont granuleux, il peut être nécesaire de la laisser dans le bain colorant, une à deux heures, à l’étuve à 55°. En pareil cas, la décoloration doit être effectuée avec ménagement. L’acide nitrique au tiers et l’acide sulfurique au quart sont des solutions trop concentrées. Quand on les emploie, on risque de décolorer les bacilles. Pour ma part, je ne fais usage, en pareil cas, que de solutions très étendues, au dixième ou au vingtième et je suis les progrès de la décoloration sous le microscope à un faible grossissement qui permet de distinguer les gros amas bacillaires. Si la solution acidifiée n’est pas assez diluée ou si elle reste trop longtemps en contact avec la préparation, une partie des bacilles se décolore et prend la teinte de contraste qui sert à nuancer le fond. Les bacilles apparaissent alors,
les uns en rouge par le Ziehl, les autres en bleu ; ils peuvent même être tous entièrement décolorés, ce qui peut conduire à méconnaître la lèpre.
Pour parer à cet inconvénient, Schaffer conseille de substituer l’éthylendiamine à 10 pour 100 à l'acide, pour la différenciation. Babes, qui emploie comme colorant une solution anilinée de safranine, remplace l’acide par l’iodure de potassium et par l’alcool.
Mais l’absence d’acido-résistance n’est pas dû nécessairement à un mode de décoloration défectueux. Tous les bactériologistes ont observé, sur la même lame, des bacilles morphologiquement identiques, les uns restant colorés après l’emploi des acides convenablement maniés, les autres prenant la coloration du fond. Peut-être le degré plus ou moins grand de l’acido-résistance dépend-il de la phase du développement auquel le microorganisme est parvenu ? G. Delamare, C. Gatti et A. Battilana (1929) ont de nouveau attiré l’attention sur cette particularité. Dans le suc extrait par ponction des ganglions lymphatiques de 60 lépreux, ils ont vu côte à côte des bacilles, les uns fortement colorés par le Ziehl, les autres faiblement teintés de la nuance de contraste. Or ces bacilles provenaient de ganglions non ulcérés, et l’hypothèse d’une infection secondaire semblait devoir être écartée. On sait que le bacille de Koch peut perdre pareillement son acidorésistance.
Lorsqu’on ne constate pas de bacilles dans les sécrétions examinées, il faut recourir à la centrifugation après homogénéisation comme on le fait pour la recherche du bacille de Koch. Pour fluidifier le mucus dans les produits d’expectoration ou dans le pus, on peut faire usage de la soude, de l’eau de javel ou de l’antiformine. Le point important, comme F. Bezançon et A. Philibert l’ont montré, est d’obtenir un liquide de densité plus faible que le bacille, ce qu’il est facile de réaliser par l’adjonction d’un grand volume d’eau et d’alcool à 50°. La technique qu’emploient ces auteurs pour homogénéiser le bacille de la tuberculose (technique applicable au bacille de la lèpre) est la suivante : Mettre dans une capsule de porcelaine 2 centimètres cubes de crachats ou de pus, 20 centimètres cubes d’eau, deux gouttes de lessive de soude ; — chauffer à feu doux pendant 10 minutes en agitant ; — - ajouter, après refroidissement, 5 centimètres cubes d’alcool à 50° ; — centrifuger. L’homogénéisation est le premier temps de la méthode de Jacobson qui consiste, après fluidification par l’antiformine, à ajouter au liquide un éther de pétrole, la ligroïne qui, après agitation et repos, entraîne avec elle les bacilles à la surface.
Si le liquide pathologique, mucus nasal ou pus est trop visqueux pour être bien étalé sur une lame, on le délayera dans un peu de sérum physiologique.
Toute action préalable d’une solution de chlorure de sodium, de l’alcool, de la formaline, nuit à la colorabilité des frottis. Le meilleur moyen de les fixer consiste à les dessécher à l’air et à les exposer trois fois à la flamme courte du bec Bunzen pendant une seconde environ. Quant à la fixation de pièces, on fera usage de l'alcool ; excellent aussi est l’emploi du sublimé et de ses combinaisons, comme le Zenker et la « sublamin » à 5 pour 100 (Klingmüller), le liquide de Muller. Wade a particulièrement insisté sur la nécessité d’inclure les pièces dans la paraffine. La recherche du siège et du nombre des bacilles serait, d’après lui, pratiquement impossible sur les tissus congelés ou inclus dans la celloïdine. L’action des solvants des graisses, tels que l’éther et le chloroforme doit être évitée le plus possible. Enfin, les préparations que l’on veut conserver seront incluses dans le baume. Les variantes que l'on a fait subir à la méthode de Ziehl sont innombrables. Chaque histologiste, pour ainsi dire, a sa formule personnelle. Ainsi Darier et Jadassohn, après fixation à l'alcool, mettent la préparation dans la fuchsine phéniquée chaude pendant 2 heures, puis ils décolorent avec précaution au moyen de l’acide nitrique dilué à 10 pour 100, enfin ils teintent le fond avec du bleu de méthylène de Lôffler. Klingmüller est d’avis que la solution d’acide sulfurique à 5 pour 100 donne des images plus nettes que l’alcool additionné de 3 pour 100 d’acide sulfurique. La décoloration séparée par l’acide sulfurique et par l’alcool est en somme meilleure que la décoloration par l’alcool acidifié.
En général, la coloration optima est celle qu’on obtient par la fuchsine phéniquée à la température du laboratoire, 18° environ. Quand les bacilles sont rares, une coloration prolongée peut en rendre un plus grand nombre visibles, mais, notamment dans les coupes, la découverte de bacilles disséminés est rendue en pareil cas difficile parce que la coloration rouge des tissus, du tissu conjonctif en particulier, ne peut être qu’en partie éliminée.
Pour l’étude des relations qui existent entre les bacilles et les cellules et pour l’étude histologique, on peut combiner la coloration de Ziehl-Neelsen avec le van Gieson.
Le bacille de la lèpre est GaAM-résistant ; mais il semble qu’en vieillissant il puisse perdre cette propriété. La technique recommandée par Much pour colorer les frottis est la suivante : séjour de 48 heures dans la solution de violet de gentiane dans l’eau d’aniline ; — ne pas laver ; mettre en contact avec la solution de Lugol pendant 1 minute et demie ; — décolorer avec l’alcool absolu contenant 10 pour 100 d’acétone jusqu’à ce qu’il ne se dégage plus de matière colorante ; — employer comme couleur de contraste, une solution de fuchsine très atténuée.
Quelques essais de coloration vitale ont été tentés par Chuma et Gujo. Se conformant aux indications de Murata, ils dissolvent 4 grammes de carmin en grains purifié de M erck dans 100 grammes de solution aqueuse froide saturée de bicarbonate de soude ; puis ils portent à l’ébullition. Après refroidissement, ils filtrent et, avant l’usage, étendent au cinquième ou au dixième au moyen d’une solution de chlorure de sodium, enfin ils stérilisent. Un centimètre cube de ce produit était injecté dans un nodule. Les mêmes auteurs eurent aussi recours à l’encre de Chine. Ils firent un mélange avec une solution de chlorure de sodium, filtrèrent plusieurs fois et, après stérilisation, firent des injections répétées dans des nodules. Un jour après la dernière injection les tubercules furent excisés, mis dans de la formaline à 10 pour 100, passés à l’alcool et inclus dans la paraffine.
La couleur diffuse très difficilement et sa répartition n’est pas uniforme malgré des injections réitérées. Les particules d’encre de Chine pénètrent plus aisément ; elles s’accumulent surtout dans le protoplasma des cellules épithélioïdes et des cellules lépreuses sous forme de granulation. Les vacuoles restent libres. Il faut remarquer que ces cellules sont celles qui contiennent de préférence des bacilles. Les cellules du tissu conjonctif sont infiltrées de fines granulations disséminées.
