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qu'une action presque nulle. Mais celte manière de voir ne peut plus être soutenue depuis que mon maitre, le professeur ViLe', a montré, avec M. J. Morressier, que celte action catalytique des globules rouges est due à un principe diastasique isolable et indépendant de la matière colorante. Cette découverte amène à penser que les différences cons. talées au point de vue de la méthémoglobinisalion ne tiennent sans doute ni à une combinaison chimique du pigment avec le stroma, ni seulement à la pénétrabilité élec: live de ce stroma? et à ses modifications physiques. Ces conceptions résultent de l'idée trop simpliste que l’on lend àse faire parfois du globule rouge, — sur la cytologie duquel nous sommes si mal renseignés 5. Il est probable, en effet, que l’hématie des mammifères n'est pas un simple disque sanguin, une concrétion hémoglobique ou une vésicule sans organisation. Elle offre des vestiges de constitution cellulaire et, malgré sa transformation profonde par le fait d'une spécialisation étroite, elle à la valeur d’une cellule“. Et comme telle elle doit posséder, suivant la métaphore de Duccaux, son cortège de serviteurs diastasiques — dont lun à été isolé par MM. J. Vizze et Motressier, — et qui doivent concourir à maintenir le ferment le plus important — le pigment respiratoire — dans la forme instable qui convient le mieux à sa fonction. C’est cette atmosphère de vie où se {rouve le pigment sanguin dans le globule rouge qui explique les diflérences de se comporter de l'hématie et de l'oxyhémoglobine vis-à-vis des agents méthémoglobinisants, et pourquoi la libération de l'oxyhémoglobine du complexe
13, Ville et J. Moitessier, Soc. Biol, 55, 1126 (25 juillet 1903).
2 Dittrich. Arch. f. exp. Path. à Pharmak, 29, 262 (1891),
8 Cf. Laguesse, Revue annuelle d'Anatomie, in Rev. gén. des Sciences, 30 déc, 1905, p. 1099,
* Prenant, Bouin et Maillard. Traité d'Histologie, 1, p. 563 (1904).
elobulaire estune condition propice à la méthémoglobinisation. — À propos de la bande que l’on voit dans le rouge avec les tubes longs, j'aurai à examiner la question de savoir si le laquage peut être à lui seul un agent méthémoglobini-
sant.
B. — PRÉPARATION DE LA MÉTHÉMOGLOBINE d CRISTALLISÉE 1° Par l'alcool et le froid. — La plupart des auteurs se
servent du ferricyanure comme agent méthémoglobinisant et de l'alcool et du froid pour amener la cristallisation suivant le procédé indiqué par Hürner et Orro (18821, Hürner (1884), Jæpernozm (188%). Voici comment opère R. v. Zeyner ‘. On part de l’oxyhémoglobine {de cheval, de chien ou de porc) purifiée par deux ou.trois cristallisations. On en fait une solution, aussi concentrée que possible. On Y ajoute peu à peu du ferricyanure de K en solution à 10°/, jusqu’à ce que la couleur primitive ait complètement viré au brun sombre. Finalement on verse un léger excès de ferricyanure pour être sûr qu'il ne reste pas un peu d’oxyhémoglobine non transformée. La solution est alors, suivant le procédé clas. sique pour l’oxyhémoglobine, refroidie à 0°, additionnée du quart de son volume d'alcool à 90e, également refroidi à 0°, et abandonnée dans la glaceou mieux dans un mélange réfrigérant. Après quelques jours, il se fait un dépôt abondant de pelits cristaux très fins, de couleur brun fauve, qui, mis en suspension dans le liquide remué, y produisent des ondes soyeuses et mordorées.
1 Engelmann's Archiv. f. Physiol., 1899, 461. -— C’est ce prosédé qu’emploient encore récemment Hüfner et Reinbold (même Archiv., 1904, suppl, 391). :
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Celte méthode ne réussit bien qu’en partant de solutions d'oxyhémoglobine très concentrées ! et en prolongeant suffisamment l’action du froid. Dans quelques cas où ces condilions étaient les mieux remplies, von Zeynek a pu obtenir des cristaux de méthémoglobine de cheval, sans addition d'alcool.
Les cristaux sont en général de fines aiguilles prismatiques. Dans un cas, et avec la PE obelohins de cheval, v. Zeyner à obtenu des tablettes hexagonales macroscopiques. J'ai pu l'hiver dernier, parmi les nombreuses préparalions que je fis avec le professeur Vicce, observer quelquefois ces cristaux. Ce sont des hexagones réguliers pouvant atleindre jusqu'à 1/2 centimètre de diamètre. Ils paraissent se former de préférence dans les solutions peu concentrées et qui ne subissent l'action du froid que progressivement. Le dépôt cristallin est dans ce cas peu abondant et l'on voit alors des hexagones collés çà et là aux parois du vase. Examinés au microscope, ils subissent rapidement les phénomènes d’érosion dessinés par Uurik *.
Par le sulfate ammonique. — L'alcool qui, dans le procédé précédent, favorise la cristallisation en tendant à diminuer la solubilité de la méthémoglobine, peut être remplacé par le sulfate ammonique qui joue le même rôle.
Le sulfate ammonique à saturation précipite les substances protéiques. À des concentrations voisines de la demi-saturation, il favorise leur oblention à l'état cristallisé, comme
1 Ilest souvent difficile d'obtenir de telles solutions à partir d'oxyhémoglobine cristallisée, 11 serait à essayer de préparer la méthémogl. cristal. par méthémogloobtenus par laquage mécanique d'hématies lavées indiqué par Schuumans-Stekhoven pour l'éxyhé-
binisation directe des extraits
eu suivant ensuite le procédé
mogl. (Of. Zeitschr. f. physiol. Chem., 83, p. 296) ? Pflüger's Arch. f. Physiol., 104, 64 (1904),
Se
l'a montré d'abord Hormeisrer (1889) pour l’ovalbumine et la sérumalbumine, Mocisen (189%) pour la phycoérythrine, F.-N. Scuuzz (1898) pour l’oxyhémoglobine, M. HENzE (1901) pour l'hémocyanine ".
C'est pourtant indépendammentde ces considérations que Dirrricu ? fut amené, empiriquement, à préparer de la méthémoglobine cristallisée par le sulfate ammonique. Get auteur n’ajoute aucun méthémoglobinisant; son procédé revient en somme à la préparation d'oxyhémoglobine dont la méthémoglobinisation spontanée est hâtée par la présence de sulfate ammonique : à une purée d'hématies laquées par l'éther et filtrée, il ajoute deux fois son volume d’une solulion saturée à froid de sulfate d'ammonium, filtre et abandonne au froid dans des capsules plates. La cristallisation commence ordinairement après2#heures.1{lfautpar plusieurs cristallisations purifier les cristaux d'un précipité amorphe qui s’y mêle souvent. Les cristaux sont d’abord constitués par de l'oxyhémoglobine, mais lPexposition à l'air et les recristallisations les méthémoglobinisent peu à peu complètement.
On arrive au même résullat par le procédé mieux réglementé indiqué par Scuauzz* pour l'oxyhémoglobine ; on abandonne au repos et au frais, dans une ampoule à décanlation du sang de cheval oxalaté (1,5 °/,, d’oxalate ammonique). On recueille la purée de globules tombée au fond du vase et on la laque avec le double de son volume d'eau. Cette solution, refroidie à 0°, est additionnée de son volume d'une solution, également refroidie à 0°, de sulfate ammonique saturée. La globuline, le fibrinogène et les stromas
‘ Pour les indications bibliograph. Cf, Goxxa>m, Chemie der Eivweisskürper, 2° édit. Braunschweig, 1904 p. 149,
? Arch, f. experim. Path. u. Pharmak. 29. 250 (1891). |
% Zeitschr. f. physiol. Chem. 24, 449 (1898). Cf. Armand Gautier el J. Albahary, 120 Exercices de chimie pratique, Paris, 1899, Masson, édit.. p. 181,
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sont ainsi précipités. Le fillratum abandonné à la température ordinaire donne de l’oxyhémoglobine cristallisée et pure. On la prive de ses eaux-mères, on la redissout dans l’eau et par addition d’une solution de sulfate ammonique refroidie, on provoque une deuxième cristallisation de l'hémoglobine. Nous avons souvent, le professeur ViLe et. moi, éprouvé celle méthode pour les besoins du cours. Elle est commode el réussit toujours. On obtient ainsi avec le sang de cheval de belles tablettes losangiques visibles à la loupe. La dessiccalion sur plaques poreuses hâte la méthémoglobinisation, tout en permettant de séparer mécaniquement une partie du sulfate ammonique dont les cristaux restent imprégnés et qui sort en efflorescences.
Au bout d'un certain temps les cristaux d’oxyhémoglobine ainsi préparés sont devenus des cristaux de méthémo. globine.
D'ailleurs les cristaux d'oxyhémoglobine préparés par la classique méthode d'Hoppe-SeyLer sont, eux aussi, au bout d'un temps suffisant complètement transformés en méthémoglobine et peuvent servir comme telle dans les recherches ".
Pour réaliser une méthémoglobinisalion totale et rapide, voici comment, avec M. le professeur VILLE, nous avons appliqué le procédé de Scauzz à l'obtention de la méthémoolobine cristallisée : A la solution d'hémalies on ajoute goutte à goutte en agilant une solution concentrée de ferricyanure de potassium jusqu'à méthémoglobinisation com plète.-On en est averti par la coloration de la mousse qui
1 Notamment Hüfner et Reinboll (EHagelm. Archiv, f. Physiol, 1904, supp . Bd. pr. 392) ont employé dans leurs recherches absorptiométriques avec le bioxyde d’Azote, comme méthémoglobine des « cristaux d'oxyhémoglobine conservés à sec depuis plusieurs mois el co nplèlement el spontanément méthé-
moglobinisés »,
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devient alors brune, et on s'en assure au spectroscope en utilisant la réaction que j'indiquerai dans la 3° partie de celle thèse ‘. C'est cette solution méthémoglobinisée qui est alors traitée suivant les indications de Scauzz. Les cristaux finalement obtenus peuvent être lavés à la trompe avec une solution demi-saturée de sulfate ammonique pour se débarrasser du ferrocyanure ?. Il est plus difficile de se débarrasser du sulfate ammonique. Le lavage à 0° avec de l’eau distillée, alcoolisée, le brossage des plaques cristallines des séchées sur terre poreuse n’en enlèvent jamais qu'une partie.
La méthémoglobine peut donc s'obtenir cristallisée :
1° par simple refroidissement si ses solutions sont assez concentrées (N. LEYNEK);
2° par l'alcool et le froid (Hürner et ses collaborateurs).
3° par le sulfate ammonique (Drrrricn, ViLce el DERRIEN).
4° Enfin les anciennes préparations d'oryhémoglobine peuvent servir comme mélhémoglohine cristallisée.
* LT, à
Un voit donc combien est graluile l’asserlion récente de MM. Pigrrre el Viza que «/a méthémoglobine ne peut être préparée à l'état eristallisé » (C.R.,440,p 1351, 15 mai 1905).
! Quand la mousse est devenue brune, on met 10 gouttes du mélange dans 106: d’eau distillée en un tube à essais, on agite avec une pincée de NaF en poudre et on place le tube à essais devant la fente du spectroscope, Si deux bandes d'absorption persistent dans le vert, il faut ajouter encore un peu de ferricyanure, On recommence l'essai spectroscopique et on ajoute du ferricyanure jusqu'à ce qu'après addition de NaF à ia prise, d'essais il n'y ait plus de bandes d'absorption dans le vert. On arrive ainsi à une méthémoglobinisation complète sans employer trop de ferricyanure.
2? Il faut priver les cristaux de méthémoglobine de tout ferri ou ferrocyanure, saus quoi il se ferait, sous l'influence de la lumière, de la cyanhémoglobine,
— El —
C. — INDICATIONS COMPLÉMENTAIRES SUR LES PROPRIÉTÉS DE LA MÉTHÉMOGLOBINE
