HISTORIQUE

Il n’entre pas dans le plan de notre thèse de faire un historique complet de la question. Celui-ci a été fait maintes fois, notamment dans les mémoires de Léon Bernard, Debré et Baron en 1914, et plus récemment dans le livre de Calmette sur l'infection bacillaire. Il serait donc superflu de copier un travail admirablement fait. Avant d'exposer nos recherches personnelles, nous ferons simplement un bref exposé des principales méthodes de recherche du bacille tuberculeux dans le sang, des critiques qu'on leur a faites et des causes d’erreur auxquelles elles sont sujettes.

Ces méthodes sont de trois ordres : l’hémoculture, la méthode d'examen direct du sang sur lames, et l’'inoculation au cobaye. Ces deux derniers procédés sont les seuls qui aient donné lieu à de nombreux et importants travaux.

L'hémoculture a été employée par Anderson qui ensemençait sur pommes de terre glycérinées le culot obtenu par centrifugation du sang citraté. Il n’obtint aucun résultat positif.

Ce résultat ne surprend pas, car on sait que sur les milieux de culture le bacille tuberculeux ne pousse que s’il est ensemencé largement.

Nous avons nons-même: ‘essayé : d’ensemencer du ; sang de malades tuberculeux, soit sur milieu à l'œuf de Dorset, soit sur le milieu de culture décrit récemment par Pétrof puis par Limousin pour l’isolement direct des bacilles à partir des erachats. Ce milieu est composé de bouillon de veau, d’œuf et de violet de gentiane. Lie tee

Pour faire nos ensemencements, nous avons utilisé le procédé décrit par Sabathe et Buguet pour la recherche directe des bacilles tuberculeux. Ces auteurs laissent coaguler 5 à 10 centimètres cubes dé sang recueilli par ponction veineuse dans un tube stérile. Is recherchent les bacilles par coloration au Ziehl te la partie la plus superficielle du caïllot quai, par suite de la rétraction du coaguüulum serait la plus riche en bacilles. : :

: Nous avons recueilli cette portion du caillot, et nous l'avons ensemencée sur des tubes de culture.

Six essais faits de cette façon avec du sang de tuberculeux pulmonaires chroniques non fébriles, n’ont donné aucun résultat positif. 1e

Méthodes d'examen direct du sang

Etant donné qu'on ne peut se contenter du simple examen d’une goutte de sang étalée sur lame, de nombreux auteurs ont imaginé des méthodes tendant à réunir les bacilles d’une certaine quantité de sang dans le plus petit volume possible de subs-

tance.

La première en date de ces méthodes et l'une des ne importantes est la méthode d’inoscopie de Jousset. Cette méthode consiste à laisser coaguler une certaine quantité de sang, et à. ‘soumettre le caillot à l’action d’un suc gastrique artificiel. On centrifuge alors le liquide résultant de la digestion du caillot, et on examine le culot étalé sur lames.

Avec celte méthode, Jousset avait obtenu une proportion de 31 0/0 de résultats positifs. Mais la méthode est sujette à certaines causes d’erreur qui en diminuent la valeur. | ;

En effet, les manipulations assez and l'addition d’un grand volume de substances étrangères, exposent le sang à la contamination par des bacilles acido-résistants différents du bacille de Koch, ce qui vient fausser les observations.

Nous ne ferons que citer quelques méthodes publiées après les travaux de Jousset, car elles n’ont donné lieu qu'à très peu de travaux et sont d’ailleurs passibles des reproches faits à l’inoscopie. Ce sont: les méthodes de Besançon, Philibert et Griffon, qui homogénéisent le caillot sanguin par de la lessive de soude (mais cette homogénéisation imparfaite ne donne qu'un liquide visqueux d'où la centrifugation sépare difficilement les bacilles), les méthodes de Nattan-Larrier et Bergeron, de Lœper et Louste, de Lesieur et Courmont.

Plus importante, en raison du nombre d’auteurs qui l'ont utilisée, et des discussions qu'elle a Sous vées, est la méthode à l’antiformine.

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Cette méthode utilisée par sont d'auteurs,

étrangers et surtoul allemands, avec diverses variantes, consiste essentiellement dans le laquage - du sang (5 à 10 cmc.) par 5 volumes de solution

aqueuse d'oxalate neutre de potasse à 0,2 0/0,

ou par 2 volumes de solution d'acide acétique à 1 o/o ou par 1 volume d’acide citrique à 1 0/0. On centrifuge, on décante et on dilue le culot dans 1 centimètre cube d'eau distillée. On ajoute alors quelques gouttes d’antiformine pure, ou 3 volumes d’antiformine à 15 0/0 en remuant jusqu’à clarifica. tion complète, puis on remplit le tube d'alcool à 60 et on centrifuge. Le culot est étalé sur lames et coloré par la méthode de Ziehl ou de Much.

En employant cette technique, Schnilter trouve des bacilles tuberculeux dans un tiers des cas, Lie- - bermeister, chez 30 0/0 des tuberculeux à la deuxième période, Lippmann, dans 33 0/0 des ie Mammen, douze fois sur quinze.

Suzuki et Takaki font en même lemps l° analyse du sang et la cuti-réaction, ils obtiennent 458 résultats positifs sur 516, et observent un parallélisme constant entre les deux phénomènes.

Kurashige, non seulement trouve des bacilles chez tous les malades examinés mais il répète les examens chez le même malade et conclut à la persistance de la bacillémie. De nombreux auteurs allemands : Rumpf, Kennerknetch, Hilgermann et Lossen, Duchinoff, Klemperer, Ranstrom, etc... apportent des

résultats de même sens.

..Déjà, en Amérique,. Rosenberger, puis :Petty :et Mendenhall, avec une méthode un peu différente avaient trouvé des bacilles dans le sang de presque tous les malades examinés.

L'annonce de résultats. si importants n’avait pas été sans soulever quelques. discussions, et plusieurs auteurs, avec les techniques décrites n'avaient pas

réussi à retrouver les bacilles dans le sang des tuber-

tuleux avec une aussi grande fréquence.

Mais la critique de ces travaux a surtout été faite en France, et en particulier dans un important tra-. vailde Léon Bernard, Debré et Baron.

Ces auteurs ont bien indiqué les défauts de F: . méthode à l’antiformine, et en général de toutes les méthodes d'examen direct du sang.

Le plus important est certainement le danger de contamination du savg en expérience par des bacilles acido-résistants non pathogènes. Toutes les méthodes comportent des lavages à l’eau distillée.Or l’eau distillée conservée dans les laboratoires contient fréquemment des acido-résistants. Il en est de même de. la pepsine, de la trypsine, des râclures de flacons de. laboratoire. Léon Bernard,Debré et Baron ont même trouvé des formations acido-résistantes dans une à solution d’antiformine.

Un autre reproche fait aux méthodes d'examen. direct du sang, c'est que des débris cellulaires, des stromas d'hématies en particulier, vraisemblablement riches en lipoïdes, peuvent être acido-résistants et laisser, même sur une préparation bien faite,

des figures ressemblant plus où moins au bacille de: Koch. Dans nos analysés, nous avons nous-méme! remarqué la difficulté de décolorer complètement les! lames, sur lesquelles il persiste fréquemment des débris cellulaires colorés par la fuchsine. Mais nous: croyons qu'un examen minutieux et surtout impartial peut toujours faire distinguer ces formations des bacilles tuberculeux. AUS

Ces causes d'erreur réduisent considérablement la: valeur des travaux allemands.

Léon Bernard, Debré et Baron om créé une technique personnelle où ils cherchent à se mettre à - l'abri des mêmes critiques.

Ils recueillent 10 centimètres cubes de sang par ponction veineuse dans un tube stérile contenant 20 centimètres cubes d’alcool à 30 degrés. Le laquage du sang commence aussitôt, et est complété par addition progressive de 30 centimètres cubes d'alcool à 40 degrés. Le liquide est centrifugé, à grande vitessse, puis décanté. Le culot de centrifufugation est remis en suspension dans un peu d’eau distillée, et dissous par addition de 1 ou Il gouttes de solution alcoolique de soude au dixième.On centrifuge de nouveau, et le culot restant est étalé sur. lame et coloré au Ziehl, avec décoloration par l'acide nitrique au tiers et l’alcool absolu. .

Avec cette méthode les auteurs n’ont trouvé de bacilles dans le sang que sept fois sur 65. Plusieurs auteurs français : Rist, Armand-Delille et Lévy-Bruhl, Nobécourt et Darré, de Verbizier,

recherchant la bacillémie, soit par le procédé de. Léon Bernard, soit par l’antiformine, ne trouvent de bacilles dans le sang que très rarement.

Cette technique constitue certainement un progrès sur toutes les méthodes précédentes, et les résultats obtenus ont par suite une valeur plus grande, Mais elle ne met pas complètement à l’abri des causes d'erreur précédemment signalées. En effet, il nous est arrivé, au cours de nos recherches personnelles,

de trouver des bacilles acido et même dans une cer-

aine mesure alcoolo-résistants dans une solution d'alcool à Go degrés qui avait séjourné un certain temps au laboratoire. j

En utilisant plusieurs fois cette technique au début de nos recherches, nous nous sommes rendus compte d’un autre inconvénient de la méthode : les auteurs, après le laquage du sang, voulant éviter la viscosité résultant d’une dissolution incomplète des globules blancs, n’ajoutent qu’une quantité infime de soude, de I à II gouttes de lessive de soude en solution alcoolique au dixième. Cette quantité est insuffisante pour homogénéiser complètement les leucocytes.

Il reste donc un culot relativement volumineux de. globules blancs mal dissous, au milieu desquels il est bien difficile de chercher les bacilles. 1l en résulte un

défaut de sensibilité de la méthode.

En outre, les auteurs reconnaissent eux-mêmes à leur technique un défaut important : « Mais toutes les méthodes d'examen direct, disent-ils, même la nôtre, ont le graveinconvénient de ne faire porter la,

Le

mie

recherche que sur une quantité relativement petite

de sang. C'est là un défaut capital qui restreint la portée de ces méthodes, et interdit d'accorder à leurs

résultats une valeur absolue. »

D'après eux, et c’est actuellement l'opinion detous les auteurs français, le seul critérium certain de la présence du bacille de Koch dans le sang, est l’inocu-

lation au cobaye. Avant de passer à l’étude de ce

dernier procédé, il nous reste à étudier une méthode

récente de recherche du bacille tuberculeux dans le

sang, publiée en 1920 par Sabathe et Buguet, méthode

très intéressante, car elle comporte beaucoup moins

de causes d'erreur que les précédentes.

D'après les auteurs, au moment de la coagulation du sang, la contraction du caillot chasserait vers la

surface extérieure les corps bacillairescontenus dans

la masse du coagulum. Ce serait donc tout à la sur-

face du caillot, dans la zone le séparant du sérum qu'il faudrait les chercher. La manipulation consiste : à recueillir 5 centimètres cubes de sang dans le tube stérile, à laisser le sang se coaguler et le caillot se rétracter. Après avoir enlevé le sérum à la pipette, ‘on prélève une parcelle de la partie superficielle supérieure du caillot, qu'on étalesur lames et que on colore au Ziehl.

En suivant cette technique, les auteurs ont trouvé des bacilles dans le sang de tous les tuberculeux examinés (130 cas). Ces résultats n'ont pas encore été confirmés à l'heure actuelle, mais la méthode est intéressante, car, ne comportant l’addilion d'aucune

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substance étrangère, elle supprime la cause d'erreur la plus importante, la contamination par les ReciiEs,

acido- résistants.

Inoculation

ob reste, don le ere le FR sûr pour déceler la bacillémie,. à condition. de. s’entourer de certaines. précautions, qui ont été bien. précisées. par Léon Bernard, Debré etBaron. | Cesauteursécartentavecraisonlesfaitannoncés par. certains auteurs allemands,quiconcluaient à desino-. culations positives du fait qu'ils retrouvaient danse sang des cobayes inoculés les mêmes bacilles acidorésistants, qu'ils avaient trouvé par examen direct dans le sang des malades. Ils contestent également l'opinion de Jousset quiadmet comme suffisante l'ap+

‘ parition d’une adénopathie discrète chez le cohaye,

même en l'absence de toute généralisation tuherculeuse. ;

Nous pensons, disent-ils, qu'on ne peut affirmer qu'une inoculation est positive, que lorsque l’animal présente un chancre, des ganglions et une tuberculase généralisée. À

Ces précautions sont peut-être un peu exagérées,. et nous croyons pour notre part que l'apparition … d'une lésion caséeuse chez le cobaye, avec hypertrophie, ganglionnaire, est suffisante pour admettre la tuberculisation, surtout si l’on ajoute le contrôle de- | l'examen microscopique des lésions trouvées.

Quoiqu'il en soit, la méthode est passible d’un.

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inconvénient beancoup plus grave : 0 eat Le défaut de sensibilité. Ex

En effet, Je sang non chauffé inoculé en nature est , toxique pour le cobaye à la dose de 8 à 10 centi-. mètres cubes, et l’on ne peut dépasser cette dose sans risquer de faire périr l'animal en expérience. Or, Calmette a démontré, qu'il faut un minimum

d'au moins 10 bacilles virulents injectés par voie

intra- -veineuse pour tuberculiser un cobaye. Une bacillémie discrète échappera donc au contrôle de l'inoculation.… | | Calmette a en outre fait à la méthode d’inoculation le reproche d'introduire chez le cobaye, en même temps que Jes bacilles, une certaine quantité de sérum capable de renfermer des anticorps qui pourraient empêcher le développement de la tuberculose. Nous croyons que ce dernier reproche n’est pas fondé, car Calmette lui-même, avec Boquet et Nègre, a démontré récemment que des sérums riches en anticorps tuberculeux, non seulement sont incapables d'accomplir la lyse du bacille, mais encore ne peuvent gêner en aucune façon le développement de la tuberculose expérimentale du cobaye.

L’inoculation au cobaye avait été employée déjà

par divers auteurs allemands cherchant à contrôler

F4 les résultats obtenus par. l'examen direct, mais elle

a surtout été utilisée par les auteurs ut,

Léon Bernard, Debré et Baron recueillent 10 à 15 centimètres cubes de sang dans des tubes parafinés pour empêcher la coagulation. Ils centrifugent

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aussitôt, et inoculent le plasma sous la peau d’un cobaye, et les globules sous la peau d’un second animal. En opérant de cette façon, ils n ’ont obtenu

que quatre résultats positifs sur 41 cas examinés.

Rist, Armand-Delille et Levy- -Bruhl, en inoculant à leurs animaux 6 à n centimètres cubes de sang complet, n’ont tre qu'un seul résultat positif sur 50 cas.

De Verbizier, ne trouve jamais de bacilles dans le sang de 15 malades, soit par examen direct, soit par inoculation de 5 centimètres cubes de sang.

Nobécourt et Darré, ont recherché la bacillémie : chez les enfants, en injectant au cobaye de 3 à 7 centimètres cubes de sang prélevé par ponction

veineuse ou au moyen de sangsues. Ils n’ont obtenu de résultats positifs que AAQUE fois sur 4o malades examinés.

Récemment, Turquety a étudié également la bacillémie des nourrissons en leur prélevant 10 centimètres cubes de sang par ponction du sinus longitudinal supérieur, et en l’injectant au cobaye trois fois seulement sur quatorze le résultat a été positif.

Par contre, en 1921, un auteur anglais, Distaso, en inoculant dans le péritoine des cobayes ro centimètres cubes de sang, prélevé chez des malades atteints de lésions pulmonaires chroniques sans fièvre et avec bon étut général, a obtenu 9 résultats positifs (tuberculose généralisée du cobaye), 2 résultats probables (hypertrophie ganglionnaire et splénique)

ai un seul résultat négatif sur 12 cas examinés.

En opérant au contraire avec le sang de malades atteints de lésions pulmonaires avancées, avec fièvre <levée (39-40) et mauvais état général, le résultat a été négatif dans tous les cas (40 malades).

. Nous soulignerons plus loin, en exposant nos résultats personnels, l'importance de ce dernier résultat. | |

Nous ferons cependant remarquer dès maintenant, que tous les auteurs qui ont obtenu des résultats négalifs, n’ont étudié que lesang de malades atteints de tuberculose aiguës, ou de tuberculoses évolutives avec fièvre élevée.

. Par exemple, Léon Bernard cite parmiles malades qu'il a étudiés : 3 granulies, à méningites, 1 pneumonie caséeuse, 5 broncho- pneumonies, 3 pleurésies séro fibrineuses aiguës, 3 hémoptysies, 10 tuberculoses chroniques en poussée évolutive, 2 tuberculoses avec albuminurie, 8 tuberculoses à localisations multiples, 1 adénie, 1 endo-péricardite tuberculeuse aiguë et 7 malades divers suspects de tuberculose.

Très rares sont les examens pratiqués au cours de tuberculoses chroniques. de Devant cet ensemble de résultats contradictoires, il reste bien difficile de se faireune opinion. Cependant,

il s'en dégage une conclusion très nette: c’est que si le bacille tuberculeux est présent dans le sang, c’est toujours en petite quantité, et qu il ne s’agit pas à : proprement parler d’une septicémie, d’une infection sanguine au cours de laquelle les bacilles végéteraient dans le sang et s’y développeraient.

Par contre, le défaut de sensibilité des Méthodes : employées, soit inoculation, soit examen direct, pe permet pas d’accorder de valeur absolue aux résnltats observés et de nierla réalité d’une bacillémie discrèten’ayant rien à voir avec la septicémie tubercu- : leuse des auteurs étrangers.

Toute méthode nouvelle doit donc tendre à examiner une plus grande quantité de sang, ense mettant à l'abri de causes d’erreur bien connues et qu'il est certainement possible d'éviter. C’est le but que nous avons recherché dans le travail que nous exposerons plus loin. voi | |

La bacillémie expérimentale

Avant de ne cet historique rapide, il nous .

reste à citer les recherches faites sur la bacillémie du cobaye. En opérant par transfusion du sang, Breton, Massol et Duhot ont pu préciser la fréquence, la durée et l'intensité de la bacillémie à la suite des divers modes d’inoculation. Dans une pre- . mière expérience, deux séries de dix cobayes de même poids reçoivent une même dose de 1 milligramme de bacilles tuberculeux, les uns dans la veine jugulaire, les autres sous la peau. À des périodes variables allant de une heure à soixante jours, leur sang est inoculé par transfusion de la carotide dans la jugulaire, à un même nombre de cobayes sains.

Chaque cobaye neuf reçoit environ 10: centimètres cubes de sang. de l’animal tuberculeux.

Tous les Cobayes transfusés, sans exception, sont morts d'infection tuberculeuse généralisée dans une, période de trente à cent jours. s

‘Dans d'autres expériences, les mêmes auteurs ont vu qu'après inoculation sous-cutanée d’un dixième de milligramme seulement de culture virulente, le ‘sang des cobayes se montre toujours” infectant pour les cobayes neufs, lorsque la transfusion est effectuée du premièér au quarante-septième jour après l'infection initiale.

Si l'infection des transfuseurs est réalisée avec des doses minimes, de un centième à un cent millième de milligramme, la bacillémie devient moins régulière,

et une partie SeAIement de cobayes transfusés prend la tuberculose. :

Dans toutes ces expériences, si l’on tient compte de l'intensité des lésions chez les cobayes transfusés, ‘on peut voir que l'infection sanguine est à son maximum vers le dixième jour et tend à décroftre par la suite,

Léon Bernard, Debré, et Baron, A trôlér la fidélité de leur méthode d'examen direct, ont également étudié la bacillémie du cobaye. Leur conclusion est que labacillémie est constante chez les cobayes infectés par voie intraveineuse avec r milligramme de bacilles tuberculeux.

Chez les cobayes inoculés par voie sous-cutanée avec la même dose de culture virulente, ils ne retrouvent les bacilles que dans un tiers des cas. Ces résultats obtenus par la méthode d’examen direct, ont

naturellement une valeur moindre que ceux de Breton, Massol et Duhot, car ilest bien difficile de trouvér une critique à formuler contre les expériences si précises de ces derniers. |

On peut donc conclure à la fréquence de la baeillémie au cours de la tuberculose expérimentale du cobaye. : :