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Cette échelle ne se conserve que 30 minutes, d’où nécessité de la renouveler à chaque expérience.
En utilisant la méthode de Marshall, celle-ci a présenté deux causes principales d'erreurs :
1° Il se produit souvent, après diazotation et copulation avec le réactif à la diméthyl-o-naphtylamine, une coloration qu'il est difficile de comparer aux étalons traités simultanément par suite de teintes parasites, dues au réactif luimême ;
2° La rapidité de développement de la teinte varie dans de larges limites, la coloration n’est pas stable, d'où impossibilité de la comparer à une gamme d’étalons fixes.
En ce qui concerne le second point, Marshall et Lichtfield ont, en juillet 1938, modifié leur technique.
Deux points ont été précisés
1° Nécessité de fixer l'acidité du milieu à un pH final compris entre 1,7 et 1,8.
2° Arrêter l’action de l'acide nitreux dans la diazotation après un délai de 3 minutes.
La couleur obtenue apparaît alors rapidement et demeure stable, On arriva au résultat en détruisant l’excès d'acide nitreux par:une solution de sullamate d'ammoniaque et en utilisant du phosphate diacide de sodium comme agent tampon. | l
Le tout introduit dans la réaction après diazotation et avant la copulation.
La question des teintes parasites fut aussi envisagée. Pour les éviter, E. À. Mac-Lachlan et ses collaborateurs se sont servis de l’électrophotocolorimètre de Kenneth-Evelyn. Par des études spectrographiques, ils ont montré que la teinte finale de la réaction présentait un maximum d'absorption vers 5.200 À: les teintes parasites vers 4.000 et 6.000 À.
Ils ont mesuré ensuite les absorptions. produites par les réactions colorées en utilisant un flux de lumière sensiblement monochrome isolé au moyen d’un filtre et centré vers
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5.200 À en une étroite bande spectrale allant de 5.000 à 5.400 À.
Cependant Mac-Lachlan n'utilisait pas la deuxième technique de Marshall et n’a pu s’affranchir de la seconde cause d'erreur.
C’est en évitant cette deuxième cause que M. le Docteur Servantie et Demange ont réalisé le système de dosage que nous allons exposer ici.
Principe de l’appareil de Kenneth-Evelyn.
Cet appareil est un colorimètre photo-électrique à une seule cellule. Le point essentiel est la stabilité de l'éclairage,
qui permet l'élargissement du champ d'application d’un tel
colorimètre. Par l’utilisation de filtres sélectifs, on peut résoudre les problèmes nécessitant auparavant l'usage d’un spectrophotomètre, ou même obtenir des résultats que ce dernier dispositif lui-même ne peut fournir.
La réalisation qui en a été faite par M. Servantie et Demange sera décrite ultérieurement dans un f{ravail inau-
Etablissement d’une courbe de concentrations.
gural.
Après avoir vérifié les assertions de Mac-Lachlan à l'aide du grand spectrographe : Zeiss, M. Servantie et Demange, assurés de la stabilité de la coloration, ont pu étalonner l’appareil utilisé à l’aide de témoins et établir une courbe,
Le principe mis en jeu est le suivant :
On mesure, à l’aide du photomètre, les densités optique L (log. Lo/i) des solutions colorées interposées sur le faisceau lumineux d'intensité lumineuse 10; I étant l'intensité transmise, Cela pour une épaisseur constante.
On utilise la formule C = L/K; C étant la concentration en substance active (sulfamide) de chaque tube; K un coeffi-
cient valable pour le filtre utilisé et constant pour des quan-
tités de sulfamide allant de 4 à 20.
Bors.
Ceci montre que la loi de Beer-Lambert (proportionnalité des densités optiques aux concentrations) est satisfaite.
Connaissant K et mesurant L, on peut calculer C.
On porte L en abcisse, et C en ordonnée.
On a une courbe, constituée en fait par une droite, variation de C en fonction de L.
Mesurant L, il est facile de se reporter à la table pour avoir aussitôt la concentration C en substance active.
Cette méthode, particulièrement rapide, sitôt étalonné l’appareil, permet des dosages en série très nombreux et une précision de l’ordre de 1/10 de microgramme.
Il faut cependant, K étant déterminé, utiliser toujours une même épaisseur et un même réactif. Cela a conduit préalablement à étalonner toute une série de tubes, donnant tous une même déviation de l’appareil, et qui nous ont ensuite servi pour nos dosages,
Nous allons maintenant donner au complet le processus technique utilisé dans nos diverses expériences de dosage, qui ont porté sur le sang, les urines et également le lait.
Technique générale des dosages.
Les réactifs utilisés sont :
1° Acide trichloracétique à 20 %.
2° Eau saponinée à 0 g. 05 %:
3° Solution de nitrite de soude chimiquement pur à 0,10 %,
préparée chaque jour.
4° Solution-tampon de sulfamate d’ammoniaque obtenue comme il suit : mettre dans un ballon de 100 cm3 10 cm? d’eau, ajouter 0 g. 50 d'acide sulfamique, SO4H.NH2, puis, goutte à goutte, de l’ammoniaque en présence de bromothymol sur du papier-filtre avec une pipette très fine jusqu'à neutralisation (procédé à la touche), environ Ô cm3 & de solution d’ammoniaque pure. Ajouter 13 g. 80 de phosphate acide de sodium et eau distillée en quantité suffisante pour compléter à 100 cm.
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5° Réactif de Marshall : 1 cm3 de diméthyl-o-naphtylamine dans de l’alcool à 95°, quantité suffisante pour 250 cm, à conserver à l'abri de la chaleur et de la lumière.
A. — Dosage dans le sang.
Pour recueillir le sang, nous avons utilisé des tubes à centriluger, que nous avions gradués à 4 cm3 pour simplifier le prélèvement, et dans lesquels nous avions mis au préalable O0 cm 04 d’une solution d’oxalate de potasse à 20 %.
On prélève 2 cm de sang oxalaté, après avoir bien mélangé au moment de la prise, et on verse lentement dans un tube contenant 6 cm3 d'eau saponinée; on mélange avec un agitateur et on ajoute 2 cm3 d’acide trichloracétique à 20 %.
Après un repos de 10 à 15 minutes on filtre; on peut aussi centrifuger.
On prélève 3 cm3 du filtrat.
2 cm seront utilisés pour le dosage direct, 1 cm? pour le dosage total après passage au bain-marie.
