IT RECHERCHE DU SANG PAR LES METHODES CHIMIQUES

Tous les procédés chimiques consistent à mettre en évidence le pouvoir oxydasique du pigment sanguin. Les réactifs utilisés sont les réactifs généraux des oxydases et peroxydases, el sont par suite dépourvus de spécifi- Cité:

Le type de ces réactifs est la teinture de gaïac, utilisée dès 1864 par Van Deen. Depuis, de nombreux autres

corps ont été proposés: teinture d'aloïnef par Schær, Rossel, solution de Gaïacol, par Bourquelot et Dupouy, benzidine, par D. R. Adler, solution alcaline de phénolphtaline, par Kastle-Meyer, et de fluorescine, par Fleig

Le principe est de transformer le réactif employé en un produit d’oxydation dont la présence est indiquée par une coloration particulière, propre à chaque réactif : bleue avec le gaïac, violette avec le pyramidon, rouge avec la phénolphtaline, ete.

Cette oxydation, réalisée à l’aide d’un peroxyde (autrefois essence de térébenthine ozonisée, aujourd’hui eau oxygénée) nécessite l’action catalytique d’un enzyme appelé pour cette raison peroxydase, dont l'hémoglobine fut le premier représentant (Schôünbein).

On connaît aujourd’hui un grand nombre de peroxydases, répandues dans tous les organismes, tant anifnaux que végétaux.

Leur action catalytique est variable, et peut même être dosée. On peut l’exprimer en U. I. a (unités d’iode titrées en présence d’acide ascorbique) suivant la méthode de Jayle.

C'est par sa propriété peroxydasique que l’hémoglobine va servir d’élément de caractérisation, en catalysant l’oxydation du réactif oxydable par l’eau oxygénée.

.” Comme substance oxydable on prendra : un phénol, une amine, ou un leuco-dérivé d’une substance colorante : fluorescine, phénolphtaline, leuco-vert de malachite.

Pour fixer les idées, nous allons prendre pour exem- -ple le réactif à la phénolphtaline de Kastle-Meyer. Cest, nous pensons, le plus généralement employé en clinique, à cause de la simplicité de son emploi et de la rapidité de ses résultats.

On le prépare en réduisant la phénolphtaléine en milieu basique et à chaud par la poudre de zinc,

D ue

Il se forme une phénolphtaline et l’on peut schématiser la réaction comme suit :

cH‘ou (Lou on UeZ re C cH'OH RE 0, dense 47 V4 (7 Dore LH enu (ÿ gC A phénolphtaléine phénolphtaline (p-2-dioxydiphényl- acide p-2-dioxytriphtalide) phénylméthane

o-carbonique

Mais tandis que la phénolphtaléine donne en présence de potasse ou de soude un sel intensément coloré en rouge, la phénophtaline est incolore dans les mêmes conditions.

Si nous mettons une solution basique de phénolphtaline en présence d’eau oxygénée, aucune coloration n’apparaît spontanément, mais il suffit d’introduire une trace d’hémoglobine, pour voir se développer immédiatement une belle coloration rouge due au retour de la phénolphtaline à l’état de phénolphtaléine basique.

Le mécanisme de cette réaction a donné lieu à de multiples travaux. Il est vraisemblable que selon le schéma de Bach, il se forme un peroxyde instable dont le dédoublement libère l’oxygène « actif >» qui provoque loxydation du réactif. :

MM. Michel Polonowski, Jayle et Mile Glotz, ont mis en évidence un dérivé d’oxydation supérieur de l’hémoglobine, qui, très instable, permet d'expliquer le pouvoir oxydasique du pigment sanguin. Celui-ci est lié à un changement de valence du Fer et peut se traduire par la relation schématique :

O0 ue à :

Ho, Ge RE nie RTE IE + Ko I e

= Th, =

La recherche du sang dans l'urine par le réactif de Kastle-Meyer a fait l’objet de nombreux travaux.

La formule donnée par Kastle et Schedd (1905) est la suivante :

Phtaléine du Phénol ......, Durs Potasse caustique ......... 20 gr.

PCOARE eZ Ci: 10 gr PCSI ir 1. 100 gr.

Après ébullition, qui doit être maintenue jusqu’à teinte jaune, le réactif sera conservé en flacons bien bouchés et en présence de grenaille de zinc. Pour l'usage, il faut le puiser avec une pipette, et non le verser directement, ce qui occasionnerait sur le goulot la formation de bavures qui se coloreraient par oxydation à Pair.

Justin-Mueller remplace les 10 gr. de poudre de zinc par 3 gr. d’hydrosulfite de soude.

Il nous a paru avantageux de remplacer à la fois la

potasse et le zinc-par l’amalgame de sodium. A condition

d'opérer la réduction à température modérée, on évite la formation de phénolphtalol (alcool diphénol provenant de la réduction de la phénolphtaline).

Le réactif ainsi préparé est absolument incolore, de conservation facile, et d’une sensibilité aussi grande que les précédents : la présence du mercure n’altère en rien sa valeur.

Mis en ampoule de 1 cc. il permet d'effectuer la recherche de l’hématurie microscopique au lif du malade. On peut ainsi d’une façon simple et rapide, mettre en évidence la légère hématurie que provoque généralement chez un lithiasique, la palpation prolongée du rein.

La technique est la suivante :

Dans un tube à essai on met successivement :

5 cc. d’urine.

5 cc, d’alcool acétique (à 2 %).

1 cc. (1 ampoule) de réactif.

V gouttes d’eau oxygénée à 10 vol.

SnfO es

Après agitation, on voit se développer une belle coloration rouge dont l’intensité est sensiblement proportionnelle à l’importance de l’hématurie.

Bien que la sensibilité du réactif de Meyer ait été étudiée par divers auteurs, nous avons essayé de déterminer expérimentalement le taux minimum de sang qu’on pouvait ainsi déceler dans l’eau et dans l'urine.

En partant d’une solution étalon renfermant 1 cm3 de sang dans 1000 cm3 d’eau, et en faisant des dilutions successives, au 1/2, au 1/5, au 1/10, au 1/50, au 1/100, la réaction n'est franchement positive que jusqu’au 1/20.000. Au delà de cette limite, la coloration rouge n'apparait qu’au bout de plusieurs secondes et son intensité va en décroissant jusqu’au 1/160.000 qui nous paraît être le terme de la sensibilité de la réaction.

En solution dans l'urine, les résultats sont plus inconstants, mais donnent toujours des chiffres plus faibles.

Il faut d’ailleurs être très prudent et ne conclure que pour une coloration rouge très nette (Labat).

| Dans ces conditions, et même en présence d’alcool acétique, qui, selon Sardou, neutraliserait les substances empêchantes de l’urine, on n'obtient de coloration immédiate que jusqu’au 1/10.000, et si l’on peut encore observer une teinte rose, d’ailleurs assez tardive, pour des dilutions du millionième, il nous paraît difficile d’en tirer une conclusion. Nous pensons que dans la majorité des cas, la sensibilité « pratique » de la méthode ne dépasse pas le 1/50.000. Cela représente une hématurie déjà bien minime, dont le clinicien peut largement se contenter.

Nous n'avons pas la prétention d'exposer ici toutes les méthodes chimiques qui ont été proposées, et qui reposent sur le même principe. Nous nous bornerons à signaler les plus courantes et les mieux appropriées à la recherche de l’hématurie,

lee

Le réactif de Fleig est une solution basique de fluorescine qui, employé dans les mêmes conditions que le réactif de Kastle-Meyer, donne en présence de traces de sang, une très belle fluorescence verte, (Celle-ci est plus facile à observer que la recoloration de la phénolphtaline, surtout si l’on à soin de considérer l’aspect du liquide au point d'arrivée des gouttes d’eau oxygénée : on aperçoit de belles stries fluorescentes, qui sont toujours très netles, même si l’urine est fortement colorée.

Cette réaction permettrait, d’après Fleig, de déceler des proportions de sang inférieures au 1/1.000.000.

Nous pouvons mentionner encore la réaction de Weber à la teinture de gaïac, ou de Boas au chloralalcool-gaïac, dans lesquelles on voit apparaître une belle coloration bleue, par action de l’eau oxygénée en présence de pigment sanguin.

Un réactif à la benzidine a été proposé par Adler. Denigès indique une technique à l’acétate de benzidine, et Ingham propose une méthode simplifiée avec un réactif comparable. Dans tous les cas on fait apparaître en présence d’eau oxygénée et de traces de sang, une coloration bleue verdâtre.

Nosaka décrit une micro-méthode basée sur la même réaction : une goutte d'urine est déposée sur un papier pour la touche (Schleicher et Schull). On ajoute successivement :

1 goutte d’eau oxygénée à 3 %,

3 gouttes de solution de benzidine à 0,05 %,

: dans l’acide acétique à 10 %.

Il se forme en moins d’une minute une lache bleue qui persiste pendant 1 heure environ. On accélère la réaction, et on la rend plus sensible, en ajoutant 1 goutte de soude 2 N. sur le papier pour la touche.

On emploie souvent, surtout en médecine légale, la

PT ASE

réaction au leuco-dérivé du vert malachite indiquée par O. et A. Adler en 1904. - ;

Le réactif, de très bonne conservation, a la composiion suivante :

Vert leuco-malachite ...... 1 gr.-4

Acideracétique/Crist. 2e 6e 100 cm3

Eat dis tiléeSe AAEe 150 cm3

Pour l’usage, on ajoute à 8 cm3 du réactif 2 cm3 d’eau oxygénée à 1 %.

En versant 1 goutte de ce réactif sur le culot de centrifugation d’une urine hématurique, on voit se développer en quelques secondes une coloration bleue verdâtre. La réaction se pratique avantageusement sur une feuille de buvard blanc.

Schmidt et Eitel ont proposé un réactif au chlorhydrate de diamino-2-7- fluorène.

Quel que soit le réactif utilisé, il ne faut pas oublier que les méthodes chimiques sont basées sur la recherche d’un pouvoir peroxydasique, et que l’hémoglobine n’est pas la seule peroxydase pouvant exister dans lurine. Mais un grand nombre de peroxydases étrangères sont thermolabiles, alors que l’action catalytique du pigment sanguin résiste bien à l’ébullition. On pourra donc, par l’ébullition préalable de l'urine, diminuer cette cause d'erreur. |

En outre, malgré l'addition d'alcool acétique, certaines substances gênantes peuvent persister dans l'urine, et diminuer notablement la sensibilité de la réaction.

Enfin les réactifs mis en œuvre sont parfois spontanément oxydables, et il faut toujours faire précéder la recherche d’un essai à blanc.

Fe AIde

Sans détrôner les méthodes microscopiques ou spectroscopiques, qui permettent seules de conclure de façon certaine à l'existence de sang ou d’hémoglobine dans l’urine, les méthodes chimiques conservent néanmoins une réelle valeur.

Ne nécessitant qu'un matériel très réduit, n'exigeant que des manipulations très simples, elles offrent en plus l'avantage d'une grande rapidité.

En s’entourant des précautions que nous avons indiquées et en n’exigeant pas d'elles toute la sensibilité à laquelle elles peuvent prétendre, elles constituent la méthode de choix du clinicien, et contribuent très souvent au dépistage de la lithiase rénale.