CHAPITRE VI

‘Nous avons pu constater plusieurs fois, au cours de l’exposé qui précède, combien hasardeuse est l’application prématurée d’une théorie biologique, avant que cette dernière soit indiscutablement démontrée. Appliquer aux tumeurs humaines, avec l’intention de les faire régresser, un toxique dont le mécanisme d’action sur la cellule n’a pas été complètement élucidé nous paraît une pratique dangereuse et d’ailleurs aléatoire. Sans doute, les divers travaux que nous avons précédemment analysés apportaient une série de conclusions de plus en plus probantes, mais nous ne voulions pas aller jusqu’à les étendre à la thérapeutique humaine, sans nous être assuré au préalable, par une expérimentation personnelle, que ces conclusions étaient fondées.

Nos recherches, commencées dès le début de 1939, et malheureusement interrompues par la guerre, nous avaient d’abord amené à des faits intéressants, mais dont les conclusions formelles n’avaient pas la netteté désirable, L'application de numérations statistiques et l’utilisation de tissus entiers, comme l’épiderme ou la

cornée d’un animal, à la place de coupes, nous ont donné la clef qui nous a permis d’utiliser notre matériel biologique, en lui faisant donner une réponse claire. Il

nous restait alors à appliquer à l’étude du cancer les notions que l’expérimentation nous avait suggéré, et ceci a constitué la deuxième partie de notre travail, que nous avons pu mener à bien dans le service de notre Maître, le Professeur LamarquEe, Directeur du Centre Anticancéreux.

L'action de la colchicine sur les tissus normaux, son efficacité sur le cancer, l’étude d’autres produits, comme le chloral, enfin la combinaison de la colchicine avec les rayons X constitueront l’essentiel de nos travaux personnels.

I, - Travaux sur le mode d'action

de la colchicine

Choix du matériel

Les animaux les plus favorables à nos recherches nous ont paru d’emblée être les Batraciens, Anoures ou Urodèles. La grande taille de leurs cellules, la facilité de leur étude cytologique, la lenteur de la mitose chez ces animaux à sang froid, enfin, considération noi négligeable en ce moment, la simplicité de leur élevage et le grand nombre des individus que l’on peut employer, tout cela constitue d’appréciables avantages dans une étude de cytologie nucléaire. Nous adressant à des phénomènes de prolifération cellulaire, il était logique de choisir des larves plutôt que des adultes. Enfin, la coupe totale de l’animal ayant permis de nous renseigner sur l’état des différents nrganes, nous avons préféré ensuite

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observer les mitoses sur des préparations de tissus entiers : épiderme mince du tétard ou cornée de l’adulte. La technique adoptée avait l’immense avantage d’éviter les erreurs d'appréciation, dues à des noyaux coupés tangentiellemen:. La netteté des figures cytologiques est d’un grand secours quand on veut: étudier la fréquence respective des différentes phases de la mitose par la méthode statistique. Bien entendu, les résultats obtenus ont été toujours comparés avec des coupes des autres organes chez les mêmes animaux.

La colchicine cristallisée que nous avons employée nous à été fournie par la maison Houné, les solutions préparées pour injections ont été faites dans l’eau distillée ou l’huile d’olive. Lorsque nous avons simplement immergé les larves, la solution a été faite dans l’eau du robinet et les témoins ont été placés dans la même eau. Toutes les expériences ont été faites à la température du laboratoire. ù $

Quand nous avons utilisé la méthode des coupes, le matériel a été fixé d’emblée soit par le liquide de Bouin- Hollande, soit par le liquide de Zenckern-formol, soit par le liquide chromo-acéto-picrique de Bataillon. Après inclusion à la paraffine, nous avons coupé à 5 & et coloré avec l’hématoxyline de Regaud, les colorations cytoplasmiques étant obtenues par l’éosine, l’érythrosine, le vert Lumière suivant les cas, ce dernier ayant l’avan- . tage de donner des images très claires. Pour éviter les causes d'erreurs dues à des laques ferriques après hématoxyline, nous avons toujours comparé les résultats obtenus soit avec des colorations à la safraninealcool picrique, soit avec des hématoxylines fortement différenciées, suivant la technique classique de Massox.

Cette dernière coloration nous a donné d’excellents

résultats, surtout pour l’examen de coupes de tumeurs humaines, dont la structure générale apparaît ainsi plus nettement. Tantôt nous avons utilisé comme troisième colorant le bleu d’aniline, qui fait partie de la technique originelle, tantôt nous lui avons substitué le vert Lumière. Dans tous les cas, une longue et minutieuse regression de l’hématoxyline à l’alcool picrique nous à permis de faire ressortir les mitoses, en colorant très faiblement les noyaux quiescents, ce qui facilite la lecture des préparations La technique de FeuLGEx, trop discutée pour être considérée comme spécifique des nucléoprotéides cellulaires, n’a pas été utilisée.

Pour les préparations de tissus in toto (épiderme cornéen), la différenciation de l’hématoxyline nous a donné quelques difficultés: beaucoup moins homogène que dans les coupes, elle est plus délicate et demande des tâtonnements. Mais les images mitotiques obtenues sont si nettes que leur lecture rapide dans un grand nombre de cellules en est grandement facilitée.

Dans l’établissement de nos statistiques, nous avons observé les préparations avec l’objectif à immersion, en comptant chaque fois le nombre de champs examinés, le nombre de mitoses qu’on y trouve et en classant ces dernières suivant le stade précis où le fixateur les a surprises. La numération des champs microscopiques nous à donné une mesure, approximative sans doute, mais utile, de la surface du tissu.

. Une analyse plus serrée de la terminologie employée pour ce travail est ici nécessaire.

Comment nous avons distingué

les diverses phases de mitose

Il va de soi que dans un mécanisme aussi complexe que la caryocinèse, toute subdivision en phases successives est évidemment arbitraire. La nature ne décompose pas comme un mouvement de gymnastique les évolutions compliquées de la chromatine au moment de la division. Mais qu’importent les séparations artificiellement établies par les biologistes, si tous les chercheurs s’entendent sur des termés précis et si chacun utilise la même méthode pour les tissus intoxiqués et les tissus témoins. Il faut et il suffit que l’on compare entre eux des phénomènes de même nature. |

C’est ce que nous allons essayer de faire en donnant notre propre nomenclature en ce qui concerne notre objet d’étude.

A) La prophase classique va des premiers remaniements des noyaux à la segmentation du spirème, qui précède la plaque équatoriale. Le déroulement de cette phase peut être subdivisé en stades plus’ courts :

a) Tout au début, la chromatine commence à prendre l’apparence d’un réseau fin et serré, où les nucléoles ont disparu, mais où rien encore ne rappelle l’aspect rubanné du spirème. C’est ce que nous appelons la prophase 1 (fig. 1);

b) Le spirème commence à s’individualiser, mais il est encore mince et ses spires sont resserrées et anguleuses. C’est le spirème serré, que nous nommerons prophase 2 (fig. 2). L’épaisseur du filament est nettement moindre qu’au stade suivant;

c) Complètement formé, le peloton qui constitue le spirème est nettement délimité: il a son épaisseur définitive ou presque, mais, en faisant varier la mise au point, on peut suivre ses flexuosités lâches, car il ne s’est pas encore fragmenté en chromosomes. C’est le spirème lâche ou prophase 3 (fig. 3);

d) Enfin, se plaçant immédiatement-avant la métaphase, il existe un moment où les chromosomes déjà individualisés, mais disposés sans ordre dans toute l’aire nucléaire, n’ont pas encore pris leur disposition rayonnante autour du fuseau. Ce stade, très fugage dans la mitose normale, correspond à ce que nous avons appelé la prémétaphase ou spirème fragmenté (fig. 4).

B) La métaphase est un stade relativement court, si nous le réduisons à ce moment où les chromosomes, disposés en aster à l’équateur du fuseau, ne sont encore ni clivés, ni attirés vers les pôles. Cet état d’équilibre relatif, avant que l’action des centrosomes ne se soit faite sentir, est aussi le moment de perméabilité cellulaire maximum et le plus fragile des stades de la mitose. C’est pourquoi il n’est pas rare qu’il avarte ou dégénère, même dans les tissus normaux (fig. 5).

C) L’anaphase, ou diaster, pendant laquelle les chromosomes effectuent leur migration vers les centrosomes, peut encore être distingué en:

a) début d’anaphase: figures en tonneau, en barillet, (fig. 6);

b) fin d’anaphase (fig. 7), suivant que les deux groupes d’éléments chromatiques sont plus rapprochés de l’équateur ou des centres.

D) La télophase a été subdivisée en:

a) télophase proprement dite, qui commence avec

l’apparition de la membrane intercellulaire (fig. 8 et 9) :

et qui se continue par l'éloignement de deux cellules filles ;

b) fin de division, qui est en quelque sorte une double prophase à l’envers et qui se caractérise par l’alvéolisation des chromosomes, aboutissant à des noyaux fils

‘de petite taille (fig. 10).

De ces neuf stades, que nous avons essayé de caractériser, il importe maintenant de comparer l’importance respective à l’état normal. On peut supposer a priori que le nombre de mitoses au début de la division (c’est-à-dire avant la métaphase) doit approximativement égaler le nombre des stades terminaux (après la . métaphase). C’est bien ce que prouvent nos statistiques faites sur des tissus normaux: le nombre des prophases, considérées dans leur ensemble, est égal ou un peu supérieur à celui des cellules finissant la division.

Enfin, signalons que ces différents moments de la mitose se suivent sans interruption et sans interposition entre eux de stades nouveaux.

Expériences préliminaires

À) Tétards de Bufo vulgaris Laur.

Ces expériences ont d’abord été faites avec des têtards de huit semaines, placés dans des solutions de colchicine, obtenues en dissolvant un centigramme, cinq milligrammes et un milligramme de celchicine cristallisée dans de l’eau distillée. Des animaux ont été prélevés tous les jours pour examen histologique et l’ensem-

"ss

ble du matériel a été étudié pendant quinze jours. Nos travaux, commencé au moment où nous ignorions les recherches analogues faites par C.-M. Laur, dans le Laboratoire du Professeur FressiNGer, nous permettent quelques remarques.

a) Effets macroscopiques:

C& qui frappe au premier abord, après 24 ou 48 heures d’action, c’est l’aspect gonflé et, en quelque sorte œdémateux, des animaux intoxiqués; l’épiderme, qui paraît d’ailleurs moins pigmenté, semble décollé des tissus sous-jacents et l’animal prend une forme un pen particulière, en « boîte de violon ». Cette constatation, facile à faire, a été corroborée par C.-M. Laur.

b) Effets microscopiques :

Après 24 heures d’action, on trouve des; mitoses de type.colchicinique dans des organes où l’activité divisionnelle est suffisante, c’est-à-dire à peu près dans tous. Les figures où les chromosomes, séparés entre eux et déjà clivés, sont disposés en désordre dans toute l’aire nucléaire, sont extrêmement fréquentes, ce qui démontre l’impossibilité de la formation du fuseau. Déjà, à la 24° heure, les images de dégénérescence pycenotique apparaissent et des boules sidérophiles occupent la place du noyau. Dans les jours qui suivent, ces dégénérescences augmentent de nombre et l’on voit des images qui rappellent étrangement ce que Dusrix a décrit sous le nom d’excrétion sphérulaire.

Les tissus où l’on trouve ces altérations sont variés. Des cinèses colchiciniques s’observent dans l’intestin, le foie, la rate, le tissu conjonctif, le cartilage, les chevrons musculaires du dos et de la queue, l’épiderme, les

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branchies, l’estomac. Mais les organes les plus riches en mitoses sont, par ordre d’importance: le système nerveux, où les divisions sccupent la couche cellulaire qui borde l’épendyme,, l'œil et le bee corné, où presque toutes les coupes montrent des cinèses bloquées. Dans l’œil, les régions les plus sensibles sont, chez l’animal jeune, la périphérie de l’ébauche, et, chez le têtard plus développé, la zone germinative, qui sépare l'iris de la partie optique de la rétine. Cette zone, ainsi que la couche périépendymaire du cerveau, ont été utilisées par SPEAR et GLUCKSMANN, pour analyser chez le têtard de Batracien l’action des rayons X sur la mitose.

Le bec corné, qu’il soit examiné en coupes ou en préparations totales, dans lesquelles on peut voir par étalement la couche cellulaire génératrice, est excessivement riche en mitoses colchiciniques. Nous verrons plus loin comment le type d’altérations qu’on y observe par-: fois (chromosomes séparés, clivés et épaissis, mais non dégénér s). peut différer chez le même animal de celui qu’on retrouve dans la cornée par exemple (chromosomes agglutinés). Il y a là une différence qualitative entre la réaction de deux organes différents, sur laquelle nous reviendrons.

Les dégénérescences pycnotiques après la mitose sont particulièrement évidentes dans le système nerveux l’examen d’un animal laissé 5 à 6 jours dans une solution à 0 gr. 01 pour 1.000 est frappant à cet égard et montre d'innombrables masses pycnotiques, qui eriblent non seulement la couche épendymaire, mais aussi le tissu nerveux qui l’entoure. On peut assez facilement suivre l’évolution des phénomènes nucléaires : les chromosomes séparés et clivés, prenant parfois une appa-

rence de tétrades chromatiques assez curieuses, s’épaississent et finissent par former des boules sidérophiles de taille inégale ; tantôt ces boules dégénèrent pour leur propre compte et disparaissent, tantôt elles s’agglomèrent en une espèce de « morula nucléaire », pour former ensuite une seule masse pycnotiue arrondie et homogène. Il est évident que ces altérations s’observent assez tard; elles peuvent d’ailleurs coexister dans le même tissu avec des mitoses normales ou simplement arrêtées. Les expériences ultérieures expliqueront plus nettement cette coexistence.

c) Effets sur le développement:

Nous n’avons jamais observé, ni chez des animaux jeunes, ni chez des animaux âgés, d’accélération de la croissance ou de la métamorphose. La taille des animaux intoxiqués est plutôt plus petite que celle des témoins, la métamorphose se fait avec quelque retard, ce qui n’a rien d’étonnant, étant donné les conditions très anormales que crée l’intoxication prolongée par la colchicine.' /

Bien qu'ayant employé dans nos expériences des doses relativement faibles, nous pouvons dire que celles-ci n’ont jamais provoqué chez nos animaux l’accélération du développement et la précipitation de la métamorphose, signalés par C.-M. Laur. Nous avons cependant observé plus de cinq cents têtards de Bufo, et ce nombre nous paraît suffisant pour nous faire dire qu’il ne faut pas imputer à la colchicine une métamorphose plus précoce chez les animaux touchés par le toxique, car il peut y avoir des discordances assez grandes, suivant les individus.

Pour cette même raison, nos expériences, faites sur des œufs du Bufo, nous paraissent contredire nette- ment celles de Laur sur les œufs de Rana. Jamais nous n’avons observé d’accélération du développement des larves ; d’ailleurs, nos recherches ont porté sur un nombre d’individus trop faible pour que nous nous permettions de les publier encore, et nous espérons pouvoir les vérifier à nouveau avant d’en tirer une conclusion

définitive.

B) Larves d'Urodèles (Molge palmata Schneïd.)

Ces expériences avaient primitivement pour but d’observer si la colchicine est capable de provoquer des - troubles du développement, quand on.immerge des œufs de Triton au moment de la segmentation dans des solutions de colchicine à 0 gr. 01 pour 1.000. Chaque œuf, pondu isolément, était placé dans la solution toxique et l’on notait chaque jour l’état du développement en le comparant avec celui des témoins placés dans l’eau. Dès que les animaux mouraient, ils étaient fixés et examinés histologiquement. D’autres étaient fixés vivants à des dates déterminées. Cette technique, incapable de nous donner de belles images cytologiques, nous donnait cependant des indications suffisantes.

a) Macroscopiquement, les trente-quatre animaux étudiés n’ont montré aucune accélération du développement, leur éclosion s’est faite du 15° au 20° jour et les larves placées dans la colchicine ont pu continuer à vivre dans cette solution.

Cependant, il nous a été donné d’observer dans un cas le gonflement de l’animal qui a pris une apparence hydropique assez curieuse. Ce phénomène isolé s’est

rétrouvé par la suite avec les embryons de Bufo, sous l’influence du chloral.

b) Histologiquement, la beauté des images colchiciniques ést très grande. Ce qui frappe, c’est le grand nombre de mitoses dans la partie dorsale de la tête; des recherches récentes ont montré que c'était une zone d’induction mitotique. C’est en effet là que se trouve le lieu de prolifération cellulaire maximum. La colchieme a done joué son rôle de réactif d’une zone germinative.

Lorsque l’animal est resté longtemps sous le coup de l’intoxication, la même région montre une quantité énorme de pyenoses, avec tous les aspects déjà décrits, de l’arrêt cinétique à la formation de spérules chromatiques.

De ces expériences préliminaires déjà anciennes il résulte simplement que le poison agit chez ces larves de Batraciens dans tous les tissus où il y a un certain degré de prolifération, que cette action est très vive, si le développement de l’organe est rapide au moment considéré, enfin que la dégénérescence nucléaire donne naissance à des sphérules sidérophiles, très semblables à ce que Dusrix a décrit, sous le nom d’excrétion sphéruläire, dans l'intestin grêle de la Souris.

Deux faits particulièrement nets doivent retenir notre attention: d’une part, la grande activité divisionnelle dans le tissu nervéux s’explique parce que ce dernier est en plein développement chez les larves, alors que celui-ci est arrêté chez l’adulte ; d’autre part, malgré

les faibles doses employées (surtout si on les compare à celles administrées par C.-M. Laur), nous n’avons jamais observé une action de stimulation de la croissance, qui reste pour nous aujourd’hui. une hypothèse

invérifiée. D'ailleurs, même si l’on admet intégralement la théorie de Dusrix, il est difficile d’accepter l’idée d’une croissance activée, alors que toutes les divisions dégénèrent. Même aux doses très faibles, à effet très lent et discret, nous n’avons jamais observé qu’un seul et même résultat: l’inhibition mitotique.

Expériences principales sur le mode d’action de la colchicine

1° TêrarDs DE Bufo Vulgaris Laur.

Toutes ces expériences sont basées exclusivement sur l’analyse statistique des phases de la division cellulaire dans la cornée du têtard de Bufo vulgaris. Ces petits animaux, qu’il est facile de se procurer en grand nombré au printemps, sont choisis au voisinage de la métamorphose, au moment où les pattes postérieures, déjà sorties, ont environ 1 à 1 mm. 1/2 de longueur, les pattes antérieures étant encore cachées sous le tégument. Ces animaux ont été immergés dans une solution de colchicine à 0 gr. 02 pour un litre d’eau. Chaque heure après l’immersion, trois d’entre eux ont été prélevés et plongés dans le fixateur. L’épiderme disséqué et décollé a été ensuite coloré à l’hématoxyline de Regaud et monté entre lame et lamelle. En raison de sa transparence, de la facilité qu’elle apporte aux numérations, nous avons utilisé la cornée, qui apparaît comme une surface circulaire plus claire et qui nous a permis d’avoir des numérations très exactes, où l’observation n’était ni faussée, ni gênée par la présence de pigment.

Les animaux, prélevés chaque heure, étaient au nombre de trois, ce qui porte à six le nombre de cor-

nées examinées. Bien que les dimensions de ces derniè-

res soient à général à peu près équivalentes, nous avons noté chaque fois le nombre de champs microscopiques observés, afin d’avoir une représentation plus exacte de la surface étudiée. Cette mesure, pour approximative qu’elle soit, donne cependant une idée comparative assez juste de celles-ci.

Si nous jetons un coup d’œil sur le tableau ei contre, qui exprime dans leur ensemble les résultats numériques obtenus, nous pouvons en tirer les conclusions suivantes :

A) Observations quantitatives

a) Nombre total de mitoses:

Si nous, considérons seulement la totalité des cellules en mitose à chaque moment, en les ramenant à un pourcentage correspondant aux champs microscopiques, nous constatons que le chiffre ne subit, dans les premières heures, aucune élévation, comme cela devrait se faire si l’action de la colchicine était d’abord de stimuler l’entrée en division. Le tableau ci-contre montre qu’il y a, au contraire, une légère diminution des cinèses dans les premières heures, c’est-à-dire de la 1° à la 11° heure environ, avec quelques aberrances individuelles, dues à ce qu’il est impossible que tous les animaux soient en même temps dans les mêmes conditions de nutrition.

C’est seulement à une heure tardive, c’est-à-dire à partir de la 24° heure, que le nombre total de divisions dénombrées monte rapidement pour atteindre 145 % à la 48° heure et 377 % au 3° jour.

Nous verrons tout à l’heure à quoi est due cette élévation terminale de la courbe.

Galileo générol- de cc

dur deé cornees de

1 le heure = 11 fotauy ourcenfag

b) Comparaison entre l’importance des stades imtiaux et terminaux.

Si l’on met en regard le nombre des cellules se trouvant dans la première partie de la division avec celui des cinèses à la fin de leur évolution, on constate, à la première heure, alors que l’action du toxique paraît pratiquement nulle, que pour 32 % de prophases (les 3 premiers stades de notre classification), il y a exactement 32 % de phases terminales, ce qui signifie que l’évolution de la mitose semble se faire régulièrement, les trois principales phases ayant dans ce cas à peu près la même longueur. Au contraire, quand la colchieine a commencé à agir, c’est-à-dire à partir de la 11° heure environ, on constate que le nombre de prophases diminue en valeur absolue et aussi en valeur relative, car il restera toujours par la suite inférieur à celui des phases terminales. Une seule exception à cela : lorsque l’action toxique aura abouti à un blocage à peu près complet de toutes les cellules avant la métaphase, les ana et les télophases deviennent impossibles et le nombre de prophases leur est tout de même un peu supérieur. Remarquons toutefois qu’elles atteignent alors des chiffres très bas (15 % à la 36° heure, 10 % à la 48° heure et 2,5 % le 3° jour).

Que veut dire cette observation? Si, comme le veut Dusrix, la colchicine provoquait dans un premier stade l’excitation de la division, on devrait avoir à ce moment beaucoup de cellules en prophase. Or, il y en a moins que jamais. C’est donc que la phase excitomitotique primitive est une hypothèse à rejeter.

On nous objectera peut-être que l’abaissement du nombre des prophases en valeur relative n’a plus une

grande valeur au moment de l? accumulation des cellules bloquées, à la 48° heure ou au troisième jour. Pour répondre à cette objection, nous avons rappor té le nombre des prophases non pas au chiffre total des divisions, mais à la surface étudiée, représentée par le nombre de champs, et nous avons pu conclure que ce nombre relativement fixe s’abaissait chaque fois que l’action morphologique de la colchicine se fait sentir (15° heure et 19° heure, par exemple) et qu’elle s’abaissait surtout à la fin de l’action (10 % à la 48° heure et 8 % au 3° jour). Notons que ces pourcentages sont plus élevés que ceux obtenus précédemment, mais ils concordent pour nous faire penser que la colchicine agit en réduisant le nombre des prophases, sans jamais l’arrêter, ce qui empêcherait toute accumulation de mitoses dans un tissu.

c) Nombre de prémétaphases (stade de spirème 3 de Bureau et VILTER) :

Le chiffre moyen de ces stades, dans notre matériel, au début de l’action et chez les témoins, se trouve être environ de 12 à 13 % jusqu’à la 11° heure. Ce chiffre est un peu plus élevé dans notre matériel que celui qui a été constaté par d’autres auteurs, chez l’Axolotl par exemple. Mais la mitose n’est pas toujours exactement comparable dans les diverses espèces animales, et il peut y avoir de légères différences de cet ordre.

Quoiqu'il en soit, le chiffre des prémétaphases commence à peine à s'élever un peu de la 11° à la 36° heure et il dépasse le chiffre de la métaphase à partir de la 48° heure.

Il y a dans ces numérations des anomalies qu’il faut expliquer : en effet, chaque fois qu’apparaissent des alté-

rations morphologiques, qualifiées par divers ‘auteurs de mitoses colchiciniques, on voit que le nombre des stades correspondant à la prémétaphase s’élève aussi, par exemple, à la 19° heure, à la 25° heure, et évidemment à partir de la 48 heure. En revanche, à la 21°, à la 23° et à la 36° heure, ces modifications ne s’observent pas. Maïs si l’on compare le nombre total des phases intermédiaires (prémétaphase et métaphase) aux stades précédents et suivants, on est bien obligé de conclure qu’il est particulièrement élevé, les prophases et les phases terminales diminuant d’importance. Même si les altérations colchiciniques typiques ne se sbnt pas montrées, il y a donc un ralentissement et un allongement de la partie moyenne de la mitose.

Plus tard, quand l’action de la colchicine sera typique et évidente, la prédominance du stade à chromosomes séparés, sans fuseau ni plaque équatoriale, sera très nettement apparente, en même temps qu’apparaftront les manifestations dégénératives.

d) Nombre de métaphases :

Le pourcentage des plaques équatoriales reste à peu près constant, jusqu’au moment où les cellules ne peuvent plus du tout entrer en métaphase, c’est-à-dire à 4 48° heure. À ce moment, leur chiffre passe brusquement de 33 % à 1 %, pour tomber à zéro le 3° jour.

e) Nombre de phases terminales:

Il en est exactement de même du nombre de cellules aux stades terminaux, qui tombe à 2 % au 2° jour et à zéro au 3°.

f) Précisions sur les prophases:

La subdivision de la prophase en trois stades a aussi une autre utilité: le pourcentage de chacun d’eux est à peu près équivalent au début de l’action; plus tard, il ira en diminuant fortement du 1” au 3° stade, le taux des spirèmes lâches étant réduit à zéro au 3° jour. Cette constatation s’explique sans doute parce que toutes les cellules qui se trouveraient normalement à ce stade sont altérées et prennent rapidement le type dégén+. ratif.

Pour nous résumer, ramenons à quelques notions pri: mordiales les données statistiques analysées:

1° Les prophases n’augmentent jamais et diminuent au contraire régulièrement, surtout à la fin de l’action toxique ; <

2° Les prémétaphases augmentent en nombre, surtout à ce moment;

3° Les métaphases restent en nombre constant, pour disparaître à la fin;

4° Les phases terminales disparaissent absolument après trois jours d’immersion dans la solution de colchicine.

Trois remarques importantes s’imposent mainte nant :

a) D'abord, le caractère lent et tardif de l’action toxique, caractère qui nous à frappé d’emblée et nous a d’ailleurs gêné dans nos expériences, car nous escomptions un début d’action plus précoce et nous n’avions pas prévu primitivement que l’analyse de l’effet toxique devrait porter sur un moment aussi tardif.

La lenteur de la mitose chez les Batraciens, ainsi qu: le procédé d’immersion dans l’alcaloïde sont respouisables d’une aussi grande lenteur, car il faut bien que le toxique ait le temps d’arriver jusqu’au contact des cellules en division;

b) La deuxième remarque a trait aux irrégularités d’action de la solution employée suivant l’animal considéré, la région du tégument examinée et même suivant le côté, droit ou gauche, du corps. Nous avons déjà signalé — et C.-M. Laur a fait la même observation —que certains têtards semblaient réagir vivement à l’alcaloïde (tel l’animal n° 3 à la 19° heure), alors que leurs congénères, placés dans la même solution pendant le même temps, ne montrent que des signes très discrets d'intoxication. Notons qu’il s’agit de différences qualitatives aussi bien que quantitatives et que les aspects des mitoses intoxiquées apparaissent chez les premiers et non chez les seconds. Nous avons pu voir, par des expériences que nous publierons ultérieurement, que des animaux, prélevés à 1.000 m. d'altitude et placés dans une solution de colchicine, n’avaient pas du tout la même sensibilité que les animaux de la plaine méditerranéenne. Ce qui est intéressant, c’est la concordance parfaite des divers résultats statistiques pour chaque animal: quand la colchicine agit, son efficacité se manifeste par l’accumulation mitotique, l’élévation du nombre des prémétaphases, la disparition des phases terminales, aussi bien que par les aspects eytologiques que nous analyserons plus loin; quand l’action à été faible, ces divers effets sont fous atténués de la même façon. Cette convergence est une des preuves les plus solides que notre analyse expérimentale était basée sur des principes indubitables.

Dans un des animaux étudiés (19° heure), nous avons été surpris de voir que la cornée d’un côté semblait manifester une réaction beaucoup plus vive que celle du côté opposé. Nous rapportons fidèlement les statistiques comparatives obtenues avec ces deux cornées.

Cornée d’un côté:

rt d'or : À Nombre de mitoses Eoiae 1aS68. . . 0 binaire Métaphases. ...... 20 %

Stades terminaux. 33 % à

Cornée du côté opposé: :

% Prophases, AMEN JA FAN RL MA a Prémétaphases. .. 84 % PP pee Métaphases. . ..:. : 5,5 % P 490.6 ME Stades terminaux. 1,5 % É

Ces chiffres sont suffisamment éloquents et indiquent clairement que la colchicine a agi énergiquement d’un côté, presque pas ou pas du tout du côté opposé. Mieux encore l’aspect des prémétaphases dans la deuxième cornée est nettement anormal: il s’agit de figures indiscutablement colchiciniques, dont beaucoup sont déjà en dégénérescence. Nous avons demandé à un autre observateur de bien vouloir refaire cette numération: ses résultats étaient concordants. Expliquer ce fait en apparence paradoxal, nous semble d’abord difficile, mais une observation plus attentive nous a montré que la cornée intoxiquée était plus petite et morphologiquement différente de celle du côté opposé. peut-être une lésion locale ou une blessure accidentelle avait-elle troublé le développement de ce tissu et permis

à la colchicine de pénétrer à la faveur d’une plaie minuscule à l’intérieur des tissus considérés. |

Cette petite expérience spontanée montre en tout cas que les irrégularités d’action de l’alcaloïde ne sont . peut-être pas imputables à des différences de sensibilité entre deux organes cytologiquement identiques, mais à des différences de pénétration.

Signalons enfin les mêmes irrégularités d’action, suivant qu’on examine la cornée, le tégument dans son ensemble ou les lèvres. Nous avons observé plusieurs fois que les mitoses colchiciniques, en prémétaphase dans la lèvre, avaient déjà l’aspect aggloméré dans la cornée et pycnotique dans la peau. Nous ignorons l’explication exacte de ces curieuses dissociations.

c) Une troisième et dernière remarque concerne l’élévation progressive du nombre des prémétaphases, qui aboutit au ralentissement des mitoses à ce point de leur évolution et à leur dégénération, faute de pouvoir achever leur cycle. Nous n’avons guère observé chez le têtard de Bufo les tentatives d’anaphase anormale sans fuseau, que nous retrouverons chez le Triton. En tout cas, l’accumulation mitotique, qui a été prise par DusrTin pour un phénomène précoce et primitif, apparaît après nos expériences comme tardif et secondaire, parce que la mitose des Batraciens, plus lente que celle des Mammifères, se prête mieux à l’analyse du début d’action de la colchicine.

B) Observations morphologiques

Que deviennent les différents stades de la division au cours de ces nombreuses modifications quantitatives ?

a) La prophase est intacte: aucun trouble de la formation du spirème n’a été décelé;

b) Celui-ci, une fois formé et ayant atteint son calibre définitif subit la fragmentation en chromosomes, sans anomalie particulière ;

c) À partir de ce moment, les chromosomes séparés tendent à se placer en plaque équatoriale, rayonnant autour de l’emplacement du fuseau (monoaster) ; il arrive que ce dernier soit moins net qu’à l’état normal et que les chromosomes viennent errer au centre de la plaque équatoriale, qui semble alors moins régulière. C’est une altération très discrète. A un degré plus avancé, la cellule est dans l’impossibilité de former cette plaque équatoriale et alors les chromosomes se disposent en désordre dans la région qui correspondrait au fuseau ; ils sont bien séparés, un peu épaissis, mais n’ont aucune tendance à se diriger vers les pôles;

d) Le clivage longitudinal, qui aboutit à la formation de paires chromosomiques accolées, n’est pas arrêté malgré l’absence du fuseau. Seulement 1’écartement des chromosomes appariés et leur éloignement vers les centres ne peut plus se faire, d’où l’aspect d’éléments non ordonnés, placés n’importe comment dans la région centrale de la cellule et très nettement clivés. C’est le premier type caractéristique de la mitose colchicinique;

e) Les altérations des chromosomes commencent-par leur épaississement; ils deviennent ensuite moniliformes, perdent leur individualité, en même temps qu’apparaît autour d’eux un halo clair, représentant peutêtre la substance fusoriale devenue amorphe. Certains d’entre eux sont aberrants et se trouvent isolés dans le cytoplasme ;

f) Plus tard, les masses chromatiques s’agglomèrent, tout en restant fortement sidérophiles; c’est alors la mitose colchicinique deuxième type, celle que Dusrin a décrite bien des fois, avec son halo clair, sa turgescence, et souvent, comme nous l’avons observé, la reconstitution autour du bloc nucléaire en voie de pycnose d’une sorte de condensation circulaire, semblable à une nouvelle membrane nucléaire, qui est probablement un aspect de dégénérescence.

g) Après un temps d’action encore plus long, on ne rencontre plus au milieu des noyaux quiescents que des pycnoses, soit en une seule boule homogène, soit en plusieurs boulettes fortement chromophiles, car ces noyaux dégénérent ensuite pour être la proie des leucocytes ;

h) Nous n’avons pu observer chez les têtards de Bufo ces images de pseudo-anaphase, où la séparation en deux groupes chromatiques fils tend à se faire sans l’intervention du fuseau.

2° Larves très jeunes de Bufo vulgaris Laur

Avant même de commencer les expériences que nous venons de rapporter, nous avons cru pouvoir nous servir d’un matériel un peu différent: il s’agit aussi de larves de Bufo vulgaris, mais prises tout à fait au début de leur développement, c’est-à-dire au 4° ou 5° jour. Ces larves ont dû être étudiées par la méthode des coupes, l’épiderme trop fragile et trop mince ne pouvant être dissocié. Nous espérions éliminer, en nous servant d’individus aussi jeunes, le facteur alimentaire, si important chez les animaux plus âgés, car nous pensions que l’activité mitotique était soumise à une impulsion interne assez forte pour qu’elle soit indépendante des changements de nutrition.

En réalité, l’action de la colchicine s’est montrée beaucoup plus faible et surtout beaucoup plus lente que nous ne l’aurions pensé. C’est ainsi, par exemple, que les larves placées dans une solution à 0 gr. 01 par litre, concentration très active pour des animaux avant la métamorphose, donne, à la 72° heure d’action, un pourcentage qui s’exprime ainsi:

PrOPhases RER ER ANE MERE 1r5 Prémétaphasese nee" 545 % Métaphinasess ss Le 24,5 % Stades terminaux .......... 107

Il est vrai qu’à la 10° heure on a le pourcentage suivant:

PTODHASES IT ATEN TENTE ea ÉFrémeétanhases re er. 232% Métaphases mar re 164% Stades terminaux .......... TETE

ce qui montre déjà une élévation nette du chiffre des prémétaphases.

Quelle conclusion tirer de cette variante apportée à nos expériences? Que l’action de l’alcaloïde se montre excessivement ménagée et progressive dans le cas d’animaux jeunes. Or l’examen des coupes montre qu’ils ont encore des tissus bourrés d’enclaves vitellines. On peut donc supposer que la colchicine, dont la solubilité dans les lipides est bien connue, s’est fixée sur le vitellus et que sa diffusion dans les tissus en a été gênée. Cette hypothèse est à vérifier.

3° Action sur les tissus d’autres Batraciens Anoures

Nous avons essayé également d’observer l’action sur la cornée de la Raïnette (Hyla arborea Li) et du Crapaud (Bufo vulgaris Laur) adultes. Elle est exactement sem-

blable à celle obtenue chez des têtards des mêmes animaux, mais on remarque que dès la 12° heure apparaissent des images pycnotiques, indiquant un moment d’action beaucoup plus avancé, ce qui est dû à la voie sous-cutanée utilisée comme mode d’introduction.

4° Action sur les Tritons alpestres (Moige alpestris Laur)

Des Tritons alpestres, pêchés dans un lac de montagne, à 2.090 m. d’altitude, portés ensuite à 1.000 m., ont été injectés, par voie intrapéritonéale, avec deux dixièmes de centimètre cube d’une solution de colchicine à 1 pour 4.000. Chaque injection était faite simultanément à trois animaux, tantôt une femelle et deux mâles, tantôt l’inverse. L'étude de ce matériel, que nous avons pu nous procurer en août 1941, est encore en cours. Nous n’avons pas terminé l’examen histologique de tous les organes, à chaque moment de l’action toxique (l’expérience étant échelonnée sur une soixantaine d’heures).

A) Cornée:

Les cornées prélevées in toto et colorées à l’hématoxy-

line de Recaup ont donné les statistiques suivantes:

A la septième heure:

PROD ES MR NE AE 25 -R Prémétaphises 7 han 2ErÉmE Metiplaies anne ne 8 % Stadesstérminaux.:. 5.1.7. 50 % À la vingt-quatrième heure:

PEODEAS SES Tee du ee 22 % Prémétaphasés. 2.4... 43 % Métaphases.… =..1..:.....… 5 %

PélODRE ses TE 2, 30 %

Les expériences faites sur les Têtards de Bufo se trouvent donc confirmées, avec plus de netteté encore, car nous avons employé une technique moins sujette à l’erreur (injections) et parce que l’action a été plus rapide. Il ressort de ces deux numérations que les prophases sont relativement peu touchées, bien que légè- : rement diminuées par la colcichine, que le nombre des prémétaphases s’élève progressivement, empiétant sur celui des métaphases, qu’il réduit d’autant, et qu’enfin les stades terminaux dépassent toujours le chiffre des prophases, tout en diminuant en valeur relative, dans la mesure où le blocage de la division leur enlève des éléments.

De plus, la grande taille du noyau facilité l’observation à l’immersion, élimine les causes d’erreurs et permet enfin d’analyser de plus près les aspects morphologiques de la cellule intoxiquée. Parmi ces effets, il en est un sur lequel nous voudrions insister, c’est ce que nous avons appelé la prémétaphase: quand les chromosomes se sont individualisés, après le stade du spirème lâche, il arrive que l’on observe dans les tissus nor-' maux, un moment où ces derniers vont se disposer en plaque équatoriale, aplatie suivant un plan perpendiculaire au fuseau, mais où celle-ci n’est pas encore formée. À cet instant commence l’action de la colchicine: nous avons vu que, sous son influence, le fuseau n’apparaissait pas, mais que le clivage longitudinal se faisait tout de même.

1° L'image colchicinique la plus précoce est représentée par des chromosomes épais, en partie clivés, mais non disposés en couronne rayonnante, Certains ont

commencé leur clivage par la pointe du V alors que les branches sont encore au contact (fig. 11) ;

2° Le clivage peut s’accentuer, les paires chromosomiques restant toutes plus ou moins rapprochées et parallèles les unes aux autres. À des degrés différents, on retrouvera ce stade dans les figures 12 et 13. Les chromosomes paraissent alors beaucoup plus grêles, parce qu’ils sont séparés en deux;

3° Toujours après le clivage, les chromosomes dédoublés peuvent rester dans la même zone centrale de la cellule, sans ordre bien défini, et sans que les paires chromosomiques restent parallèles (fig. 14) ;

4° Si la tendance à la formation de la plaque équa- ‘toriale l’emporte, on peut trouver un aspect de chromosomes rayonnants dont certains sont un peu aberrants et parmi lesquels d’autres occupent l’emplacement du fuseau (fig. 15) ;

5° Enfin, l’attraction polaire peut l’emporter et l’on voit alors apparaître une certaine tendance à la formation de l’anaphase, sans qu’on puisse découvrir le fuseau ; il y a des chromosomes aberrants plus ou moins en retard ou en dehors des groupes principaux (fig. 16).

Une autre série d’images cytologiques est donnée par les dégénérescences de la mitose bloquée.

a) Certaines sont caractéristiques (planche 2, fig. 20, 21, 22, 23 et 24). On y retrouve toute la gamme d’altérations, depuis la prémétaphase avec clivage jusqu’à la pyenose. Les figures que nous donnons sont empruntées à des préparations de cornées de têtards, qui, d’ailleurs, offrent les mêmes aspects que d’autres animaux. D'abord, les chromosomes deviennent épais, monilifor-

mes et s’entourent d’un halo clair fortement marqué. Puis ils s’agglutinent, sans perdre leur individualité. Parfois, l’un d’entre eux, un peu aberrant, s'éloigne du groupe chromosomique principal. A la fin, l’agglomérat de fragments chromatiques se condense pour former ce que nous appelons une « morula nucléaire », image que l’on trouve en grand nombre à la fin de l’action toxique, vers le 3° ou 4° jour, dans les tissus riches en mitoses. Enfin, signalons que certaines de ces masses pré-pycnotiques s’entourent d’une condensation plus ou moins nette qui paraît correspondent à première vue à une reconstitution de la membrane nucléaire (fig. 24). Cet aspect s’observe également dans les tissus néoplasiqnes. Des auteurs ont décrit la formation de micro-noyaux, de noyaux polylobés, considérés comme formés aux dépens des chromosomes aberrants. Nous ne pouvons affirmer avoir vu quelque part des images analogues: les cellules à noyaux polylobés que nous avons observées étaient des leucocytes et non des cellules épithéliales.

b) D’autres images sont moins caractéristiques. AzBEerTi et Porxrzer les ont retrouvées sous l’influence des rayons X. L’anaphase à chromosomes épaissis (fig. 17), la télophase à tendance pycnotique (fig. 18), et surtout l’anaphase à chromosomes aberrants (fig 19), sont des aspects beaucoup moins fréquents; nous les avons retrouvés nous-même sur la cornée du têtard irradié. Les figures que nous donnons sont extraites de cornées de Tritons après colchicine. Cela montre que les aspects dégénératifs de la mitose sont en nombre limité, qu'ils apparaissent dans toutes sortes de conditions anormales et que c’est une erreur de vouloir

faire de ces altérations banales une image caractéris- tique d’une intoxication spécifique.

B) Autres organes:

Nous avons étudié le foie et les organes génitaux de nos Tritons intoxiqués par la colchicine.

Dans le foie, on observe des mitoses uniquement dans Ja couche corticale de l’organe, qui a chez ces animaux la valeur d’un tissu hématopoïétique. Ces mitoses sont en nombre assez limité et prennent les aspects que nous avons décrits plus haut, c’est-à-dire que les prémétaphases y dominent.

Le testicule réagit différemment. Nous avons pris des animaux dont les organes mâles étaient littéralement bourrés de spermatogonies, avec une très petite quantité de cystes à spermatozoïdes. Après 21 heures d’action, par exemple, nous avons vu que la colchicine agit sur ces cellules, dont les chromosomes allongés, minces et d’aspect plumeux, sont généralement aux stades leptotène ou pachytène, en provoquant un épaississement de ceux-ci et finalement une sorte de pycnose, un peu différente de celle que provoque la colchicine dans la cornée, par exemple. Cet aspect n’existait pas chez les témoins et croissait en intensité avec l’action toxique. L'intérêt de cette expérience était de savoir si l’état particulier de la chromatine, en dehors d’une mitose proprement dite, était capable de rendre ces cellules sensibles à la colchicine. Il nous semble qu’on peut répondre affirmativement à cette question.

On trouve enfin des mitoses .colchiciniques dans le rein, les canaux de Wolff du mâle et dans l'intestin.

Pour l’ovaire, qui ne présente pas normalement de mito- 1°

ses à ce stade de la vie sexuelle, nous avons seulement noté une irrégularité plus grande des contours da noyau, avec des nucléoles plus ou moins dispersés en son centre.

Il. -- Travaux sur le mode d'action du chloral

Nous avons été frappé par l’examen de préparations d’animaux intoxiqués par l’hydrate de chloral, dont nous avons étudié le tégument ou les cornées.

Macroscopiquement, ce narcotique agit sur les jeunes larves de Bufo en provoquant un gonflement du corps,

analogue à ce que nous avons déjà observé chez des.

têtards plus âgés, sous l’influence de la colchicine. Après immersion dans une solution de chloral à 1 pour 1.000, l’épiderme était transparent et comme décollé des organes sous-jacents, l’ensemble de l’animal prenant un aspect sacciforme. Si on laissait pendant un certain temps les animaux dans la solution, tous ne mourraiert pas, mais quelques-uns présentaient dans la région postérieure une petite boulette blanchâtre de vitellus, s’éliminant pas l’orifice anal. Cette observation, assez souvent répétée, peut correspondre à un signe non spécifique d’intoxication. |

L'aspect histologique du tégument de ces animaux est plus intéressant. Si nous l’examinons 14 heures après l’immersion dans une solution aqueuse de chloral et si nous appliquons la méthode de la numération des phases, Voici Ce que nous observons :

a) Les prophases ont complètement disparu ;

b) La prémétaphase est cependant représentée par 8 % des mitoses, soit un chiffre à peu près normal;