CARE

de Tarozzi (Bouillon nutritif et fragment d’organe, rein, foie, cerveau, rate, etc..., recueilli aseptiquement).

Au milieu de Tarozzi il ajoute 0,5 % d’acide acétique, après 3 à 4 jours de culture dans ce milieu, il fait ses isolements en gélose profonde de Veillon.

Cruishanks en 1925 se sert de bouillon glucosé ou lactosé à 1 %, neutre, additionné d’un morceau de rein de lapin. Ce milieu ensemencé est laissé 6 à 8 jours à l’étuve à 370 sous couche de vaseline ; après quoi il procède à l'isolement en tubes de gélose de Veillon.

Schiaparelli en 1927 emploie la gélose profonde à l’infusion de foie, lactosée à 2 #.

Toutes ces techniques ont leurs avantages, elles ont presque toutes pour but l'enrichissement de la semence en Bacillus Bifidus,enrichissement illusoire, car le Bacille du côlon qui est souvent adjoint pousse beaucoup plus rapidement et par conséquent gêne considérablement la culture du Bacillus Bifidus.

Sur les conseils de M. Legroux, nous employons la technique de Tissier, des dilutions successives,

modifiée de la facon suivante :

a) Le milieu de culture. — Au lieu d'employer la gélose profonde glucosée de Veillon seule, comme milieu nutritif, nous nous servons d’un mélange de gélose de Veillon et de gélatine nutritive glucosée à

ie

raison de 2 parties de gélose de Veillon, pour une partie de gélatine nutritive.

De cette façon :

Le milieu étant plus limpide, la morphologie des colonies apparaît plus nettement, les irès fines colonies sont bien visibles.

Il est plus aisé d'aller chercher les colonies isolées, le milieu n'’offrant pas une résistance considérable à la pipette qui sert au prélèvement de ces colonies.

Enfin grâce à la présence de gélatine nutritive on évite une lyse rapide possible des bactéries.

Immédiatement avant d’ensemencer nos tubes ainsi préparés, nous incorporons à la gélose gélatine fondue et refroidie à 550,15 à 20 gouttes par tube d'extrait globulaire préparé selon la technique indiquée par M. Legroux.

Puis nous pratiquons nos ensemencements selon la même techuique que Tissier.

b) La pipette de Vignal. — Dans les tubes de gélose-gélatine ainsi ensemencés et avant la solidification nous faisons des prélèvements au moyen de la pipette de Vignal.

Les pipettes de Vignal que nous employons au Laboratoire sont en verre blanc, cylindriques, de 4 millimètres de diamètre et longues de 20 centimètres, Elles sont stérilisées au four à flamber. Les

deux extrémités de la pipette sont étirées, par étranglement à la veilleuse d’un Bec Bunsen.

Au moment de leur emploi on brise un de ces étranglements, puis on passe rapidement la pipette à la flamme, et on la plonge ensuite dans le milieu ensemencé et non encore solidifié. On aspire à l'autre extrémité de façon à remplir complètement le tube de Vignal. Pour chaque tube de gélose gélatine on fait ainsi 2 ou 3 pipettes de Vignal.

Lorsque le milieu fait prise dans la pipette, on scelle à la veilleuse du Bec Bunsen chacune des deux extrémités en recueillant les projections qui pourraient se produire dans un petitcornetde papier.

Les tubes de Vignal numérotés, sont alors refroidis comme les tubes de gélose gélatine en les plon. geant dans l’eau froide, puis mis avec ceux-ci à l’étuve à 37° après solidification du milieu.

L'emploi de la pipette de Vignal permet la conservation intacte de 1 ou de 2 tubes de culture dans lesquels on pourra suivre ultérieurement l’évolution de la culture du Bacillus Bifidus.

D'autre part, le prélèvement des colonies isolées à l’intérieur de ces pipettes est beaucoup plus simple que dans les tubes de gélose de Veillon :

Une colonie étant soigneusement repérée, on fait à la lime, un peu au-dessus du niveau de cette colonie, un trait circulaire et avec l'extrémité d’une pipeite portée au rouge on appuie sur le trait de lime. Le tube se brise à ce niveau très facilement et les

Mo re deux parties ainsi séparées sont déposées dans une boîte de Pétri stérile.

Le prélèvement de la colonie répérée est alors bien simple. Ces colonies prélevées sont examinées et repiquées jusqu’à l'obtention de cultures pures.

Néanmoins l'isolement du Bacillus Bifidus en partant des selles du Nourrisson bien portant, au sein, n’est pas toujours chose facile, la principale difficulté venant de l'extrême lenteur du développement de ce germe in vitro.

Quand il se trouve associé à d’autres germes, comme le Bacille du côlon, même en petit nombre, ceux-ci vont pulluler très rapidement dans les tubes de culture qu’ils envahissent en entier.

Si en outre ils donnent des gaz, ceux-ci disloquent le milieu.

Dans ces conditions lescolonies de Bacillus Bifdus sont souvent très difficilement distinguées.

C'est pourquoi il est toujours bon de faire de nombreuses dilutions.

Caractères de culture du bacillus Bifidus

Bouillon nutritif., — En anaérobiose, le bacillus bifidus cultive facilement en bouillon glucosé ou lactosé. Après 3 jours d’étuve à 370, le milieu est légèrement trouble avec dépôt floconneux dans le fond du tube, dépôt facilement dissociable par agitation.

Du 4e Na

Les divers procédés habituellement employés pour la culture des bactéries anaérobies en milieu liquide, donnent tous de bons résultats avec le Bacillus bifidus, mais en raison de sa simplicité et de la facilité des prélèvements, nous préférons employer la technique préconisée par Yvan Hall en 1915 et modifiée par Kadish en 1923.

Des tubes à essai ordinaires sont étranglés à leur partie moyenne — étranglement de 10 millimètres de diamètre sur 2 centimètres 5 de hauteur environ. Le bouillon nutritif est réparti dans ces tubes ainsi étranglés jusqu’à 2 centim. au-dessus de l’épaulement supérieur de l’étranglement, qui est ensuite obturé au moyen d'une bille de verre sphérique de 11 à {2 millimètres de diamètre légèrement supérieur à celui de l’étranglement. Le tube initial d'Yvan Hall était obturé par une bille de marbre. Les tubes sont ensuite bouchés au coton et stérilisés à l’autoclave à 1150.

L’autoclavage réduit les milieux. Le milieu reste réduit pendant un temps très long ce qui peut-être mis en évidence par l’adjonction de bleu de méthylène comme indicateur de réduction.

Le bleu de méthylène, en milieu oxydé, garde sa coloration bleu verdâtre qu’il perd en milieu réduit, mais comme presque toutes les matières colorantes artificielles, il fixe énergiquement l'hydrogène et n'existe plus dans les milieux qu'à l’état de leucodérivé.

Dans uu tube d’Yvan Hall, qui vient de sortir de l’autoclave et dans lequel on avait préalablement

P, Delbove 2

ajouté au bouillon nutritif deux ou trois gouttes d’une solution de bleu de méthylène à 1 pour 100, en ayant soin de bien répartir le colorant dans tout le milieu, de facon à ce que celui-ci prenne une teinte uniformément bleue, on constate qu'il s’est opéré une réduction complète. Tant dans la zone sus-jacente que dans la zone sous-jacente à la bille, le milieu est devenu absolument incolore. Mais assez rapidement leliquide au-dessus de la bille reprend la couleur bleu-verdâtre, tandis que la partie inférieure du tube demeure indéfiniment incolore.

Cette épreuve au bleu de méthylène comme indicateur de la réduction d’un milieu, montre les avantages de la technique d’Yvan Hall sur les autres procédés de cultures anaérobies en milieux liquides :

On peut priver les milieux liquides d'oxygène libre par le procédé du vide ou par l’adjonction d’un corps réducteur, ou encore en les recouvrant d’une couche de paraffine. Dans tous ces cas la coloration du bleu de méthylène est assez rapide ; elle se fait plus lentement lorsqu'on a employé un cylindre de vaseline pure qui assure une meilleure obturation du milieu. Elle n’a jamais lieu dans la partie sousjacente à l'étranglement du tube d’Yvan Hall.

Celui-ci réalise donc un excellent procédé pour la culture des bactéries anaérobies en milieux liquides.

Avec le Bacillus bifidus, on obtient ainsi dans la région inférieure du tube, là où l’anaérobiose est réa-

lisée, une culture plus rapide et plus abondante,

pol

Après 24 heures le milieu est légèrement trouble et après 48 heures il y a un dépôt assez abondant dans le fond du tube: le milieu ne redevenant jamais limpide.

Avant de pratiquer les ensemencements dans les tubes d’Yvan Ilall nous incorporons toujours au bouillon nutritif 42 à 15 gouttes de solution stérile de glucose à 30% et 8 à 10 gouttes d’extrait globulaire.

Lorsque le bouillon glucosé est préparé depuis quelque temps, il est bon de régénérer les milieux avant de les employer. Pour cela les tubes sont portés au bain-marie et quand la température du milieu atteint 80 à 90° — température réalisée quand l’eau du bain-marie bout depuis 5 à 10 minutes — on libère l’oxygène dissous en frappant le tube légèrement ; de fines bulles de gaz partent du fond du tube et viennent se collecter sous la bille.

Le milieu est régénéré quand l'agitation ne provoque plus la formation de gaz.

Cette régénération effectuée, l'extrait globulaire est ajouté comme précédemment.

Les ensemencements ou les prélèvements dans les tubes d’Yvan Hall se font à la pipette Pasteur : le tube est légèrement incliné, la pipette stérile ou chargée de semence va déplacer la bille obturatrice et peut alors pénétrer facilement dans le fond du tube soit pour ensemencer le milieu soit pour y prélever une partie de la culture à étudier.

Avant d’ensemencer un tube d’Yvan Hall, il est

SU

toujours bon de s’assurer que la bille obturatrice u’est pas coincée dans l’étranglement : quelques légères secousses imprimées au tube contre le dos de la main doivent la déplacer facilement.

Gélose de Veillon ou gélose gélatine. — En gélose glucosée profonde de Veillon ou en gélose gélatine préparée comme nous l'avons indiqué précédemment, les colonies isolées du Bacillus Bifidus ont en général une forme lenticulaire ou ovoïde, à bords nets, de coloration blanchâtre. D'une des faces de la lentille partent fréquemment un ou plusieurs prolongements. Parfois la colonie affecte une forme plan convexe.

Le diamètre maximum de ces colonies peut atteindre 4 millimètres, mais en général il ne dépasse pas deux millimètres.

Les zones. — La répartition des colonies dans les tubes de culture offre certaines particularités intéressantes,.

Voici comment M. Tissier décrivait la culture du Bacillus Bifidus en gélose profonde :

« Dans la gélose glucosée profonde, trois jours après l’ensemencement on voit apparaître de fines colonies régulières, ovoïdes, de coloration blanchätre, et s’arrêtant très nettement à trois centimètres de la surface en formant un anneau.

« Get anneau, vu au microscope, se montre formé de petites colonies égales entre elles, mais qui cinq