LE BACTÉRIOPHAGE I PARASITE INTERNE

avant toute multiplication^ disparaître du liquide. En effet, chaque ultramicrobe doit tout d'abord pénétrer dans une bactérie, c'est là qu'il doit se multiplier, et une fois la bactérie dissoute les ultramicrobes reparaîtront dans le liquide. La vérification est aisée.

Exp. — Je prépare les ëmulsions suivantes :

1^ loo cm^ d'ëmulsioQ de Itacilles de Shiga à 25o millions par cm^ sont inoculés avec i/4 de cm** d'une culture de Bactériophage.

a^ lOO cm^ d'émulsion de vibrions cholériques à 260 millions par cm^ sont également inoculés avec i/4 de cm* de la même culture debactériophage anti-Shiga.

3® 100 cm^ de bouillon neuf sont additionnés de i/4 de cm^ toujours de la même culture de Bactériophage.

Les émulsions sont placées à l'étuve à Sy®.

De suite après l'inoculation du Bactériophage, après 3o minutes, puis enfin après une heure, je prélève 20 cm*. de chacun des trois liquides et je les centrifuge pendant dix minutes à 4-ooo lours par minute.

J'ai donc neuf tubes centrifugés. Je prélève i/^o de cm^ de chacun des liquides surnageants que j'introduis dans autant de tubes contenant 10 cm' d'une émulsion de Shiga, et j'effectue une numération des ultramicrobes en étalant i/5o de cm' de chacune de ces neuf émulsions sur six boîtes de Pétri, de manière ù obtenir une moyenne. Le résultat de ces numérations me donnera donc le nombre d'ultramîcrobes restés dans le liquide, ceux qui auront pénétré au moment de la centrifugation dans des bactéries se trouvant nécessairement dans le culot. Voici les résultats.

Tube I. Emulsion Shiga -|- bactériophages.

a) Prélèvement immédiat : 214, io3, 187, 221, 229, i83 plages.

Moyenne : 2o/|. Soit 5 millions de germes bactériophages par cm' d'cmulsioD primitive de suite après l'inoculation.

b) Prélèvement après 3o minutes : 3, 7, 4^ G, 6, 3 plages.

Moyenne 5. Soit 125.000 germes bactériophages dans l'émulsion primitive 3o minutes après l'inoculation; c'est-à-dire que sur 41 ultramicrobes inoculés, 4o ont disparu du liquide.

Une numération directe de l'émulsion sans centrifugation, donne 5 millions d'ultramicrobes par cm^ il est donc certain que les ultramicrobes qui on! disparu du liquide ont été centrifugés avec les bacilles. Or, comme nous allons le voir par les deux expériences témoins, en 1 absence de bacilles de Shiga, celte sédimentation ne se produit pas (tout au moins pour une vitesse de 4.000 tours).

c) Après 1 heure une nouvelle num:ralion, pratiquée comme précédemment sur le liquide centrifugé, donne une moyenne de 8 plages, soit 200.000 ultramicrobes par cm^ sensiblement le môme nombre qu'après 3o minutes.

Numération sur l'émulsion non centrifugée, 6 millions 1/2 d'ultramicrobes, c'est-à-dire, à peu de chose près, le môme -nombre qu'immédiatement après l'inoculation.

Notons que dans l'hypolhèse envisagée de la culture intrabactcrienoe, cha-

44 LE BAGT£RIOPHi.GE

que* colonie en formation dans rîntérieur d*une bactérie ne peut donner qu'une seule plage; de même que dans la numération des bactéries par les procédés connus, tout groupe de bactéries ensemencé sur gélose ne donne qu'une colonie.

d) Une nouvelle numération effectuée sur Témulsion centrifugée et non centrifugée après-i h. 3o donne le même nombre d'ultramicrobes, soit, 90 millions : les germes inoculés ont donc passé de 5 à 90 millions, ils se sont donc accrus dans la proportion de i à 18, et cela apparemment d'une manière bnusque, ce qui ne peut se faire que par suite d'une mise en liberté de véritables colonies de 18 germes en moyenne. Nous verrons que l'examen à l'ultramicroscope montre en effet que la lyse de la bactérie parasitée se produit brusquement par éclatement.

Tube 2, témoin. Emulsion Vibrion -j- Bactériophage.

Numération effectuée de suite après addition du Bactériopbage : sur l'émulsion centrifugée, 201 plages; non centrifugée, 211.

Après 3o minutes : emulsion centrifugée. 210 ; non centrifugée 216. Après I heure : emulsion centrifugée, 2o3 ; non centrifugée 199. Après I h. 3o' : emulsion non centrifugée 207.

Tube 3, témoin. Bouillon stérile -|- Bactériophage. De suite : 206 et 210 ultramicrobes par cm^.

Après 3o minutes : 201 et 211.

Après I h. 2o3 et 206.

Après I h. 3o' : 198.

Comme on le voit, rien ne se passe en l'absence de bactéries attaquables : les ultraraicrobes inoculés restent inertes dans le liquide.

La multiplication en présence de bacilles de Shiga ne laisse place à aucun doute touchaiit les points suivants :

après 3o minutes de contact à Sy** les ultramicrobes ont presque totalement disparu du liqi>ide, ils sont fixés par les bacilles. Après I heure, la situation est la même;

après I h. 3o, accroissement brusque du nombre des ultramicrobes ;

la fixation est élective : elle n'a pas lieu en présence du Vibrion cholérique, pris comme test, sur lequel le Bactériophage employé n^avait aucune action.

On peut en conclure que la culture des ultramîcrobes se fait a l'intérieur des corps bacillaires, d'autant plus que tous les autres faits viennent corroborer cette conception imposée par Texpérience. Nous comprenons maintenant la culture du Bactériophage par à-coups successifs que nous avons constatés lors de Tétude de la multiplication des germes : chacun des ultramicrobes inoculé pénètre à rintérieur d'un bacille, s'y multiplie ; à un moment donné le

LA BÂGTÉRIOLYSfi AU MIGHOSGOPE 45

corps bacillaire éclate, mettant ainsi en liberté la colonie d'ultramicrobes qui s'est formée au sein de son protoplasma. Nous verrons une confirmation de ce fait lors de Texamen du phénomène à Fultramicroscope et de Tétude de Taction temporairement inhibitive du sérum antibactériophage.

Nous avons vu que- les accroissements successifs sont séparés par un intervalle d'environ une heure et quart à une heure et demie; d'autre part une expérience complémentaire, exécutée de la même manière, mais en centrifugeant Témulsion de lo en lo minutes au cours de la première demi-heure, m'a montré que très peu d'ultramicrobes sont fixés après lo minutes, ils le sont presque tous après 20 minutes. L'accolement demande donc environ un quart d'heure.

Étant donné la rapidité de multiplication des ultramicrobes et le temps écoulé entre chaque accroissement successif, on peut facilement calculer qu'un ultramicrobe donne, dans chaque bactérie, naissance à une colonie variant entre i5 et 26 individus, et cela en l'espace d'une heure à une heure et quart.

LA BACTÉRiOLYSE AU MICROSCOPE

Prenons toujours comme exemple l'action du Bactériophage anti- Shiga sur une émulsion de bacilles dysentériques.

Nous avons vu que si l'inoculation du Bactériophage a été massive tous les bacilles sont attaqués dès le début, leur multiplication s'arrête net : après 2 ou 3 h. le milieu commence à s'éclaircir peu à peu et devient complètement limpide quelque temps après. Si au contraire l'inoculation a été minime, les quelques ultramicrobes inoculés ne contaminent qu'un nombre égal de bacilles, l'immense majorité de ceux-ci reste indemne et ils se cultivent comme ils le feraient dans un milieu neuf; mais les ultramicrobes se multipliant également, et cela suivant une progression plus rapide que celle des bacilles, en peu d'heures leur nombre. devient égal ou supérieur à celui de ces derniers : c'est à ce moment que, macroscopiquement, la lyse commence.

i^ Examinons d'abord le premier cas, celui d'une inoculation massive. Prélevons de temps en temps une goutte de Témulsion jusqu'au

46 LE BAGTERIOPHAGE

moment où la lyse est complète, étalons la goutte sur une lame et colorons, soit par la méthode de Gram, soit à la thionine phéniquée, soit par la méthode de Romanowsky-Giemsa : toutes donnent d'ailleurs à peu près le même aspect.

Voici les résultats d'un de ces examens.

ËmulsioQ de Shiga à 260 millions par cm^ inoculée avec i/io de cm^ d'une culture de Baclériophage et placée à Téluve à 870.

Après i5 minutes : aspect d'une culture normale de Shiga.

Après 3o minutes même aspect; quelques bacilles prennent mal la couleur.

Après 45 minutes : le nombre des bacilles mal colorés est environ de loo/o.

Entre i h. et 2 h. : le nombre des bacilles mal colorés augmente sans cesse et après 2 h. on n'en trouve que de rares échantillons prenant normalement la coloration. On ne voit d'autre part que des débris informes et des granulations provenant certainement des bacilles déjà lysés, car on en observe de semblables, très nombreuses, dans les vieilles cultures normales de Shiga ; ces granulations se dissolvent plus lentement que le reste des autres substances constituant le corps bactérien. On distingue enfin, et ceci est le point le plus important, des formes spbériques ou plus ou moins ellipsoïdales, de dimensions assez variables, toujours rares,, ayant de 4 à 7 p par 3 à 5 ; nous verrons dans un moment de quoi il s'agit. Enfin quelques rares formes bacillaires bien colorées, ayant de 8 à 12 a de longueur.

Entre 2 et 3 h., les débris informes augmentent considérablement, les formes bacillaires diminuent rapidement. On voit encore quelques rares formes spbériques.

Après 4 b. la lyse devient de plus en plus complète. On ne voit plus qu'un bacille mal coloré tous les deux ou trois champs. Peu à peu les débris informes disparaissent à leur tour ainsi que les granulations. Après 36 h on ne peut plus rien distinguer sur préparations colorées.

A Tullramicroscope on ne voit à aucun moment d'autres éléments figurés que les bacilles (dont le nombre diminue peu à peu à partir de la 2® h. environ), et, sans qu'on puisse dire qu'il s'agit d'un élément figuré, des granules extrêmement fins. Au début l'aspect des bacilles est normal ; après 45 à 60 minutes on voit de fins granules, de plus en plus nombreux, dans l'intérieur des bacilles, le nombre de bacilles avec granules inclus augmente rapidement avec diminution parallèle du nombre des bacilles normaux. Voici la partie la plus intéressante de l'observation (i) : de i h. i5 à i h. 3o après le début, on commence à voir des bacilles ventrus et des corps sphériques, contenant un nombre variable de granules, de i5 à 20 en moyenne, ayant, si on les compare à un bacille normal, de 3 à

(i) Observé pour la première fois par P. Jeantet.

LÀ BAGTERIOLYSE AU MIGROSGOPK 47

5 jjL de diamètre. Si l'on suit avec attention un de ces corps sphériques, on assiste après un temps variable, pouvant aller jusqu^à une dizaine de minutes, à un véritable éclatement s'efFectuant en l'espace d'une fraction de seconde. Aussitôt après, il reste à la place du corps sphérique un léger flocon nuageux qui se dissout peu à peu, libérant ainsi les fins granules. Ces corps sphériques sont surtout abondants au moment où la lyse est la plus active. Il ne peut y avoir aucun doute au sujet de leur nature : ce sont des bacilles qui, sous Teff^et d'une force qui ne peut être qu'interne, prennent d'abord une forme globuleuse puis éclatent ; ce qui le prouve, c'est qu'on assiste parfois à l'éclatement de bacilles renflés avant même d'avoir pris la forme sphérique. Cette observation est la preuve directe que c'est bien à l'intérieur même des bacilles^ que l'ultramicrobe se multiplie et exerce son action : la destruction s'opérerait d'une toute autre manière s'il s'agissait d'une action dissolvante extérieure, de plus la forme sphérique et l'éclatement prouvent sans contestation possible que la force qui agit est interne.

Que représentent les fins granules qui ne sont décelables qu'à Tultramicroscope? On ne peut rien affirmer, il est toutefois permis de supposer qu'il s'agit des ultramicrobes et cela en se basant sur l'examen comparatif de cultures dont le nombre d'ultramicrobes a été préalablement compté par numération sur gélose : en prenant deux cultures présentant de grandes différences, on remarque toujours un parallélisme entre le résultat de la numération et le nombre de granules observés. Je rappellerai également que nous avons vu précédemment à propos de la multiplication des germes, que cette multiplication semble se faire par à-coups successifs (ce qui correspond à l'éclatement d'un grand nombre de bacilles parasités), et que le nombre d'ultramicrobes mis en liberté après i h. i/4 à i h. 1/2 correspond environ à 18 germes nouveaux pour un inoculé ; or nous venons de voir que le nombre de granules lors de l'éclatement varie de i5 à 25. Il y a donc de grandes probabilités pour que les granules soient bien réellement les ultramicrobes bactériophages.

2*^ Inoculation minime : dans ce cas le milieu se trouble de plus en plus avant que la lyse commence à s'effectuer.

EmuisioQ de Siiiga à 25o millions par cm', inoculée avec i/io 000 de cm^ d'une culture de Bactcriophag'e (souche extrêmement active).

Après 1/2 h. (Trouble comme au début). Aspect normal d'une culture de Shiga.

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Après I h. (Trouble comme au début). Rares bacilles prenant mal la couleur. Tous les bacilles sont de taille normale.

Après 2 b. (Trouble égal à deux fois ce qu'il était au début». Le fond de la préparation est chargé de débris informes. Tous les bacilles ont une coloration normale. Très nombreux bacilles (2 sur 3 environ) ayant jusqu'à quatre fois la longueur des bacilles normaux ayant servi à préparer Témulsion^ avec tous les intermédiaires Formes ovales ou sphériques relativement nombreuses mais toutefois bien inférieures en nombre à ce que ferait supposer l'examen comparatif à l'ultramicroscope : ces formes sont d'ailleurs extrêmement fragiles et beaucoup doivent se détruire pendant l'étalement sur lame; pour les voir sur préparations colorées l'étalement doit être fait avec très grand soin.

Après 3 h. (louche léger), tout le fond de la préparation est chargé de fins débris sans formes définies, avec, de place en place, de gros amas informes et de nombreuses granulations semblables à celles que Ton découvre dans les vieilles cultures de Shiga normal. Une seule forme sphérique vue après une dizaine de minutes de recherches. Une douzaine de grands bacilles bien colorés par champs.

Après 4 h. (Très léger louche^ Vne douzaine de bacilles mal colorés par champs. Le fond est semblable à celui de la préparation faite après 3 h. : aucun corps sphérique.

Après 5 h. (Presque limpide). Le fond est déjà moins chargé. Un bacille mal coloré par chana|)s. ^

Après 6 h. (Limpide). Le fond est bien moins chargé de débris On ne voit qu'un bacille mal coloré par 25 champs en moyenne.

Après 18 h. Rien de visible sur la préparation.

Comme on le voit Taspect de la préparation diffère peu de ce que nous avons vu dans le cas précédent ; il convient seulement de signaler que les bacilles qui se cultivent au début, avant que Faction des germes bactériophages se fasse sentir, présentent des formes anormalement grandes.

A Tultramicroscope Taspect a été à peu près semblable dans les deux cas : dans le dernier, où Tinoculation avait été faite avec une souche de Bactériophage anti-SHiGA extrêmement active, entre 2 h. et 3 h., moment où la lyse se faisait avec une grande intensité, les formes sphériques étaient particulièrement nombreuses : 2 à 3 par champs, et les éclatements faciles à observer ; la lyse une fois terminée, les plus minutieuses recherches ne permettent plus d'en découvrir.

C'est ici le cas de rappeler l'observation que j'ai déjà faite et qui s'adresse à ceux qui voudront expérimenter : quand il s'agît d'une action diastasique simple toutes les expériences faites dans des conditions identiques se déroulent suivant un rythme identique; tel