SIXIEME LEÇON

Morphologie et biologie au bacillus anthracis.

Sommaire. Etude de la bactéridie dans ses trois formes essentielles : forme bacillaire, filamenteuse et sporulaire. — Dans le corps des animaux la bactéridie n'existe qu*à l'état bacillaire.

— Description du bacille : c'est une collule végétale» — Emploi des méthodes de coloration. — Etat filamenteux. — Méthodes de culture. — Aspect des cultures dans les milieux liquides et solides. — Spores. — Leur disposition dans le filament. — Leur mode de germination. — Différences morphologiques du bacillus anthracis et du bacillus subtilis.

Biologie du bacillus anthracis. — Différences de ses conditions de vie, selon qu'il est à l'état de bacille ou de spore. — Résistance différente, sous ces deux formes, à l'inanition, la dessication, l'absence d'oxygène, l'élévation de la température .

— Action de la lumière solaire.

Messieurs, La bactéridie du charbon (Dav.), bacillus anthracis (Cohn) est un schizomycète gui, dans la classification de Cohn, rentre dans la famille des Desmobactéries et dans le genre Bacille. Comme nous venons de le voir, et comme nous allons le montrer avec plus de détails, le bacillus anthracis est un organisme polymorphe dont Taspect, le mode de croissance et de reproduction aussi bien que les propriétés physiologiques et Faction pathogène varient selon diverses conditions, dont quelquesunes du moins sont bien connues. Au point de vue descriptif, on peut lui assigner trois formes distinctes : la forme bacillaire, la forme filamenteuse et la forme sporulaire. C'est sous ces trois formes que nous allons l'étudier, tout en faisant remarquer que cette division, commode au point de vue didactique, n'a rien d'absolu, en ce sens qu'il s'agit là d'une succession continue d'états évolutifs dont cette division marque simplement les étapes principales.

A. Etat bacillaire. C'est sous cet état que la bactéridie apparaît toujours dans le corps des animaux atteints de charbon, c'est sous cette forme qu'elle a été découverte et décrite tout d'abord, o*est aussi celle qui, pour nous, est la plus intéressante, puisque c'est toujours à cet état que s'exerce son action pathogène sur les animaux et sur l'homme. Qu'on prélève sur un animal qui vient de succomber au charbon, une goutte très petite de sang^ qu'on l'étalé en couche mince sous la lamelle et qu'on examine à un grossissement convenable^ et l'on aura sous les yeux le spectacle saisissant^ si bien décrit en quelques mots par M. Pasteur : « des globules rouges, plus ou moins agglutinés, coulant comme une gelée un peu fluide, des globules blancs en nombre plus grand que dans le sang normal et des bâtonnets qui nagent dans le sérum limpide ». Ces bâtonnets sont droits, flexibles, cylindriques, immobiles, homogènes, transparents comme du verre. Les uns paraissent constituer un bâtonnet unique, les autres sont formés de deux ou trois articles (rarement davantage) placés bout à bout, séparés par une scissure nette, l'adhérence des segments contigus ne se faisant plus que d'une façon lâche et souvent par un des angles seulement. L'épaisseur des bâtonnets est d'environ 1 à 1,25 f*; la longueur est très variable, entre 5 et 20/*. Tel est l'aspect que présente le bacillus anthracis, examiné dans le sang ou dans les produits charbonneux frais, sans autre mode de préparation.

Si l'on traite la préparation par l'acide acétique concentré, on voit les globules rouges et blancs pâlir et disparaître, les bacilles au contraire persister avec plus de netteté ; ils résistent de même à l'action de la potasse caustique, de l'acide chlorhydrique, sulfurique, etc., et c'est en se basant sur ce caractère que PoUender déjà et Delafond avaient admis leur nature végétale.

La méthode de coloration à l'aide des couleurs basi-

-Tiques d'aniline a beaucoup facilite la recherche et l'étude des bacilles dans les liquides et dans les tissus oharhonneuic Ces colorations se pratiquent soit sur des produits charbonneux étalés sur une lamelle (Koch) soitsur des coupes d'organes (Weigert).

Dans le premier cas, on étale en couche très mino« sur une lamelle à couvrir, du sang ou d'autres liquides charbonneux, ou on frotte à la surface de la lamelle une parcelle très petite de tissu ; on laisse sécher à l'air, puis on fixe et on coagule la mince couche albumineuse ainsi obtenue (pour l'empêcher de se redissoudre dans le liquide colorant) en plaçant la lamelle àî'étuveà 115* pendant plusieurs heures^ou plus commodément, en la passant, la face enduite tournée en haut, trois fois, assez lentement, à travers la flamme d'une lampe à alcool. La lamelle est ensuite mise flotter, la face enduite dirigée en bas, dans une solution aqueuse, de concentration moyenne,de couleur basique d'aniline (violet de méthyle, fuchsine, bleude méthylène, etc.). Au bout de quelques minutes, la coloration est suffisante, on lave la lamelle à l'eau distillée et, pour la simple orientation, on peut examiner directement dans l'eau. Si l'on veut conserver la préparation, on la passe rapidement à l'alcool absolu, on l'éclaircit par l'essence de clou de girofle et l'on monte dans le baume. Pour l'étude des détails, on se servira d'un objectif à immersion homogène, avec éclairage Abbé et miroir plan, sans diaphragme.

Les coupes fines d'organes charbonneux, pratiquées sur des pièces durcies par l'alcool absolu, se colorent très bien par la simple méthode de Weigert ainsi que par celle do Gram. On obtient des préparations très élégantes par la méthode de la double coloration do Weigert (1).

Il) Pour les détailBà ce sujet, consulter; Koch, Verfahren zur Unlersuckvng der Bactérien {Beilràge zur Biol. der Pflanzen, m. II, 1877. p. aUO) et Mittheilungen aus dem kais. Oesundheil''amlo,M. 1, 1881, p. 3. —Weigert: Zur .Technik dermi-

Si l'on traite par ces procédés des préparations do filaments contenant des spores, celles-ci demeurent incolores dans l'intérieur du filament coloré ; mais récemment on a réussi à colorer aussi les spores, soit isolément, soit eii même temps que les filaments, par une double coloration. Pour colorer les spores seules, on procède de la façon suivante : une parcelle de la culture est étalée et séchée sur une lamelle ; puis on soumet la lamelle pendant près d'une heure à une température d'environ 200', ou bien on la passe à travers la flamme de la lampe à alcool, non pas trois fois seulement, mais une dizaine de fois ; puis on colore, comme d'habitude, par une solution aqueuse de couleur basique d'aniline. A la suite de ce chauffage plus intense, le protoplasma des filaments est altéré au point de ne plus fixer la matière colorante ; les spores au contraire, et elles seulement, se colorent. Il est probable que la température élevée a modifié la structure de l'enveloppe delà spore et a triomphé de la résistance qu'elle oppose à la pénétration de la matière colorante (H. Buchner, Hueppe). La double coloration des spores et du filament s'obtient, ainsi que l'a montré Neisser, à l'aide du procédé d'Ehrlich pour la coloration du bacille delà tuberculose : la lamelle (passée trois fois à travers la flamme) est mise dans une solution chaude de fuchsine dissoute dans l'eau d'aniline (liquide d'Ehrlich) ; on décolore par l'acide nitrique au tiers ou par l'alcool absolu, on lave à l'eau, puis on colore à nouveau rapidement dans une solution de bleu de méthylène ; les spores apparaissent alors colorées en rouge dans l'intérieur du filament coloré en bleu (1).

croscopischcn Bacterien-Untersuchungen {Virchow's Arch. 1881, Bd. 84, p. 275). — Malassez. Coloration des bactéries par le violet de méthyle. {Gaz, méd. de Paris, 1881, p. 758). — Cornil et Babôs. Les Bactéries, Paris, 1885, p. 64 et suiv.,et p. 492 et suiv.

(1) Voir Hueppe. Die Methoden der Bacterien-Forschung, ^'•édit. 1885, p. 56.

Grâce à ces divers artifices de préparation, on a pénétré plus avant dans la connaissance de la morphologie du bacillus anthracis. On peut, aujourd'hui, avec la plupart des botanistes, considérer les bacilles comme étant des cellules végétales, qui s'accroissent, se divisent et se multiplient comme elles. La cellule bacillaire (Bacterienzelle) est formée par un corps protoplasmiquo homogène, transparent, de nature probablement albumineuse (albumine et nucléine), qui se colore en jaune ou en brun par la teinture d'iode et offre une grande avidité pour le carmin et les couleurs dérivées de Taniline. Autour de cette masse protoplasmique existe une membrane (membrane cellulaire) que rend surtout apparente remploi de certains réactifs, la teinture d4o de, notamment, qui colorent et rétractent le protoplasma sans agir de même sur l'enveloppe. Cette enveloppe n'est sans doute que la couche interne, plus dense, d'une atmosphère gélatineuse qui entoure le protoplasma. La cellule bacillaire, arrivée à une certaine longueur, se divise par segmentation en deux cellulesfilles. Cette segmentation s'accuse par l'apparition d'une fine ligne transversale qui souvent, à son début, est tellement mince qu'elle échappe facilement à l'observation et n'apparaît qu'avec l'emploi des réactifs appropriés.

Dans le sang et dans les tissus des animaux atteints de charbon, ce mode de reproduction est le seul que l'on observe. La forme filamenteuse et, a /b?'tîori, les spores ne sedéveloppentjamaisdansces conditions et les assertions de ceux qui décrivent des spores dans le sang ou dans les organes d'animaux charbonneux ne reposent que sur des erreurs d'observation.

Les dimensions des bacilles, tant en épaisseur qu'en longueur, sont un peu variables selon les diverses espèces animales atteintes de charbon. Ainsi, selon M. Huber, les bacilles seraient plus courts chez le bœuf, plus longs chez le cobaye, plus longs encore chez la

souris (1). Il m'a semblé, sans cependant que j'aie pratiqué de mensurations, que les bactéridies étaient plus courtes chez l'homme que chez les rongeurs.

Du reste, chez le même animal atteint de charbon, la longueur des bacilles peut varier selon le siège des lésions qu'on examine, ou bien selon d'autres circonstances. Ainsi chez les rongeurs (lapins, cobayes) inoculés sous la peau avec du virus charbonneux, les bacilles que l'on rencontre au lieu même de l'inoculation, dans l'œdème gélatiniforme sous-cutané qui s'y développe, sont souvent beaucoup plus longs que ceux que l'on rencontre dans le sang. Il est probable que dans ce dernier liquide, en vertu du mouvement dont il est animé, les bacilles en voie de végétation sont plus rapidement divisés en segments indépendants les uns des autres.

De même, sur des cobayes inoculés avec du virus atténué (vaccins de Pasteur), qui succombaient à l'inoculation, mais au bout d'un temps plus long que s'ils avaient été inoculés avec le charbon virulent (au bout de 4 à 5 jours, au lieu de 36 à 48 heures), nous avons constaté, M. Roux et moi, en pratiquant des coupes sur les divers organes, le rein, le foie, le poumon, que les capillaires de ces organes étaient souvent remplis de bacilles extrêmement longs; il semble que dans ces cas les bacilles manifestent une certaine tendance à se comporter comme ils le font quand on les cultive dans un milieu inerte et ébauchent la forme filamenteuse. MM. Koch, Gaffky et Lôffler ont fait la même constatation sur des souris inoculées avec des cultures atté^ nuées,

B. Etat filamenteux (mycélium). La bactérîdîe présente ce mode de croissance en dehors de l'économie

(1) Huber (K.)- Experimentelle Studien ûher Milzbrand. (Deutsche med. Wochens. 4881, p. 89).

vivante, lorsqu'elle est placée dans un milieu nutritif approprié, liquide ou solide, à une certaine tempéra^ ture et en présence de Toxygène de l'air. Pour l'étudier à cet état, il est donc nécessaire de pratiquer ce qu'on appelle des cultures. Nous avons dit que Delafond est le premier qui ait tenté la culture de la bactéridie en dehors de Torganismeet qu'ilavu se produire rallongement des bacilles dans le sang retiré des animaux char** bonneux et conservé dans des vases de verre à une température convenable. Mais c'est M. Koch qui a observé le premier l'évolution complète de la bactéridie, en l'ensemençant dans des liquides propres à la nourrir. Il a pu ainsi faire des cultures successives et découvrir la formation de la spore. M. Koch cultivait la bactéridie dans des gouttelettes de l'humeur aqueuse de Tœil du bœuf ou de sérum frais du sang, gouttelettes suspendues à la face inférieure de la lame à couvrir, et il pouvait ainsi suivre au microscope la croissance, la spo-> ruiation et la germination de la bactéridie.

M. Pasteur a appliqué à l'étude de la bactéridie les puissantes et rigoureuses méthodes qu'il avait créées dans ses travaux sur les fermentations. De même qu'il avait cultivé la levure de bière, le ferment lactique, le ferment butyrique, à l'état de pureté, dans des liquides purs et appropriés à la vie de chacun de ces êtres, il fît végéter la bactéridie du charbon, d'abord dans le liquide minéral qui porte son nom, puis dans l'urine stérilisée et rendue légèrement alcaline et il put ainsi en préparer des quantités aussi grandes qu'on pouvait désirer. Un des milieux les plus favorables à la culture de la bactéridie, et qui est couramment employé, est le bouillon de veau ou de bœuf rendu légèrement alcalin.

Dans un ballon stérilisé contenant du bouillon ainsi préparé, nous portons avec pureté, à l'aide d'un fil de platine ou d'un tube de verre étiré, une gouttelette de sang pris dans le cœur d'un animal qui vient de

succomber au charbon ; la quantité de sang ainsi apportée dans le liquide est si petite qu'elle n'en trouble en rien la limpidité. Puis on met le vase à l'étuve à la température de 30 à 35". Au bout de quelques heures on voit des flo(îons ténus nager dans le liquide; ces flocons grossissent et conservent une certaine cohésion, de sorte qu'ils résistent à une légère agitation imprimée au liquide qui reste limpide dans leur intervalle. Dans les heures suivantes, ces flocons deviennent assez volumineux pour former comme un nuage au sein du liquide. Cet aspect floconneux de la culture de la bactéridie dans le bouillon est caractéristique.

Si avec une pipette on transporte sur le porte-objet un des flocons de la culture et qu'on l'examine au microscope, on voit qu'il est formé de filaments extrêmement longs, cylindriques, non ramifiés, onduleux, tordus quelquefois les uns sur les autres ou enchevêtrés comme des paquets de corde (^gr. 2, Â). Examinés à l'état frais, ces filaments paraissent homogènes dans toute leur longueur, sans trace de séparation transversale, sauf les points où il existe des ruptures. Mais si Ton fait des préparations colorées, on constate que ces filaments sont formés par une gaine hyaline délicate, renfermant une rangée de masses protoplasmiques, cubiques ou allongées ; celles-ci sont séparées les unes des autres par des cloisons transversales et chacune d'elles représente une cellule végétative. En même temps que s'effectue ce travail de croissance par allongement et segmentation transversale, on voit apparaître dans l'intérieur des cellules végétatives les organes de reproduction proprement dits, les spores. Après quelques jours de séjour à l'étuve, le bouillon dans lequel a poussé la bactéridie a légèrement bruni et est redevenu limpide, et sur le fond du vase s'est déposée une fine poussière qui se soulève quand on agite le liquide. A l'examen microscopique de ce dépôt, on ne trouve plus les longs filaments dont il ne reste que des fragments pâlis. Ils ont fait place à des

spores nombreuses, réfringentes, les unes libres et animées de mouvement brownien, les autres encore alignées à la file et dessinant le filament qui leur a donné naissance.

On sait qu'un bacille banal, non pathogène, extrêmement répandu dans la nature, le bacillus subtilis (bacille de l'infusion de foin) présente avec le baoillus anthracîs d'étroites analogies morphologiques et biologiques. Néanmoins, il est très facile de les distinguer par l'aspect des cultures dans le bouillon. Si, dans les mêmes conditions qui viennent d'être dites, on sème le bacillus subtilis, on voit le liquide se troubler dans sa totalité au bout de quelques heures, puis présenter à sa surface un voile sec, qui peu à peu s'épaissit et devient rugueux. Le microscope nous montre que, dans le liquide trouble, nagent des bacilles mobiles, isolés, et que le voile est formé d'un feutrage serré de filaments devenus immobiles et qui bientôt montrent des spores dans leur intérieur. Plus tard, le voile se désagrège, les spores tombent au fond du vase et le liquide s'éclaircit.

La culture de la bactéridie charbonneuse dans iesmilieiLX solides a aussi un aspect particulier. Piquons , comme le ffiit M. Koch, un tube do gélatine nutritive bien transparente avec un fil de platine portant à son extrémité un peu de sang charbonneux et mettons ce tube à la température ordinaire du laboratoire. Au bout d'un jour, on verra la gélatine se fluidifier à la partie supérieure et de haut en bas, en même temps qu'il s'y forme des flocons blancs, d'où partent presque toujours de fins filaments enchevêtrés et ramifiés qni donnent à la culture une apparence arborescente. Toutefois, cet aspect de la culture n'est pas constant et dans certains cas, quand la végétation est ralentie, l'aspect arborescent lait défaut et la gélatine fluidifiée renferme des flocons blanchâtres, arrondis, grumeleux. Le baciUus subtibs, cultivé dans les mêmes conditions, fluî-

difie également la gélatine, mais beaucoup plus rapidement et la culture n'a pas l'aspect rameux.

Cultivée dans de la gélatine étalée en couche mince sur une plaque de verre {cultures sur plaques de M.Koch) la bactéridie charbonneuse se développe sous forme de colonies arrondies qui, examinées à un faible grossissement, présentent au centre un aspect filamenteux, enchevêtré ; à la périphérie de la colonie ces filaments sont assez régulièrement onduleux.

Semée sur l'agar-agar, la bactéridie ne le fluidifie pas et forme une croûte sèche, facile à enlever. Cultivée sur une section pure de pomme de terre cuite, la bactéridie forme des colonies sèches, blanches, qui restent circonscrites aux points d'inoculation.

C. Spores du bacillus anthracis. La formation des spores débute par l'apparition d'une granulation très petite dans l'intérieur du protoplasma de la cellule végétative. Graduellement cette granulaticm augmente de volume et apparaît bientôt comme un corps allongé, ovoïde, fortement réfringent qui atteint son complet développement au bout de quelques heures et représente alors la spore parfaite {fig. 2 B). Cette spore est toujours plus petite que la cellule-mère. Autour d'elle, le protoplasma de la cellule disparaît graduellement et il arrive un moment où il ne reste plus que la membrane mince de la cellule-mère, dans Tintérieur transparent de laquelle la spore apparaît comme suspendue. Une cellulemèro ne donne jamais naissance, dans son intérieur, à plus d'une seule spore.

Toutes les cellules végétatives du filament ne donnent pas naissance à des spores, et celles-ci n'apparaissent pas simultanément dans les différentes cellules du filament. Un certain nombre de segments demeurent stériles, leur protoplasma subit une désintégration graduelle, la membrane d enveloppe seule continuant à persister pondant quelque temps, comme une gaine vide.

D'autres fois, dans des cultures un peu anciennes, on voit un certain nombre de segments du filament se gonfler, sous forme de renflements globulaires, ou fusiformes, ou irrégulièrement arrondis, donnant au filament l'aspect d'un chapelet à grains^ ou d'une torula.

Fig, 2. ~ A. a, filament mvcélien du bacillus anthracis dans une culture récente. — 8, spore libre. — o, spore en voie de germination. • c, bacilles adultes.

B. Filament mycélien du bacillus anthracis dans une culture plus âgée ; une portion des filaments renferme des spores ; en haut deux spores libres.

C. Bacillus subtilis.— 1, Fragment de filament renfermant des spores. 2, Début de la germination de la spore. 3, Le bacille naissant émerge perpendiculairement au grand axe de la spore. A, Les deux extrémités du bacille naissant restent engagées dans l'ouverture de l'enveloppe, d'où un aspect en fer-à-cheval; bientôt une des extrémités se dégage. 5, Les deux extrémités restent engagées pendant que l'anse émergée continue à se développer en forme de fer à cheval. (D'après M. de Bary.)

Les botanistes s'accordent généralement à regarder ces formes comme Tindice d'un état de régression et de mort des cellules végétatives; ce seraient des formes d'involution. Il y a longtemps que M. Pasteur a signalé la présence de ces images, en forme de fuseaux ou de

poires, ou de boules dans les cultures un peu anciennes, surtout lorsque les conditions ne sont pas très favorables, comme cela se présente par exemple dans les cultures faites à de basses températures (16 à 18*); mais pour lui, ainsi que pour M. de Bary, il n'est pas prouvé qu'elles témoignent de la mort ni de la perte de virulence de ces éléments.

On a beaucoup discuté sur les causes qui font qu'à un moment donné la bactéridie cesse de s'accroître par allongement filamenteux et division successive et affecte un autre mode de reproduction, celui de germes durables ou spores. L'opinion la plus généralement acceptée est celle qui attribue l'apparition des spores dans le filament à un commencement d'appauvrissement, d'épuisement du milieu nutritif dans lequel ces filaments végètent. Mais les spores apparaissent dans les cultures longtemps avant que cet épuisement ne se soit effectué, ce dont on peut s'assurer en y faisant de nouveaux ensemencements du même organisme qui se montreront féconds et affecteront le développement filamenteux, puis sporulaire, comme le premier ensemencement. Il faut reconnaître que la vraie cause du phénomène nous échappe encore.

Les spores une fois formées et « mûres i», si le milieu nutritif n'est pas épuisé, si Toxygène ne fait pas défaut et si la température est favorable, on assiste à un nouvel acte qui aboutit à la transformation de la spore en une nouvelle cellule végétative, en un nouveau bacille. C'est la germination. Elle est précédée de la disparition do la membrane de la cellule* mère et par la mise en liberté complète des spores.

Nous avons vu (Leçon V) comment M. Koch a décrit le phénomène de la germination. Pour lui, la spore brillante est entourée d'une masse transparente comme du verre qui serait proprement le protoplasma, la portion centrale, réfringente de la spore n'étant au contraire

qu'une gouttelette huileuse, une sorte de réserve alimentaire. L'enveloppe protoplasmique s'étirerait dans lé sens du grand axe de la spore, de pyriforme deviendrait cylindrique et finalement arriverait à la forme de bâtonnet, pendant que la portion brillante demeurée à l'un des pôles disparaîtrait graduellement.

Il faut renoncer à cette description. Déjà M. Klein avait objecté que si l'enveloppe extérieure de la spore était de nature protoplasmique, on s'expliquerait diffi-* cilement le pouvoir de résistance de la spore à l'élévation de température, par exemple ; ce fait, entre autres» tendrait plutôt à faire supposer que la partie vivante du germe est centrale et protégée extérieurement par une enveloppe. Les recherches de Prazmowski et de Brefeld ont montré qu'il en est, en effet, ainsi et que la portion centrale, réfringente de la spore, est bien le protoplasma, entouré d'une membrane très fine, mais résistante. Ce que M. Koch décrivait comme un manteau extérieur de protoplasma ne serait autre chose qu'une couohe gélatineuse, qui, loin de s'accroître et de s'allonger lors de la germination, disparaîtrait à ce moment.

En réalité, la germination s'effectue de la façon suivante : la spore augmente de volume et perd de sa réfringence ; puis, à l'un des pôles du grand axe, apparaît une intumescence qui indique l'émergence du bacille naissant. La membrane d*enveloppe de la spore subit à ce niveau une déchirure ou une déhiscence par où le protoplasma fait issue. Cette déchirure, qui est très nette sur un certain nombre d'autres bacilles, n'est pas visible, selon M. de Bary, sur la spore du bacillus anthracis dont la germination s'effectue sans éclatement apparent ni soulèvement de la membrane d'enveloppe. Il est probable que celle-ci subit, dès le début de la germination, une résorption ou une dissolution rapide, d'où l'impossibilité d'en apercevoir ni la rupture ni même les vestiges. Le protoplasma mis en liberté con-

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tinue sa croissance, s'allonge et prend finalement la< forme d'un bacille (1).

Diaprés v. Frisch et Ppazmowski^ ces bacilles nais» sants seraient souvent animés d'un mouvement actif, mais lourd et peu accusé. M. Toussaint a fait la même constatation: « les bactéridies, dit-il, provenant de spores possèdent, lorsqu'elles commencent à paraître, de légers mouvements par lesquels elles peuvent changer leurs rapports, mais de très peu; lorsqu'on examine un groupe de trois ou quatre spores rassemblées à petite distance, on les voit s'écarter ou se rapprocher les unes des autres par des mouvements lents d'oscillation et dans des liquides tout à fait immobiles. Les mouvements cessent complètement aussitôt que la bactéridie a acquis assez de longueur pour se segmenter (2).

-r- Cette étude morphologique du baoillus anthracis gagne à être complétée par quelques notions sur la mor* phologie du bsLcill'US subtilis qui offre avec lui tant d'analogies apparentes. Le parallèle est instructif, non seulement pour éviter une confusion qui sans cela serait facile, mais encore pour juger plus tard en complète connaissance de cause les faits avancés par M. Buchner, d'après lequel ces deux bacilles ne seraient que deux états différents d'adaptation d'un seul et même organisme,

Le bacillus subtilis est un peu plus grêle que le ba? cille du charbon ; il est mobile ; ses extrémités, au lieu d'être coupées à section nette, sont un peu arrondies ; enfin il est armé à ses deux extrémités d'un flagellum ou cil extrêmement fin, mais qui n'est pas dû à une illusion d'optique puisqu'il se retrouve sur les photogrammes. Les spores contenues dans le filament spo?

(1) Consulter à ce sujet : De Bary : Vorlesungen ûber BaotC" rien, 1885, p. 16; et Hueppe :Die Formen der Bactérien, Wiesbaden, 1886, p. 135-138.

(2) Toussaint. Recherches sur la maladie charbonneuse, 1879, p. 53.

rigèro débordent un peu la membrane de la cellulemère (^g. 2, (J), étant plus larges qu'elle, tandis que les spores du baciîlus antbracis y sont ne|;tement inscrites [fig, 2, B). Enfin , les deux bacilles présentent une différence fondamentale quant au mode de germination de la spore. Nous avons vu que, pour le baciîlus antbracis, lo développement se fait dans le sens du grand axe de la sporp (fig. 2, A, b); pour le bacillussubj;ilis,ilse fait au contraire dans le sens équatorial. Le filament protoplasmique s'échappe par une ouverture de la membrane siégeant à l'extrémité du petit axe de la spore ; la figure représente les différentes façons dont peut s'effectuer ce mode de dégagement du jeune bacille d'avec l'enveloppe de la spore. Le plus souvent, il émerge librement, dans une direction franchement perpendiculaire au grand axe de la spore {fig. 2, C, 3); d'autres fois, il est retenu dans la fente de l'enveloppe par ses deux extrémités et la portion moyenne du bacille s'échappe de l'ouverture en présentant une forme d'anse ou de fer achevai (fig, 2, C, 4). Dans ces cas, tantôt une des extrémités finit par se dégager ; d'autres fois, les deux extrémités demeurent fixées dans la fente delà membrane, le bacille continuant à croître avec sa forme en fer à cheval et arrivant même à se di-? viser ainsi en deux bacilles (fig. 2, 0, 5). On voit donc, qu'au point de vue de la germination surtout, il existe, malgré leurs analogies apparentes, entre le baciîlus antbracis et le baciîlus subtilis, des différences profondes.

Biologie du bsicillus anthraeis. — Les notions qui précèdent doivept être complétées par l'exposé succinct de ce que nous savons d'essentiel sur les conditions de vie et de développement du baciîlus antbracis et sur les différences profondes qui existent, à cet égard ^ entre la forme adulte, végétative du microbe, et sa forme sporulaire ou de fructification : c'est sur ces notions que repose rétiologie exacte du charbon.

Le bacillus anthracis a ce point de commun avec tous les schizomycètes et, d'une façon plus générale, avec tous les végétaux privés de chlorophylle, qu'il ne possède pas le pouvoir qu'ont les cellules chlorophylliennes de puiser directement dans l'acide carbonique de Pair ou du sol les éléments nécessaires à leur nutrition. Ainsi qu'aux animaux et aux champignons, il lui faut, pour vivre et se développer, des matériaux organiques tout préparés, des combinaisons hydrooarbonées et azotées. Ces matériaux, la bactéridie les trouve dans les humeurs ou les tissus des animaux sur lesquels elle vit en parasite, ou bien quand elle se développe en dehors de Torganisme animal, elle les puise dans les produits morts d'origine animale ou végétale (sang, urine, débris de tissus animaux ou végétaux morts).

La réaction chimique de ces matériaux nutritifs n'est pas indifférente : la bactéridie vit et végète surtout dans les milieux neutres ou faiblement alcalins ; elle vit péniblement ou périt dans les milieux acides.

Un certain degré d'humidité du milieu ambiant est également nécessaire à la vie de la bactéridie ; elle périt en peu de temps si on la soumet à une dessication rapide.

Une autre condition indispensable à la vie de la bactéridie adulte est la présence d'oxygène libre (ou faiblement lié, comme dans le sang des animaux) ; en un mot, c'est un type d'organisme aérobie» M. Koch a montré que, cultivée dans le sang, elle réduit complètement l'hémoglobine et que son développement cesse dès que la réduction est complète. D'après M. Pasteur, elle absorbe dans les liquides de culture jusqu'aux dernières portions d'oxygène en dégageant un volume d'acide carbonique sensiblement supérieur.

La soustraction d'oxygène, pour peu qu'elle se prolonge, empêche non seulement la croissance et la multiplication, mais encore la vie de la bactéridie ; c'est ce que prouve rexpérience déjà ancienne de Davaine, qui

constata que du sang charbonneux, renfermé dans un tube de verre scellé, perd toute virulence au bout de quelques jours. C'est pour cette raison aussi que le sang recueilli dans le cadavre inta,ct d'un animal charbonneux, plusieurs jours après la mort, n'est plus virulent et ne contient que des bactéridies en voie de désintégration granuleuse ; elles sont mortes après avoir épuisé toute la réserve d'oxygène du sang.

Les choses se passent tout autrement pour la. spore, arrivée à maturation. Comme toutes les graines, elle renferme dans son intérieur les aliments nécessaires à sa vie latente de germe et elle peut subsister pendant des mois et des années dans des milieux entièrement privés de matériaux nutritifs, à la surface des objets, dans le sable, dans l'eau, etc. Elle résiste de même à la soustraction de liquides, à la dessication et à l'absence d'oxygène. On peut donc dire que, dans la spore, la nutrition ainsi que la respiration sont, pour ainsi dire, suspendues. Ainsi s'explique i le long sommeil du germe morbide » et dans certaines circonstances sa résistance aux causes en apparence les plus destructives (1).

(1) M. Duclaux a eu occasion d'étudier les spores de divers microbes ayant servi en 1859 et 1860 aux célèbres recherches de H. Pasteur sur la génération spontanée, conservées dans leur liquide de culture, en vaac dos, et par conséquent presque entièrement soustraites à l'air, depuis cette époque. « J'en ai trouvé de vivantes, dit-il, après un quart de siècle, et dont le rajeunissement n'était pas plus long que si elles dataient de la veille. Bien ne tait supposer qu'elles aient été atteintes en quoi que ce soit par ce long assoupissement, et il semble qu'on devra les trouver encore, après un nouveau quart de siècle, ce qu'elles sont aujourd'hui (Le microbe et fa maladie, Paris 1886, p. 32). M. Duclaux, il est vrai, ajoute que ce mode de conservation des spores, dans un liquide à l'abri de l'air, est rare dans la nature, où la spore est surtout exposée i. se dessécher et k être emportée par le vent. Dans ces conditions, il est douteux qu'il puisse rester une spore vivante après 20 ans. « J'ai opéré, dit-il, sur des bourres de coton ayant cet &ge, chargées de raillions de germes puisés dans l'air depuis 20 ans. Tous ces germes, conservés depuis jk la lumière diffuse,

L'influence de la température est Importante à cotinaître et différente aussi selon qu'elle s'exerce sur la bactéridie ou sur ses spores. Nous avons vu plus haut (leçon V) que la température la plus favorable à là végétation des filaments et à Tapparition des spores est d'envilron 35* : déjà au bout de 20 heures les spores sont tlombrelises et complètëttient formées ; à 30% il faut 30 heures 5 à 18 ou 20°, il leur faut deux à trois jours. Aune température inférieure à IS'* la formation des spores cesse; au-dessous de 12*^ le développement filamenteux s'arrête également. A 45* toute végétation filamenteuse cesse; à 42 ou 43'*, dans lo bouillon neutre de poule, la bactéridie se cultive encore abondamment, mais sans formation de spores (Pasteur). Nous verrons plus tard comment cette dernière particularité a été utilisée pour l'atténuation dU virus charbonneux.

L'action d'une température de 50* et au delà sUr des liquides contenant des bactéridies adulte^ amène promptement leUi^ mort. Davaine, déjà, aVait montré que du igang charbonneux fortement dilué atee de Peau perd sa virulence s'il est soumis à une température de 55** pendant 5 minutes, à une température de 48" pendant un quart d'heure et à une température de 50° pendaht 10 tnihutes. Du sang charbonneux non dilué perd sa virulence par une température de 51® pendant un qUart d'heure (1). M. Toussaint et M. Chauveau ont étudié avec une grande précision l'action du a chauffage » sur la vie, la végétabilité et la virulence de la bactéridie et nous y reviendrons quand nous parlerons de l'atténuation.

dans les conditions. 4^ la poussière de nos appalHements, se sont nloritos stériles ». Mais il ti'est pas nécessaii*e d'unfe J)fersistancë de vie Aussi extrême polit* justifier la qualificdtiôh de forme durable (tiauerspore) appliquée à la spore.

(1) Davaine. Recherches relatives à VAction dé là chaleur sut le Intrus charbonneux (G. R, de VÀcadémie des sciences, 1873, l. LXXVII, p. 720).

La baotéridie résiste beaucoup mieux à rabaissement qu'à rélévation de la température. C'est ainsi tjue Mi V. Frisch a soumis, pendant près d'une heure, du sang cliarbonneux à une tefnpératiu'e de — * 110® obtenue à l'aide de Tacide carbonique liquide, sans lui voir perdre sa Virulehce ni la faculté de se cultivet dans les milieux appropriés (1).

MM. Pasteur et Joubert ont bieti mis en lumière la différence de résistance de la bactéridie aux diverses causes de destruction, suivant qu'on la considère dans sa forme bacillaire ou dans celle de « corpuscule-germes » ou de spores. Ils ontmohtré que, tandis qu'une température bien inférieure à 100" suffit pour tuer la bactéridie, les spores résistent à la température de l'eau bouillante; desséchées, dlles supportent des températures de 120 à 130» (2).

D'après M. Brefeld il faut une ébullition de 2 heures de durée pour détruire toutes les spores d'uti liquide de culture ; placées dans ce liquide à une tertipérature de 105® elles y résistent pendant près d'un quart d'heure; à 107° elles meurent au bout de 10 minutes. M. Perroncito a fait des constatations analogues (3).

Si Ton fait agir, à Texemplé de MM. Pasteur et Joubert, de l'alcool absolu sur du sang charbonneux (contenant des bacilles sans spores) on constate que les bactéridies contenues dans le coagulum ont perdu toute virulence et sont mortes. La même opération, appliquée aux spores, conserve à celles-ci leur aspect, leur virulence et leur faculté de développement dans les liquides

(1) Frisch (A). Ueber das Verhalten der Milzbrandbacillen gegen extrême niedere Temperaturen (Sitzimgsb. der k. Akad. der Wissensch. 1879, Bd. 80, p. 79).

(2) Pasteur et Joubert. Etiude sur la maladie charbonneuse (C. R. Acad. des sciences, 1877, t. LXXXIV, p. 900); Charbon et septicémie (Ibid. t. LXXXV, p, 101).

(3) Perroncito. Sur la ténacité de vie du virus charbonneux dans ses formes de corpuscules-germes et de bacillus {Arch, italiennes de ÏSiol.y t. II, p. 231 et t. lll, p. 321).

nutritifs. De même, M. Brefeld a pu conserver les spores du bacillus anthracis dans Téther pendant des semaines et les faire bouillir dans ce liquide sans qu'elles subissent de modification.

L'influence de la lumière solaire sur la bactéridie et ses spores a été récemment l'objet de fort intéressantes recherches deM.Ârloing.M. Duclaux^l'un des premiers, avait appelé Tattention sur le rôle du soleil comme agent destructeur des microbes et de leurs germes ; il montra que cette action est différente, selon qu'elle s'exerce sur les micrococous (dont la plupart, sinon tous, sont privés de spores) ou sur les bacilles sporifères. Les micrococcus exposés, à Vétat sec, au soleil de nos contrées, sont tués au bout de quelques heures ou de quelques jours au plus ; les bacilles sporifères peuvent résister à cette action pendant six semaines à deux mois.

M. Ârloing a fait des recherches analogues sur le bacillus anthracis ; il étudia l'action exercée par le soleil sur cet organisme, non pas à Tétat sec, mais immergé dans un bouillon de culture. Il constata que dans ces conditions les bacilles adultes périssent*plus rapidement qu'à rétat sec et qu'ils meurent au bout de 25 à 30 heures d'insolation. Chose remarquable et en apparence tout à fait paradoxale, les spores fraichement ensemencées dans un bouillon nutritif sont plus rapidement détruites par les rayons solaires que les bacilles adultes ; il sufSt de deux heures d'exposition au soleil de juillet pour les tuer. M. Arloing pense que cette action du soleil s'exerce sur la spore elle-même ; dans ce cas, le phénomène serait tout à fait exceptionnel et la spore de la bactéridie présenterait cette particularité étrange de résister bien plus énergiquement que la bactéridie adulte à tous les agents cosmiques, sauf un : la lumière solaire. L'expérience si intéressante de M. Ârloing peut s'interpréter autrement ; il est possible que les rayons solaires agissent dans ce cas sur la spore en voie de germination, sur le bacille naissant, que l'on peut sup-

poser plus fragile et plus vulnérable que la bactéridie adulte. De nouvelles recherches éclairciront sans doute ce point curieux de la physiologie du bacillus anthracis (1). M. Arloing s'est assuré en outre que cette action destructive n'est pas due exclusivement aux rayons calorifiques ni aux rayons actiniques, non plus qu'à quelques-uns seulement des rayons colorés du spectre solaire ; elle est l'apanage de la lumière solaire blanche, complète (2).

(1) Des expériences que j'ai faites depuis tendent à établir l'exactitude de l'interprétation que je propose : des spores du bacillus anthracis sont semées, les unes dans du bouillon nutritif, les autres dans de l'eau distillée pure et les deux ballons exposés aux rayons d'un vif soleil d'août : les spores placées dans le bouillon sont en effet tuées au bout de deux à trois heures d'exposition ; les spores placées dans l'eau distillée étaient encore vivantes et susceptibles de , végétation après dix heures d'insolation. Dans le premier cas les

spores commencent à végéter dans le bouillon ; l'action des rayons solaires ne s'exerce donc plus sur la spore proprement dite, mais ^

sur celle-ci au début de la germination, sur le bacille naissant ; or celui-ci, comme tous les jeunes êtres, est plus fragile^ non seulement que la graine, mais encore que la cellule adulte, le bacille ; aussi dans ces conditions, la lumière solaire en a rapidement raison.

Dans l'eau distillée, au contraire, les spores ne trouvant aucun aliment demeurent immuables et incapables de végéter ; elles continuent aussi à présenter, à l'égard de la lumière solaire comme des autres agents, la résistance considérable qui est leur attribut essentiel. — (Voir Straus. Note sur V action de la lumière SO" lairesur les spores du Bacillus anthracis (C. R. de la Soc. de Biologie, 1886, p. 473).

(2) Duclaux. Influence de la lumière du soleil sur la vitalité

des germes (C. R. Acad. des sciences, 1885, janv., n? 2, p. 119). ^

— Arloing. influence de la lumière blanche et de ses rayons constituants sur le développement et les propriétés du bacillus • J

anthracis {Arch, de physioL, 1886, p. 920). i