NUMÉRATION DES CELLULES DE LEVURE MORTES

Nous verrons par la suite que l’action des acides halogénés aboutit à la mort de nombreuses cellules de levure et que l’accoutumance n’est qu’une sélection des cellules résistantes parmi une foule d’autres, affaiblies ou mortes.

Nous nous sommes donc souvent trouvés dans la nécessité de déterminer approximativement la proportion entre les cellules mortes et les cellules vivantes. Le procédé classique employé dans ce cas, la coloration par le bleu de méthylène, a été sévèrement critiqué par Fink (192). Suivant cet auteur la coloration par le bleu de méthylène dépend de la réaction et des électrolytes du milieu, facteurs qui modifient la perméabilité de la membrane cellulaire, règlent la pénétration de la matière colorante à l’intérieur de la levure, seule cause de la mort de cette dernière. En poussant ces investigations sur la manière de compter les colonies sur moût gélatiné dans des boites de Petri, il conclut qu’en opérant non stérilement par des dilutions dans des tampons ou dans l’eau physiologique, il y a toujours un déchet important et que, dans les meilleures conditions de stérilité et de dilution dans du moût, on ne trouve que

90 % du nombre des cellules comptées. Avec des levures parfaitement saines, nous avons répété ces essais qui comportent en fin de compte deux sources d’erreurs : la première a trait à la numération au moyen de l’hémacytomètre, la secondé découle des observations de Fink.

Nous avons alors imaginé une manière de compter exactement et directement les cellules stériles et celles donnant des colonies en effectuant le moins de dilutions possibles de la suspension primitive. Dans un tube de moût gélatiné, on introduisait une goutte de notre suspension bien agitée. Une lamelle couvre-objet était enduite sur une face par ce moût gélatiné et posée ensuite directement soit sur une chambre de Van Tieghem, soit sur une lame à alvéole.

En durcissant, la gélatine collait la lamelle à la chambre. Douze heures après, on pouvait déjà compter au microscope les levures restées isolées et les colonies. Partant de l’idée qu’une colonie provient d’une cellule on peut ainsi avoir le rapport des colonies à la totalité des levures ensemencées qu’on ramène à 100 :

p coloniesx100

N levures vivantes p. 100 — | p + m cellules isolées

Dans ces conditions, la stérilité ne joue aucun rôle. I faut prendre garde d’avoir sur la lamelle un nombre de cellules suffisant pour offrir une bonne moyenne. D’autre part les globules doivent être bien isolés afin d’éviter l’empiètement de colonies les unes sur les autres au cours de leur éventuelle multiplication. Certes, un perfectionnement important consisterait dans le comptage des cellules au moment de leur ensemencement sur la lamelle et dans le comptage des colonies formées à partir de ces mêmes cellules, ce qui serait réalisable avec une chambre claire. De toute

ET TN EE et M) LP NE

Lits.

façon les résultats ont été excellents et plusieurs essais parallèles nous ont donné une précision de 4 %, à condition de compter pour chaque lamelle environ 200 cellules.