ACCOUTUMANCE DES LEVURES AUX ACIDES ACÉTIQUES MONOHALOGÉNÉS

Toutes nos expériences ont porté sur trois races de levure provenant de la collection de l’Institut Pasteur, choisies de manière à avoir trois types différents et bien définis.

1° Une levure de boulangerie, la levure Springer.

2° Une levure basse, la levure de brasserie Dortmund.

3° La levure Cramant, que l’on emploie couramment dans

la champagnisation.

On a déjà vu qu’un bon moyen d'étudier l’action d’un antiseptique sur les levures est d’essayer de les accoutumer à ce corps, en tâchant d’apercevoir tout changement

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éventuellement réalisé. Nous connaissons les méthodes d’accoutumance de Kossiakoff (6) et d’Effront (7). Le principe est d’avoir une série de levures normales, cultivées dans un milieu sans antiseptique, parallèlement à une série de même génération où les doses d’antiseptique seront de plus en plus fortes. Effront ne passe à une concentration supérieure que lorsque la levure a réussi à fermenter la moitié du sucre offert en présence des fluorures.

Nos expériences ont eu lieu dans des tubes à essais contenant 10 cc. de liquide.

L’acide halogéné a été ajouté soit en solution pure, soit en solution neutralisée par de la soude. Par exemple, pour avoir une concentration M/1.000, nous avons pris 8 cc. de milieu, plus 1 cc. de solution d’acide M/100, plus 1 cc. de suspension à ensemencer; et pour avoir une concentration M/2.000, à 8 cc. de milieu nous avons ajouté 0,5 cc. de la solution d’acide M/100 plus 0,5 cc. d’eau stérile et plus 1 cc. de la suspension de levure. La stérilisation a été effectuée sur le milieu seul, les additions supplémentaires aïnsi que les ensemencements étant faits avec des pipettes graduées stériles.

Quelques mesures de pH nous ont renseigné sur l’acidité des milieux et les variations de cette acidité provoquées par l’acide monohalogéné ajouté. Nous avons effectué les mesures de pH par l’électrométrie à l’aide de l’électrode à quinhydrone.

A des concentrations très faibles, celles employées pour l’acide iodacétique surtout, la variation est négligeable et en effet aucune différence n’a été observée entre l’action de l'acide pur ou de l’acide neutralisé. Par contre dans le cas de l'acide chloracétique dont la concentration s'élève à M/30, l’acidité s’est trouvée fortement accrue, provoquant

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l’agglutination des levures et des précipitations dans les milieux de culture.

Les solutions d’acide doivent être faites extemporanément pour les acides iodacétiques et bromacétiques qui s’hydrolysent rapidement en solution aqueuse et beaucoup plus rarement, toutes les trois semaines, pour l’acide chloracétique qui est stable. La fermentation a été contrôlée généralement par l’observation du dégagement de CO, et pour être plus précis, nous nous sommes servis des tubes einhorn.

1) Nous avons commencé par déterminer la quantité d’acide halogéné qui arrête totalement la fermentation de la levure normale. Une série de tubes à essai contenant 10 cc. de milieu additionné d’acide halogéné à des concentrations variant à peu près en série arithmétique, est ensemencée par la même quantité de levure jeune, en pleine fermentation, soit environ 10 mg. de poids sec. A partir d’une certaine concentration, la fermentation devient plus lente, avec la période de latence plus longue, pour finir par s’arrêter complètement.

Plusieurs expériences parallèles nous ont montré qu’avec rigoureusement le même milieu et la même levure, on trouve toujours la même concentration d’acide nécessaire pour arrêter la fermentation. Cette dose varie avec l’acide, le milieu, la race et la quantité de levure (tableau IIT).

Tableau IT

Concenirations d’acides halogénés arrêtant la fermentation des levures normales

og mm

CH,ICOOH CH,BrCOOH CH,CICOOH [2] (0) n [-b] =] Leb] É| [<b] = on Ô = © See SMeS la Jedueau times SR BTS = 7 BTE S ÊTES À © =) © El © - F 8 : £ Fe 8

me me ————— ———————————— | —————— | ———

Springer ..|M/3.000| M/8.000|M/1.500 | M/1.800 | M/125 | M/125

Cramant ..1M/3.000 | M/8.600|M/1.200 | M/1.600 | M/125 | M/125

Dortmund. |M/6.000 | M/12.000|1M/2.000 | M/4.000 | M/175 | M/225

Le moût de bière utilisé : pH 5,4; l’eau de touraillons utilisée : pH 3,8 à 4,6; quantité de levures ensemencées : 5-8 mg. de poids sec.

Nous avons pu confirmer en outre, sans approfondir le sujet, que le pH du milieu influence beaucoup l’activité de ces antiseptiques et que plus il augmente dans les limites envisagées, plus l’inhibition diminue.

Chaque préparation de touraillons donne des résultats légèrement différents.

Ces différences semblent être en rapport avec la variation de richesse et de l’acidité de ces milieux; par contre, dans les moûts de bière les résultats sont assez constants.

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2) Nos expériences d’accoutumance ont été ainsi conduites : Nous avons pris une levure fermentant partiellement sous l'influence d’une quantité quelconque d’acide halogéné et par quelques passages successifs dans la même concentration d’antiseptique nous avons essayé d'augmenter sa fermentation.

Même après une dizaine de passages, la levure n’a jamais retrouvé toute son activité normale. Cette levure a été ensemencée alors dans quatre tubes : le premier contenait le milieu de culture pur; le second, avait la même concentration en antiseptique que le tube servant à l’ensemencement ; le troisième, une dose légèrement plus forte que le second et le quatrième une dose plus forte que le troisième. Généralement la fermentation arrêtée dans le quatrième tube était déjà bien nette dans le troisième. Si la levure du troisième tube finissait par fermenter d’une manière satisfaisante après un ou deux passages dans cette même dose, on continuait l’accoutumance à une concentration d’antiseptique légèrement plus forte et ainsi de suite.

Toutes ces levures empoisonnées présentent une période de latence de 24 et parfois 48 heures, après quoi la fermentation continue légèrement 2 à 3 jours.Les repiquages ont donc été faits après le deuxième ou le troisième jour. A partir d’un certain moment, la levure fermente de moins en moins, en dépit de plusieurs passages.

On arrive ainsi à une concentration limite à laquelle il semble que la levure ne puisse plus s’accoutumer. Richet (122), en étudiant l’accoutumance du ferment lactique au TINO; avait déjà montré qu’il y a une limite à l’accoutumance qu’il est impossible de dépasser. Pourtant cette première limite atteinte n’est pas très fixe et il nous est arrivé de pouvoir la franchir grâce à une levure accoutumée, culti-

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vée pendant une génération dans du moût pur et soumise à nouveau à l’acclimatation (*). ;

Dans le tableau IV, nous indiquons les concentrations maxima supportées. Ces valeurs ne sont que relatives, et sont susceptibles de variations sous l’influence des facteurs précédemment examinés.

On peut donc accoutumer et faire encore fermenter des levures dans des concentrations d’acides halogénés 5 fois plus fortes que les concentrations qui arrêtent la fermentation d’une levure normale.

Tableau IV Concentrations maxima d'acides monohalogénés supportées par les levures accoutumées

CH,CICOOH CH,B,COOH CH,ICOOH Levures (2 (2) (2 a a JA CS lATE © | 5 à 8 ae 5 6 S ©) LE ep 5, = © 5 S 6 Es © © S 3 à © © a = = ON ERNEST RS ES «= = Le = = & + + +

Springer .. | M/800 | M/2.000 | M/300 | M/350 M/30 M/30

Cramant ..| M/800 | M/2.000 | M/300 | M/350 | M/30 | M/30

Dortmund. | M/800 |M/2.000 | M/300 | M/900 M/175 M/50

(*) Comme nous l’avons déjà indiqué, il suffit d’avoir une nouvelle préparation du milieu pour observer de légers changements dans le comportement des levures. Les variations de la concentration en sucre du milieu ont montré qu'il y a un optimum pour le moût de bière de densité 1035-1045, sans nous conduire à d’autres conclusions présentant un intérêt.

C’est pour remédier aux inconvénients des milieux de culture habituels, que nous avons essayé d'employer le milieu minéral artificiel décrit à la deuxième partie. Nous nous sommes servis d’une levure Cramant, déjà habituée à ce milieu (97). Malheureusement, de très petites doses d'acide, M/40.000, suffisent à arrêter complètement la croissance et la fermentation, sans aucun succès d’accoutumance. Nous verrons dans les expériences qui vont suivre, qu’elles nécessitent des quantités assez grandes de levure, pratiquement impossible à obtenir avec le milieu artificiel additionné d’acide halogéné, ce qui nous a déterminé à abandonner ces cultures.

Une remarque digne d’être mentionnée se rapporte au mécanisme biologique de l’accoutumance, qui se fait par sélection confirmant ainsi l’opinion d’Effront (8). En présence des acides monohalogénés, le pourcentage des cellules mortes est énorme et seulement 10 à 25 % des levures accoutumées donnent des colonies.

Les acides halogénés provoquent donc un grand déchet de levure et ce n’est qu’une faible minorité résistante à son action, qui transmet la faculté de fermenter aux générations suivantes.

L’accoutumance se perd facilement dès que la levure accoutumée est cultivée pendant une ou deux générations dans un milieu normal. Portée dans un milieu ordinaire, elle retrouve toute son activité ancestrale.

Les levures traitées par ces antiseptiques changent aussi d'aspect. Elles sont brunes surtout dans les milieux fortement caramélisés ou âgés, ce qui est causé, suivant notre

avis, par la pénétration du milieu de culture dans les cellules mortes. Elles sont souvent agglutinées et au microscope elles présentent des granulations et quelques déformations. Sur des moûts gélosés traités par les acides halogénés à des concentrations correspondantes au milieu liquide, elles poussent très difficilement, finissant par sporuler après un certain temps.

Une conclusion intéressante concernant la similitude du mécanisme d’accoutumance aux divers acides halogénés, peut être tirée du fait qu’une levure accoutumée à une certaine dose de l’un des acides supporte aussi bien des concentrations élevées des autres acides. L’accoutumance n’est pas spécifique pour un seul des acides monohalogénés.

Le trait essentiel qui se dégage de ces expériences est la différence que présente les races de levures employées, lorsqu’on les met en présence des acides halogénés.

Cette différence valable pour les trois acides et qui tend à disparaître par l’accoutumance, est très visible sous l’influence des doses d’antiseptiques qui arrêtent la fermentation de la levure normale. On constate que les levures Springer et Cramant ont la même résistance et supportent ‘ des doses plus fortes que la levure Dortmund.

L'action des acides varie énormément suivant leur halogène : la plus forte inhibition est exercée par l’acide iodacétique, puis par l’acide bromacétique et la plus faible par l'acide chloracétique.

Le milieu et le pH sont aussi des facteurs modifiant la sensibilité des levures.