EL

On évitera cet inconvénient, en raclant la surface de la gélose et en faisant une émulsion microbienne dans l’eau distillée.

Dans les préparations faites de cette manière et colorées, on ne voit qu’une très fine poussière dont, avec les plus forts grossissements, on ne peut distinguer les éléments.

En colorant avec le Ziehl à chaud, ou même en mordançant les préparations, soit au tannate d’osmium selon le procédé de Van Ermengen, soit au tannate de fer d’après la méthode de Lüffler, i! est impossible de voir un élément microbien ayant une forme bien distincte.

Le microbe de la péripneumonie est-il donc réfractaire aux matières colorantes usitées en bactériologie? Non. Il prend au contraire la couleur avec une extrème facilité.

Au lieu d'essayer de colorer desémulsions microbiennes, nous avons coloré en masse toule une colonie microbienne prise sur la gélose.

Avec un rasoir, on prélève à la surface de la gélose une mince tranche contenant les colonies qui y sont incrustées et on porte cette coupe de gélose sur une lame, puis on laisse sécher complètement.

Il est impossible d'utiliser sur ces coupes de gélose les couleurs d’aniline qui colorent en masse tout le substratum solide : aussi ne doit-on employer que les matières colorantes ayant une affinité particulière pour les noyaux comme l’hématoxyline ou l’hématéine.

La tranche de gélose est laissée en contact pendant environ une heure avec la solution colorante d’une de ces substances, puis on décolore la gélose qui a pris une belle teinte violette en la plongeant pendantun quart d'heure dans une solution d'acide acétique au tiers, on lave à l’eau pour retirer l'excès d’acide, et l’on monte dans la glycérine.

MO en

Les colonies microbiennes, après ces manipulations, restent inlacles et apparaissent au microscope colorées en violet sur un fond décoloré et transparent.

Elles ont conservé leur forme primitive : le mamelon, fortement coloré, est entouré d’une zone violette plus claire.

On peut mème faire de la sorte dans la gélose des sections perpendiculaires à la surface de culture que l’on colore par le procédé ci-dessus ; ce qui permet de constater que les mamelons, au lieu de faire saillie à la surface du milieu solide, sont au contraire enfoncés profondément dans la gélose comme de petits clous.

C'est à cause de cette particularité que ces colonies incrustées peuvent être manipulées sans se désagréger.

Mais quand nous avons voulu étudier l’action des couleurs d’aniline qui ont l'inconvénient de colorer le milieu solide, nous avons employé le procédé suivant en décalquant les colonies microbiennes sur une lame de verre.

On prélève, comme précédemment, une tranche de gélose que l’on applique sur la lame porte-objet, la surface contenant les colonies contre le verre, puis on laisse sécher la préparation.

Il suffit alors de gratter avec un scalpel la gélose qui s’enlève par petites écailles et la partie supérieure de Ia colonie reste adhérente au verre sans trace de gélose.

1 n’y a qu'à faire agir sur ces cultures décalquées les couleurs basiques d’aniline.

Ces colonies microbiennes se colorent rapidement par les couleurs basiques d’aniline usitées en bactériologie (Violet de Gentiane, Fuchsine, Bleu de Méthylène, Thionine). Elles se décolorent par la méthode de Gram.

Lorsqu'on examine ces préparations à de forts gros-

Ne

sissements, on ne peut distinguer qu’une fine poussière colorée composée d'éléments irréguliers formés par l’agglomération de microbes. Mais il est impossible de déterminer la forme d'un élément pris isolément.

Le microbe de la péripneumonie se colore donc facilement par les colorants nucléaires et son invisibilité tient seulement à son extrême ténuité.

Conditions de la culture. — Le microbe de la péripneumonie est un microbe surtout aérobie. Il cullive d’autant mieux que la surface du milieu nutritif en contact avec l'air est plus grande. Dans le vide ou en présence de gaz inertes, la culture se fait avec difficulté et ce n’est qu'après un séjour de huit à dix jours à l’étuve que le liquide devient légèrement opalescent.

La température la plus favorable à la pullulation de la péripneumonie est entre + 36° et + 38. À cette température, l’opalescence apparaît dans le bouillon sérum après le deuxième jour; puis le trouble augmente jusque vers le dixième jour, mais il n’est plus en rapport avec la mulliplication du microbe, car ce louche est dû en grande parlie à des précipités albumineux.

En effet, si l’on fait chaque jour un ensemencement sur gélose sérum, on remarque que la culture atteint son maximum entre le cinquième et le huitième jour; puis elle diminue graduellement jusqu’au vingtième jour.

Après un mois de séjour à l’étuve, la culture est difficilement régénérée.

Dans les tubes de bouillon sérum témoins, ce trouble apparait quelquefois lorsque la température dépasse 38°. Cette opalescence n’est pas due à une culture microbienne, mais à une précipitation de phosphates et d’albuminoïdes produite par la température élevée de l’étuve.

EE nie

Il va sans dire que ces tubes troublés ensemencés sur milieux solides ne donnent aucune culture.

Les limites extrêmes de température où peut se faire le développement de ce microbe sont + 42° et + 30°.

Le virus péripneumonique, soit dans la sérosité, soit en culture en bouillon sérum, est détruit à--58°. Ce microbe ne forme donc pas de spores.

Placées à la température de 10° à 15° en ampoules scellées, les cultures peuvent se conserver dix mois et plus, alors qu’à la température de l’étuve elles sont difficilement réensemençables au bout d’un mois.

Après plus d’une année, la sérosité prélevée d’un poumon hépatisé congelé est aussi virulente que le premier jour. M. Laquerrière (1) a employé ce procédé pour conserver la sérosité utilisée pour les inoculations vétérinaires.

L'étude de l’action des antiseptiques sur les cultures i vitro serait facile à étudier si les inoculations pouvaient être faites sur de petits animaux. Mais les bovins étant seuls sensibles. le matériel expérimental est coûteux et rend les recherches plus rares. On sait cependant que l'acide phénique en solution étendue (2 p. 1000) n’atténue pas sa virulence et est employé pour la conservation de la sérosité d’après la méthode de M. Nocard.

Importance du sérum dans les milieux de cultures. — Le microbe de la péripneumonie ne cultive que dans les milieux contenant du sérum. C’est là une règle absolue dans la culture de ce microorganisme. La quantité de sérum peut être minime, mais elle est nécessaire.

. Lorsque, dans un tube de bouillon peptonisé préparé

(4) Laquerrière. Sur la conservation du virus péripneumonique par

la congélation. Bull, de la Société vétérinaire, 1890.

selon la méthode de M. L. Martin, on ensemence plusieurs gouttes de sérosité péripneumonique, on obtient toujours une culture trois jours après. La quantité de sérosité apportée avec la semence a suffi à la pullulation du microbe. En effet, si l’on ensemence une trace de cette culture dans un nouveau tube de bouillon peptonisé sans sérum, on ne constate aucune opalescence dans le milieu. La culture ne se fera que si l’on a ajouté une certaine quantité de sérum et, grâce à la présence de ce dernier, les repiquages peuvent se faire indéfiniment. j

Au-dessous de la proportion de 5 °/, de sérum, la culture se fait avec un retard et l’opalescence est discrète.

Plus on augmente la proportion de sérum et plus luxuriante est la culture; mais, en dépassant la dose de 10 °/, de sérum, on obtient des bouillons très opalescents dans lesquels il est impossible de suivre la culture du microbe. Aussi, pratiquement, on ne doit pas dépasser cette proportion de sérum dans les milieux liquides.

Le mélange de bouillon et de sérum est nécessaire pour cultiver la péripneumonie. La culture ne se fait jamais sur sérum seul liquide ou gélatinisé à 70°.

Toules les albumines ne sont pas propices à la culture de ce microbe ; dans les bouillons additionnés d’albumine d'œuf, nous n’avons pu obtenir l’opalescence caractéristique de la culture péripneumonique.

L’albumine végétale que l’on retire de l’eau ayant servi à l'extraction du gluten nous a donné des résultats négatifs.

Seule la sérine semble être indispensable au développement de la péripneumonie dans les milieux artificiels.

Le sérum provenant d'espèces animales réfractaires à la péripneumonie a-t-il une influence sur la culture de ce microbe ?

. Nous avons étudié le sérum humain, le liquide d’ascite, le sérum de cheval, de porc, de mouton, de chèvre, de lapin, de cobaye et de poule, et nous avons toujours obtenu des cultures dans les bouillons contenant ces différents sérums.

Cependant, nous avons remarqué que les cullures se faisaient plus rapidement et étaient plus riches dans les milieux contenant du sérum de lapin ; au contraire, dans les bouillons additionnés de sérum de cobaye, la culture était plus discrète.

D'ailleurs MM. Nocard et Roux avaient constaté l’opalescence des cultures dans les sacs de collodion ou de roseau retirés de la cavité péritonéale du lapin, alors que le contenu des sacs laissés six semaines dans le périloine du cobaye contenait un liquide aussi limpide qu’au moment de l’ensemencement.

Pour nos passages successifs en milieux artificiels, nous employons de préférence le bouillon additionné du sérum normal de bœuf afin de conserver au microbe de la péripneumonie sa virulence primitive. É

Après un certain nombre de passages en sacs de collodion dans l’organisme du lapin, le microbe s’atténue et ne tue que rarement l’animal inoculé en région défendue. Au contraire, les cultures 2x vitro en bouillon sérum de bœuf, même aprèsune longue série de repiquages, sont encore aussi virulentes que la sérosilé naturelle.

Le sérum des animaux ayant eu la péripneumonie a-t-il uné action sur les cultures de ce microbe?

Une vache actuellement en cours d’immunisalion à l'École d’Alfort donne un sérum thérapeutique dont nous avons étudié les propriétés au point de vue agglutinant et bactéricide. Le sérum de cet animal hypervacciné, ajouté à une culture jeune de péripneumonie, ne provoque

Ro

aucune agglutination soit à la température de la chambre, soit à la température de l’étuve. Le bouillon conserve son opalescence.

Le microbe de la péripneumonie cultive aussi bien dans le bouillon additionné de sérum antipéripneumonique que dans les milieux contenant du sérum normal. Quelques gouttes de cultures laissées en contact, en ampoules scellées, avec du sérum antipéripneumonique pendant 24 et 48 heures et réensemencées en bouillon sérum donnent des cultures fécondes. Le sérum des animaux hypervaccinés n’est donc pas bactéricide et l’agglutination ne peut être d'aucun secours dans le diagnostic de la péripneumonie.

Influence des peptones. — Si l’on veut étudier l’influence des différentes peptones sur la culture de la péripneumonie, il est de toute nécessité de n’employer que des mélanges d’eau peptonisée et de sérum. En effet, dans le bouillon de macération de viande non peptonisé, chauffé à 70°, filtré et auquel on a ajouté 8 % de sérum, le microbe péripneumonique donne une légère opalescence après 5 à 6 jours d’étuve.

Aussi obtient-on souvent des ce discrètes dans les bouillons de viande additionnés de peptones commerciales d'origines diverses, à condition que le chauffage n’ait pas dépassé 70°. Leur stérilisation se fait par filtration sur porcelaine.

Dans les milieux stérilisés à l’autoclave à 115° et additionnés ensuite de sérum, on n’observe que très accidentellement la culture du mierobe de la péripneumonie.

Les peptones commerciales ne sont pas de composition constante et donnent des résultats incertains. Aujourd'hui on obtient une culture avec une marque donnée

ot —

qui n’en fournit plus si on l’essaye après quelques mois.

C'est pourquoi, pour la culture pratique de la péripneumonie, il faut préparer soi-même sa peptone et cette fabrication se fait aujourd’hui couramment dans les laboratoires.

Si on se trouve dans l'impossibilité de se procurer des pañses de porc pour la préparation de l’eau peptonisée d’après la méthode de M. L. Martin, on peut avoir recours à la pepsine commerciale et faire ainsi une digestion artificielle.

Nous employons dans ce cas les proportions suivantes :

Viande deveau hachée. .:...,.... 200 gr.

Pepsine en paillettes 20... Do — Acide-chlorhydrique.2= 1... 10 — ÉAUPARS OE PP T E NO AL 1000 —

La digestion et la préparation du bouillon peptonisé (1) se font exactement comme avec le bouillon de panse.

Ces peptones préparées au laboratoire peuvent supporter une température de + 120°, sans qu’elles aient perdu notablement leur qualité nutritive pour le microbe de la péripneumonie, alors que la plupart des échantillons de peptones du commerce sont devenus impropres à la culture de la péripneumonie après un chauffage à 115°.

C’est parce qu’elles supportent bien la chaleur qu’on peut employer ces peptones de laboratoire pour la préparation des milieux gélosés.

(1) Le lait diastasé additionné de sérum convient aussi à la culture de la péripneumonie.

Nous le préparons de la facon suivante :

PartisténiisSÉ MO Pr EE ce 1000 gr.

Solution de pancréatine à 2 %.....

stérilisée par filtration. ......... 100 gr.

Le mélange doit être fait aseptiquement : Mettre à l’étuve à 40° pendant 48 heures. Chauffer à 80° pour détruire la diastase, alcaliniser et filtrer.

ne de

Nous avons aussi essayé une albumose soluble, non pré- -cipitable par la chaleur et connue dans le commerce sous le nom de somatose. Jamais nous n’avons obtenu de culture dans ce milieu additionné de sérum.

Dans les essais de culture sur milieux solides, on doit autant que possible se servir de la sérosité pulmonaire pour l’ensemencement,. |

Si on puisait la semence dans une culture en bouillon, on transporterait sur le milieu à essayer, en même temps que le microbe,un peu de substance nutritive suffisante à un commencement de développement; mais un second repiquage sur milieu solide ne donnera lieu à aucune croissance.

Modifications chimiques des milieux cultivés. — La présence de ce microorganisme, dont la culture n'est décelée que par une légère opalescence du bouillon où il s’est multiplié, ne peut être contrôlée que par son action pathogène, c’est-à-dire par l’inoculation aux bovidés.

Il est permis de penser qu’il peut exister des microbes saprophytes aussi petits et même d’une ténuité telle qu’ils cultivent dans les milieux artificiels sans en changer l'apparence. Dans ce cas, les modifications chimiques du milieu pourraient seules prouver l'existence d’une culture microbienne. |

Nous avons donc étudié le microbe pathogène au point de vue de son action chimique.

Dans le bouillon sérum où s’est développé le microbe de la péripneumonie, on ne note, comme réaction, qu'une légère diminution dans l’alcalinité du milieu. Si l’on ajoute au bouillon nutritif différents sucres dans la proportion de 5 %, nous constatons que les milieux addi-

2090 ca

tionnés de glucose, de levulose ou de maltose deviennent neutres, puis franchement acides.

L’acidité évaluée en acide sulfurique peut atteindre 1 %. Cette formation d'acide n’est pas accompagnée de dégagement gazeux visible, même si l’on à eu soin d'ajouter du carbonate de chaux.

Les acides qui prennent naissance aux dépens du sucre complètement transformé sont des acides volatils dont la courbe, formée d’après le procédé d'analyse de M. Duclaux, tend à se confondre avec celle de l’acide acétique.

Au contraire, les bouillons contenant du saccharose, du lactose ou du galactose restent alcalins. Il en est de même des mieux glycérinés.

L’empois d’amidon n’est pas saccharifié par le microbe de la péripneumonie.

À ce propos, nous ajouterons que, dans ces recherches sur l’amidon, le sérum qui entre dans la composition du bouillon nutritif doit avoir été au préalable chauffé à -- 58° pour détruire l’amylase qu’il contient.

Cette diastase, reconnue par Claude Bernard et Magendie, saccharifie à la température de l’étuve la matière féculente et peut ainsi fausser les données de l’expérience.

Les modifications chimiques des milieux où se cultive le microbe péripneumonique sont donc suffisantes pour déceler la culture d’un microorganisme aussi ténu sans

recourir à son action pathogène.