CHAPITRE IV

Isolement du microbe de la péripneumonie par filtration.

Dans son mémoire de la fièvre aphteuse, Lôffler (1) démontrait qu’il existe des microbes d'une ténuité telle qu'ils traversaient les bougies filtrantes.

Lüffler prélève le contenu d’une pustule aphteuse qu'il mélange à de l’eau dans la proportion de 1/50 ; puis il filtre cette dilution sur terre d’infusoires ou porcelaine. Le filtrat injecté à des animaux provoque chez eux une éruption aphteuse caractéristique.

M. Nocard reprit à l’école d’Alfort ces expériences, et ses résultats concordent absolument avec ceux de l’expérimentateur allemand.

Au cours des recherches sur la péripneumonie, maintes fois les bactériologistes avaient filtré la sérosité péripneumonique sur plâtre ou sur porcelaine. l'injection de la sérosité filtrée ne provoquait aucun symptôme morbide ni immunité chez les animaux inoculés.

On se basaït sur ce fait pour prouver que l’agent pathogène dela péripneumonie n’était pas un poison soluble, mais bien un être vivant.

Lorsqu'on parvint à cultiver le microbe de la péripneumonie, nous avions filtré fréquemment les cultures pour savoir s’il existait une toxine soluble. Or les

(1) Lôrrcer. Sur la fièvre aphteuse. Recueil de Méd. vétérinaire, 1898.

de na

cultures filtrées, comme la sérosité, ne donnait aucune culture lorsqu'on plaçait le filtrat à l’étuve. Le microbe ne traverse donc pas les filtres dans son milieu de culture (bouillon sérum à 8 %).

Ce n'est qu'après le travail de Lôffler sur la fièvre aphteuse et en employant sa méthode de dilution que nous

réussimes à faire traverser les bougies filtrantes à l’agent spécifique de la péripneumonie.

La question de dilution et de la qualité des parois filtrantes est capitale si l’on veut obtenir des résultats positifs.

Lorsqu'on filtre un liquide albumineux, la première partie de l'opération se fait bien, puis la filtration se ralentit et s’arrète : l’albumine colmate la bougie et le liquide recueilli ne traverse plus la paroi filtrante que par dialyse.

Voilà pourquoi nous n'avions obtenu que des insuccès en filtrant Les cultures en bouillon sérum à 8 %.

En effet, pour que le microbe de la péripneumonie traverse les filtres, il ne faut pas que la quantité de la sérosité présente dans le liquide dépasse 2 % ; au delà de cette proportion, les résultats sont inconstants.

D'autre part, les bougies employées sont plus ou moins poreuses et ne conviennent pas toutes à la filtration de la péripneumonie. Les unes, en terre d’infusoires comme le filtre Berkefeld, sont d’une grande porosité; les autres sont faites en porcelaine dégourdie, à pâte plus ou moins serrée comme les marques F et B des bougies Chamberland.

La bougie Berkefeld filtre rapidement les liquides albumineux et est traversée avec facilité par le microbe de la péripneumonie. Mais le filirat obtenu avec ce filtre contient souvent en suspension de fines particules terreuses

qui troublent le liquide et gènent par suite l'observation de la culture qui s’y est développée.

Aussi utilisons-nous de préférence pour les filtrations la bougie Chamberland qui donne un bouillon parfaitement limpide permettant de noter de bonne heure l’opalescence de la culture.

Ces filtres portent une initiale au niveau de l’embase et à l'extrémité de la bougie. La bougie F est faite d’une pâte de porcelaine assez poreuse permettant une filtration rapide. Le microbe de la péripneumonie traverse sans difficulté cette porcelaine.

La bougie B, au contraire, filtre lentement les liquides et est une barrière infranchissable pour ce microorganisme invisible, quelque faible que soit la dilution employée.

Le passage du microbe de la péripneumonie à travers les parois filtrantes offre un grand intérêt au point de vue de la technique bactériologique.

Jusqu'à présent les filtres étaient considérés comme un procédé parfait pour stériliser les milieux liquides altérables par la chaleur.

Aujourd’hui, ils peuvent devenir, dans l’étude des infiniment petits, de précieux auxiliaires pour l'isolement de ces microorganismes à la limite ou au delà de la limite de la visibilité humaine, en retenant sur leur paroi filtrante les microbes d’une certaine dimension.

Lorsqu'il est possible de recueillir dans des conditions de pureté absolue la sérosité péripneumonique, il vaut mieux ensemencer immédiatement le bouillon sérum.

Si l’on craint la présence de quelques germes étrangers dans la semence, rien ne serait plus facile de faire un isolement sur gélose sérum. Mais nous savons que sur milieu solide les colonies de péripneumonie poussent lentement et ne sont visibles qu’après trois jours d’étuve ; pendant

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ce laps de temps, les microbes à pullulation rapide, comme le pneumobacillus d’Arloing que l’on rencontre fréquemment dans le poumon des bovidés {1}, envahissent la surface de la gélose et rendent impossible lout repiquage.

En employant la méthode de la filtration, on n’éprouvera aucun de ces inconvénients : la sérosité peut être recueillie sans précaution aucune, soit sur un bloc pulmonaire envoyé au laboratoire, soit puisée d’après la méthode des fontaines utilisée dans la pratique vétérinaire. Peu importe même que la sérosité ait subi un début de putréfaction ; dans ce cas même, ilest possible d’isoler par filtration le microbe de la péripneumonie.

Voici d’ailleurs la technique que nous suivons pour arriver à ce résultat :

La sérosité pulmonaire est diluée dans la proportion de 4 à 2 parties pour 100 parties de bouillon préparé selon la méthode Martin, chauffé à 70° et xox additionné de sérum.

Ce bouillon aura été précédemment filtré sur bougie Chamberland. Cette filtration n’a pas pour but de stériliser le milieu; elle ne sert qu’à purifier le liquide de toutes les particules solides qui s’y trouvent en suspension et pourraient entraver la filtration d'isolement.

Le mélange de sérosité et de bouillon est alors filtré sur bougie Berkefeld ou sur bougie Chamberland F.

Le liquide que l’on a recueilli après cette filtration ne contient qu’une quantité de sérum insuffisante pour la multiplication du microbe de la péripneumonie. Il n'y aura donc qu’à ajouter au filtrat assez de sérum pour que le bouillon devienne favorable à la culture du microbe, c’est-à-dire 8 parties de sérum normal pour 100 parties de bouillon.

(1) Lienières, Le Pneumobacillus liquefaciens bovis, hôte norma du poumon sain. (Bull, de la Société de Médecine vétérinaire, 1896.),

ie

Pour éviterles contaminations possibles, nous préférons, à la fin de la filtration, faire passer sur la bougie qui sert à l'isolement la quantité de sérum nécessaire.

Le liquide, filtré et additionné de sérum comme nous venons de le dire, est mis à l’étuve. Trois à quatre jours après, le bouillon devient opalescent et cette opalescence est l’indice de la culture du microbe de la péripneumonie.

En effet, cette opalescence se transmet par ensemencement sur bouillon sérum alors que le bouillon simple reste limpide.

Une goutte de ce bouillon opalin étalée sur gélose sérum donne naissance à de très fines colonies d’abord transparentes, puis mamelonnées, identiques à celles que nous avons décrites au chapitre précédent. Enfin l’inoculation reproduira l'infiltration de la péripneumonie.

Dans la technique de l'isolement par la filtration, la répartition du bouillon filtré peut être la cause de contamination du milieu. Aussi recommandons-nous de simplifier autant que possible ces manipulations.

L'appareil qui nous a rendu les plus grands services est le filtre qu'emploie le docteur Martin pour faire les essais de toxines et dont nous donnerons la description succincte :

« Get appareil se compose essentiellement d’un tube à « essai enveloppant une bougie Chamberland; tube et « bougie sont placés dans une chambre à vide, tandis que « l’intérieur de la bougie est en communication avec le « liquide à filtrer (fig. 1).

« La partie filtrante de l’appareil est constituée par une « bougie-Chamberland sans embase dite bougie de labora- « toire; cette bougie est vernissée à l’intérieur et à l’exté- « rieur sur une longueur de 5 centimètres à partir de son « orifice. Autour de la partie vernissée on enroule du

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« coton ordinaire et on adapte la bougie à l’extrémité d’un « tube à essai de façon qu’elle pénètre à

à frottement « dur.

« Lorsqu'on veut filtrer, on prend un de ces appareils

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« stérilisé d’avance, on enlève Le coton qui ferme l’ori- « fice de la bougie et on met l’intérieur en communica- « tion avec un réservoir qui contient le liquide à filtrer.

« Ge réservoir est formé par une boule de verre ouverte « à l’un de ses pôles et soudée par le pôle opposé à un « tube de verre qui s'engage dans l’orifice de la bougie;

«un bouchon de caoutchouc perforé (6) sert à fixer le tube « du réservoir à cet orifice.

« Lorsqu'on a réuni la bougie à son réservoir, on place « tout l'appareil dans un tube de verre; ce tube-manchon « est fermé à l’une de ses extrémités, ouvert à l'autre; « mais cette ouverture doit être obturée par un bouchon « de caoutchouc perforé en son centre B.

« Quand la filtration est terminée, on enlève la bougie « de l’intérieur du tube à essai, elle est aussitôt remplacée « par le tampon de coton d’un gros tube flambé{1). » (Fig. 2.)

On peut ainsi filtrer de petites quantités (60 cc.) de la dilution péripneumonique à 2 % et mettre à l’étuve, sans transvasement, ces tubes contenant tout le liquide filtré et additionné du sérum nécessaire à la culture de la péri-

pneumonie.

(1) MarriN. Production de la toxine diphtérique, Ann. de l’Institut Pasteur, loc. cit.