parties d’azur II1 (solution aqueuse à 0,8 p

Après un court lavage à l’eau, on sèche et on monte dans l’huile de cèdre.

Ce procédé a perdu beaucoup de son intérêt depuis qu’on a reconnu que des colorations aussi bonnes pouvaient être obtenues de maniéré plus rapide, en suivant la méthode même de Giemsa. Celle-ci utilise la solution suivante, qui — nouvel avantage, l’ayant fait adopter par Schaudinn (522) et Hoffmann eux-memes existe toute faite dans le commerce 2.

Azur II — Eosine 3 g1'.

Azur II

Glycérine (Merck, chimiquement pure). . . 250 gr.

Alcool méthylique (Kahlbaum I) 250

Les préparations, après séchage à 1 air, sont fixées i5- 20 minutes dans 1 alcool absolu. Pour colorer, on ajoute a environ 1 cc. d eau distillée, d abord 1 a 10 gouttes d une solution de carbonate de potassium à 1 p. 1000, puis, en remuant, une goutte de la solution colorante. Les. tieponèmes sont déjà colorés après 1 5 minutes. Temps optimum : une heure. On lave à 1 eau, dont on enleve ensuite 1 excès avec un papier buvard ; on laisse sceller et 1 on monte dans le baume de Canada. Le tréponème pâle apparaît en rouge

possible est d’ordre général et doit être respectée quelle que soit la méthode de coloration suivie. , .

1 L’azur II est un mélange d’azur de méthylène et de bleu de

méthylène à parties égales. ... ,

2 Giemsasche Lôsuncf fur die Romunowsky Fnrbunrj. Dr Grubler

et Cie , Leipzig.

violacé ; les grosses spirochètes en bleu. Les quelques variantes qui ont pu être apportées à cette technique et qui sont relatives soit à une moindre dilution du liquide de Giemsa *, soit à la durée de la coloration, soit enfin à la pratique de cette coloration à chaud (Preis), sont d’importance relativement secondaire et ne nous arrêteront pas. Nous ne signalerons un peu plus spécialement qu’une modification introduite par Schaudinn (522 ) et avantageusement utilisée par Roscher (Soy) et par Hoffmann et Halle, qui l’ont récemment perfectionnée : elle consiste à substituer à la fixation par 1 alcool celle par les vapeurs d’osmium, qui fait mieux ressortir les spires et les extrémités du tréponème2.

Parmi les procédés de coloration de ce microbe, dérivés de la méthode de Romanowsky, le plus employé, avec celui de Giemsa, est celui de Marino.

Le bleu de Marino associe cà l’azur et à l’éosine le bleu de méthylène. Bien que, comme le Giemsa, il existe tout préparé dans le commerce3, nous allons indiquer rapidement sa composition. Pour le préparer, on mélange une solution aqueuse de bleu de méthylène et d’azur (bleu, o gr. 5o ; azur, o gr. 5o ; eau, roo gr.) avec une solution de carbonate de soude (o gr. 5o °/0). Puis, après un séjour de 24-48 heures à l’étuve à 37°, on unit ce mélange avec une solution aqueuse d’éosine, dont le titre, variable suivant la qualité du bleu, oscille entre o gr. 10 et o gr. 3o °/0. On filtre et on obtient une poudre soluble dans l’eau et l’alcool méthylique : le bleu de Marino.

La marche de la coloration est la suivante : on fait un

1 Pn, particulier Hoffmann ( cité par Nobl) recommande une dilution de 14 gouttes de Giemsa pour 10 cc. d’eau distillée.

,2 Lipschütz a trouvé qu’une solution d’acide acétique à 1 /4 o/0 décolore le tréponème dans les frottis au Giemsa, et quelques auteurs, qui ont constaté une décoloration rapide de leurs préparations <\ lazur, l’ont attribuée à l’acidité du baume de Canada (Jacqué, Weitlaner). Ajoutons que Frosch a trouvé au contraire que le tréponème coloré au Giemsa résistait à l’action de l’acide acétique.

3 Malbéqui et Cie, 9, rue Montparnasse, Paris.

frottis sur une lame de verre et on laisse sécher quelques instants. Inutile de lixer. On lait tomber sur la lame environ i cc. d’une solution préparée en faisant dissoudre o gr. o4 de bleu Marino dans 20 cc. d’alcool methylique pur. On laisse agir environ trois minutes, et sans laver, sans même enlever l’excès de bleu, on laisse tomber sur la lame 1 cc. d’une solution aqueuse d’éosine à 1/20000''. On laisse agir deux minutes, on lave à l’eau, on seche et Ion monte au baume. Le tréponème apparaît teinté très fortement en rose orangé.

Que si nous comparons maintenant la valeur des deux méthodes de Giemsa et de Marino, un point est hors de conteste : la seconde est beaucoup plus rapide que la première ; cinq minutes de coloration dans un cas, une heure dans l’autre. En ce qui concerne leur facilité d’application , il n’y a guère à faire entre elles de différences : elles sont aussi simples l’une que l’autre. Reste la question des résultats obtenus : sur ce point, après de nombreux examens comparatifs, nous sommes arrivé bien nettement à cette conclusion que le procédé de Marino ne le cède en rien a celui de Giemsa : les préparations sont aussi lisibles, les tréponèmes aussi nettement colorés, leurs details aussi bien venus dans un cas que dans 1 autre. Si bien qu en résumé voici deux méthodes, donnant lune et lautie, avec une égale lacilité. d excellentes préparations, mais dont l’une, celle de Marino, est dix lois plus rapide que l’autre : c’est évidemment a celle-ci que vont toutes nos préférences.

Quant aux autres procédés qui appartiennent encoie à la famille du Romanowsky, ils sont d un usage beaucoup moins courant dans la recherche du treponeme.

Et tout d’abord, dans cette catégorie, voici la mé-

thode originale de Romanowsky elle-même (bleu de méthylène-éosine), qui a donné de bons résultats entre les mains de Babes et Panea (i3), Bertarelli, Yolpino et Bovero (5i), Splendore, Galli-Valerio et Lassueur, Rosenberger, tandis qu elle échouait entre celles de Yasconcellos, et que Hcrxheimer et Hübner, comme avant eux Schaudinn et Hoffmann (5a8), ne réussissaient à colorer par elle que Sp. ref ring eus.

Rappelons brièvement la technique du procédé de Romanowsky, qui comporte les phases suivantes :

1° Mêler : a) Solution aqueuse saturée

de bleu de méthylène. . 2 parties

h) Solution aqueuse d'éosine

2° Agiter. Il se forme un précipité qui ne doit pas être filtré ;

3° Placer la lame (face vernissée en bas) dans le mélange pendant 2 heures;

4° Laver à l'eau, à l’alcool, sécher.

(Le Dantec, Pathol, exot., 2e édit., p. 432.)

Tout proches du procédé de Romanowsky sont ceux de Jenner, de Leishman et leurs dérivés, où, au lieu de fabriquer extemporanément l’éosine-bleu en milieu liquide, on dissout dans 1 alcool une poudre préparée a 1 avance et qui n’est autre que le précipité filtré et séché, obtenu par la réaction d’une solution de bleu sur une solution d’éosine.

Le procédé de Jenner (dissolution d’éosine-bleu dans 1 alcool absolu) n’a guère été employé que par Rosenberger, avec succès d’ailleurs. La variante de Leishman l’a été beaucoup plus souvent : Babes et Panea (i3) en ont fait usage ainsi que Bushnell ; Richards et Hunt(424) en ont obtenu de bonnes colorations, inférieures cependant a celles du Giemsa, tandis que Bunch place ces

deux méthodes sur le même rang. Le procède de May- Grünwald (solution saturée du précipité d’éosine-bleu dans l’alcool méthylique pur) aurait permis à Simonelli et Bandi de colorer Tr. pallidum en 5-io secondes, tandis que celui de Dudgeon (dissolution a i p. ioo dans l’alcool méthylique de poudre de Leishman) a donné, entre les mains de son auteur, d excellentes préparations de ce même microorganisme. Signalons encore les résultats positils obtenus par Russell avec le Romanowsky modifié par Wright.

Une mention spéciale semble devoir etre accordée à l’intéressante méthode de Goldhorn, dérivée de celle de Romanowsky -Nocht.

La préparation du colorant est un peu compliquée ; mais l’inconvénient qui pourrait en résulter est supprimé de ce fait qu’on peut se le procurer tout lait dans le commerce. Voici simplement le principe de cette préparation : on obtient d’abord une solution aqueuse de bleu polychrome dont l’une des moitiés est légèrement acidifiée avec une solution étendue d’acide acétique, puis mélangée avec l’autre. Dans la solution ainsi obtenue, on verse de l’éosine à 1/2 % jusqu’à précipitation complète. On laisse reposer 24 heures ; on filtre et on dessèche le précipité. C est une solution de celui-ci dans l’alcool de bois commercial qui constitue le

colorant de Goldhorn. t

Pour se servir de cette solution, on en met, sur une préparation non fixée, assez pour la couvrir ; après deux ou trois secondes, on verse l’excès et on introduit la préparation lentement et obliquement dans de l’eau propre, le côté frottis en bas , puis on sèche à l’air. Le tréponème est coloré en rouge pourpre, qui tourne au noir ou au brun noirâtre par le Gram ou le Lugol.

Voici donc un mode de coloration qui à une rapidité et une simplicité très grandes joint la propriété

de différencier très rapidement le tréponème des spirilles saprophytiques vulgaires. Il serait très désirable de voir continuer par d’autres auteurs les excellents résultats qu’en ont obtenus Goldhorn et son élève Mac Kee.

Des recherches théoriques ayant montré qu’une partie des affinités tinctorielles spéciales du colorant de Romanowsky semblaient devoir être attribuées à un certain corps, Y azur (le méthylène, qui y prend naissance, l’idée devait forcément venir de préparer de nouvelles solutions colorantes, où ce corps fût directement introduit. De là résultèrent plusieurs procédés nouveaux, parmi lesquels le Giernsa et le Marino sont aujourd’hui les plus fréquemment employés, ce qui n’empêche pas quelques-uns des autres de s’être également bien comportés. C’est ainsi que Galli-Valerio etLassueur ont obtenu un résultat positif avec Y azur de Michaëlis; que Launois et Læderich signalent l’emploi qu’ils ont fait du bleu d'azur h et Rabes et Panea(i3)les bonnes préparations que leur ont données la « Ziemssen's Losung II Eosin mil 1 zur ».

Plus personnelle est la technique de Zabolotny qui , après fixation, fait agir comme mordant une solution d’acide phénique à 5 °/0, puis colore en chauffant pendant un quart d’heure avec un mélange de o.t °/0 d’azur et 0,2 d’éosine.

La technique de May est curieuse en ce que, dans un premier temps, elle réalise une coloration genre Romanovvsky que, dans un second, elle transforme,

1 M. L. ( Presse mèdic., 21 mai 1905, p. 324) donne la technique suivante : solution aqueuse de bleu d’azur à l/1000eme; colorer pendant 12-16 heures, sécher à l’air, monter dans l'huile.

MICROORGANISMK.

par F adjonction d’azur de méthylène, en coloration genre Giemsa.

Le premier temps n’est autre qu’une application de la méthode May-Grümvald, indiquée plus haut. On met ensuite la préparation pendant une minute dans 1 eau distillée, on la sort, et, sans la sécher, on verse sur elle une goutte dune solution à o,5 °/() d’azur de méthylène. Les changements de colorations qui se produisent alors, et que Ion peut suivie au microscope, sont termines en 2-4 minutes.

Au cours de leurs remarquables travaux sur Ja syphilis expérimentale poursuivis a Batavia, iNeisseï, Baeimann etHalberstàdter, après des recherches comparati ves exécutées avec la méthode ancienne de Giemsa, celle de Romanowsky- Ziemann , celle de Schaudum - Hoffmann, se sont arrêtés finalement au procédé qu utilise Kiewict de Jonge pour la coloration des parasites de la malaria, et qui est une combinaison des procédés de Leisliman et de Giemsa.

Solution de o,iO d’azur 11 et de o,io d’éosine dans q. s. pour ioo d’alcool, éthylique. Sur le frottis, faire tomber à la pipette i5 gouttes de cette solution, puis aussitôt 3o gouttes d eau distillée. Souffler légèrement par la pipette pour mélanger. Durée de la coloration, environ une heure. Ensuite simple lavage sous un lilet d eau.

Enfin Berger (42) a indiqué une méthode de coloration rapide, en deux temps, cpii se prête à de multiples combinaisons.

Voici l’une d’elles : sécher le frottis à l'air et fixer 5io minutes dans l’alcool absolu, Dans un premier temps, verser sur la lamelle 5 gouttes de bleu de méthylène alcalin de Lôfflcr ; puis, au bout d’une demi-minute, 3 gouttes d une solution d’azur IL Encore une demi -minute. Alors seu-

lement — deuxième temps — ajouter à ce mélange 6 gouttes de solution de Giemsa et laisser colorer encore 2 minutes. Eau. Papier buvard. Canada neutre.

Pour le premier temps, on peut employer encore une solution de bleu de méthylène pure, puis une solution d’azur II ou de Lofïïcr seul; pour le second, une solution de violet de gentiane phéniqué (Czaplewsky) on de fuchsine phéniquée non étendue, on encore une solution saturée d’éosine dans l’alcool à 99,8 °/0. — Le premier temps servirait de mordançage.

Nous venons de montrer, dans les pages précédentes, que la coloration du tréponème relevait non seulement du Giemsa, mais encore des nombreux procédés dérivés de celui de Romanowsky. Il nous reste à faire voir que, mieux encore, le tréponème se laisse parfaitement mettre en évidence par un certain nombre de colorants, d un usage ancien et journalier dans les laboratoires. Les trois plus importants sont le violet de gentiane, la fuchsine et le bleu de méthylène.

Le violet de gentiane a été employé en solution dans 1 eau d aniline, par Gonder et Hoffmann (vingt-quatre heures de coloration) ; dans l’alcool éthylique ou méthylique , par Bandi et Simone! li (i 9) ; dans l’acétone, par Mac Lennan (021) (étendre la solution aeétonique de. trois parties d’eau et filtrer avant l’usage).

Herxheimer (201) l emploie en solution aqueuse satu rée à chaud, fdtrée après refroidissement et refiltrée tous les deux jours (Herxheimer et Lôser).

Apres fixation a 1 alcool, on verse quelques gouttes de cette solution sur la lamelle, et on laisse colorer soit à froid pendant i5 minutes, soit mieux à chaud, pendant une minute environ, au-dessus d une flamme jusqu’à émission de vapeurs (Herxheimer et Opiücius). Lavage à l’eau. Buvard. Baume.

Cette méthode donne de très bons résultats, c[ui ont été vérifiés par Berger (43) et par Flügel. Supérieure au Giemsa pour la rapidité et I intensité de la coloiation, elle le serait encore pour l’étude de détail des corpuscules, flagelles, double contour, etc., mais lui céderait le pas quand il s’agit de différencier le trépomcne par des finesses diagnostiques (Herxlieimer et Opificius).

La méthode de Fusco diffère de la précédente en ce que, après fixation de dix minutes à l'alcool absolu, on soumet le frottis pendant cinq minutes au mordançage d’une solution d’acide chromique à 5 %• Après quoi on fait agir à froid, pendant une demi-heure, une solution aqueuse , saturée à chaud , de violet de gentiane ou de violet de méthyle, filtrée chaque fois avant l’usage; on lave, on sèche et on monte dans le baume.

L’emploi du violet de gentiane, en solution plié niquée, constitue la base des procédés de Ploeger, d’Oppenheim et Sachs.

Ploeger plonge la lamelle, sans fixation préalable, pendant une minute , dans la solution donnée par Czaplewski pour le Gram (mélange à io % de solution alcoolique concentrée de violet de gentiane dans une solution phéniquée à 2 */ °/0). Bien laver ensuite à l'eau. Les tréponèmes paraissent colorés en bleu pâle, même a>cc un giossissc-

ment de 8oo. .

Oppenheim et Sachs recouvrent la lame, sechcc a 1 air et

non fixée, avec leur colorant, qui est un mélange de îo ce. de solution alcoolique concentrée de violet de gentiane avec ioo cc. de solution aqueuse d'acide phénique « 5 7o‘ Chauffage au-dessus de la flamme du Bunsen jusqu’à émission de vapeurs. Eau. Buvard. Baume. Les tréponèmes viennent en bleu, avec tous les caractères morphologiques que leur a décrits Scliaudinn, si cc n’est que leur largeur

diamétrale est un peu accrue. Sp. refringens est plus épais et d’un bleu plus intense.

Hoffmann (a45) déclare cette méthode simple et pratique ; tel est aussi l’avis de Fanoni ( 1 6 1 ) et de Mulzer (4oa) ; Bodin (66), au contraire, se montre défavorable1.

La fuchsine, expérimentée de bonne heure avec un résultat positif par Gonder et Hoffmann, ne semble avoir donné, sous sa forme habituelle de fuchsine phé niquée de Ziehl, que clés résultats assez imparfaits [Simonelli et Bandi (55a); Mac Weeney (6o5)J. Aussi devait-on songer à la combiner avec un mordançage préalable, comme il est d’ailleurs de pratique courante en bactériologie. Ainsi prit naissance le procédé de Reitmann, dont voici la technique.

Séchage à l’air et fixation pendant io minutes dans l’alcool absolu. Après lavage à l'eau distillée, mordançage pendant 5 minutes dans une solution à a °/Q d’acide phosphotungstique. Lavage à l’eau distillée et à l’alcool à qo °/0 ; de nouveau eau distillée, puis coloration au Ziehl , au-dessus dune flamme jusqu’à forte émission de vapeurs. Lavage à fond à l’eau courante, puis à l'alcool à 70°, puis de nouveau à 1 eau. Sécher et monter. Sur fond clair se détachent les noyaux cellulaires foncés, et les tréponèmes d’un rouge assez intense.

Cette méthode donne de bons résultats [Doutrelepont (i33), de Elizalde et Wernicke]; mais on a pu lui reprocher, à juste titre, cl’être quelque peu compliquée [Hoffmann (245), Mulzer (402)].

C est encore en une coloration à la fuchsine phéniquée après mordançage que consiste le procédé bien

1 A propos de la coloration par le violet de gentiane, signalons que le tréponème 11c prend pas le Gram (Lipschütz, Mulzer, Mac Weeney).

connu de Lôfiler, qui, excellent pour mettre en évidence les cds du tréponème [Schaudinn (523)], ne 1 est pas moins pour colorer le tréponème lui-meme [Buinet (88 bis)].

Le mordant de Lolïlcr a la composition suivante :

Tannin à 25 °/0 • ^

Solution saturée à froid de sullate ferreux ... a Solution alcoolique saturée de luchsine *

Employer à cliaud, à émission légère de 'vapeurs, en renouvelant plusieurs lois le liquide (mordançage fractionne) , colorer ensuite à la fuchsine de Ziehl, en chauffant lcgeicment [Burnet (88 bis)].

Le procédé de Borrel, employé par Borrel et Bumet à la recherche du tréponème, n est, avec son « encre au tannin » comme mordant, qu une variante du précèdent.

Le procédé rapide Proca et Vasilescu, qu expérimentèrent Ioanitescu et Galasescu, combine l’action de la fuchsine phéniquée, prise comme mordant, avec celle du violet de gentiane phéniqué.

Le frottis, fixé 3o minutes à l’alcool, est, traité io minutes par un mordant, mélange d une solution de 5o gr. d acic c phéniqué pur et de l\ o gr. de tannin dans 100 gi. i eau, avec une solution de 2 gr. 5 de fuchsine basique dans 100 cc. d’alcool absolu. On lave et on colore ( i-5 minutes) par une solution contenant, pour 100 cc. d’eau distillée, 10 cc. de violet de gentiane en solution alcoolique concentrée et 5 cc. d’acide phéniqué.

On lave à l’eau, on sèche et on monte.

Il 11’est pas jusqu’au bleu de méthylène, le plus banal des colorants de laboratoire, qui ne puisse sei\ii a déceler le tréponème sur frottis. En solution aqueuse,

agissant pendant trois minutes, il a paru à Launois et Læderich déceler le tréponème aussi bien que les colorants dits spécifiques; il en fut de même, entre les mains de Simonelli et Bandi (55a), de sa solution alcoolique légèrement chauffée, et, entre celles d’Oppenheim et Sachs, du bleu de méthylène polychrome. Enfin, le bleu de méthylène alcalin de Lojjler, chauffé dans un verre de montre jusqu’à émission de vapeurs, puis laissé à colorer les frottis pendant quatre heures, a voulu justifier une fois de plus, par les bons résultats qu’il a donnés à Weitlaner, sa réputation de colorant universel. Faut-il rappeler enfin que c’est avec le bleu de méthylène phéniqué de Küline et le violet de gentiane phéniqué de Nicolle, que Bordet et Gengou. près de trois ans avant Schaudinn, ont vu le tréponème pâle ?

Parmi les derniers colorants de ce microorganisme , que nous avons encore à énumérer, nous n’insisterons plus guère que sur un seul, le violet de crêsyle, avec lequel Davidsohn a su réaliser un procédé de coloration extrêmement simple et pratique.

Le violet de crésyle « R extra », de la fabrique de couleurs de Mülheim, est une poudre dont il suffit de mettre une bonne pointe de couteau dans ioo ce. d’eau, de façon à ce qu’il en reste un petit excès au fond du verre. Le frottis fixé est laissé une demi-heure dans la solution fraîchement filtrée (en f\o heures, la coloration n'est pas plus intense) ; on sèche et on monte dans le baume. — 100 ce. de cette solution reviennent environ à six Centimes.

Signalons encore la solution aqueuse au i/iooo«me de Ndblau B B et BR. à parties égales, donnée par Herxheimer (ado); celle de Nilblau BR seul ou de

Capriblau (même dilution), à laquelle Herxheimer et Hübner ont été amenés par des considérations théoriques, et qui nécessitent de seize a vingt-quatre heures de coloration; disons que Moncorvo et Yasconcellos ont coloré, avec des solutions hydroalcooliques à i % de safranine ou de violet- dahlia , des organismes qui oe sont peut-être pas identiques a 7 repohema pallidiwi (Meirelles , Terra), que Nicolas, Favre et André ont obtenu des résultats positifs avec le violet hexamêthyle , Oppenheim et Sachs avec la soin lion de Plehn pour la malaria, et terminons enfin en indiquant que Mulzer (4o3) a réussi l’imprégnation des ilagelles du tréponème en leur appliquant le jirocedé a l argent de Welke, ce qui nous amène ainsi à parler de 1 emploi de ces méthodes à l’argent pour 1 imprégnation du tréponème sur coupes.

c. — Imprégnation sur coupes.

Les méthodes à l’argent sont en effet les seules qui permettent en pratique de mettre en évidence le tréponème dans les coupes de tissus. D autres ont été essayées, mais généralement en vain exception laite de la coloration prolongée au ISilblau, suivie de déshydratation à l’alcool de la coupe, éclaircie ensuite à l’essence de girofle, qui permit a Herxheimer de îéaüser pour la première lois la coloration du treponeme dans une coupe (Herxheimer et Hübner). Au bout de peu de temps d’ailleurs, sous l’action de l’essence de

i Bertarelli , Volpino et Bovero : G te m. va . fuchsine phéniciuée, bleu de méthylène, bleu polychrome. Reischauer : Méthode de Sternhercf-Giemsa.

girofle , les tréponèmes pâlissaient et devenaient bientôt invisibles (Herxheimer et Opificius) , et ce cas présenta encore cette antre singularité d’être resté le seul où le tréponème ait pu être mis en évidence sur coupe sans l’emploi de l’argent.

Trois procédés principaux sont utilisés aujourd’hui pour l’imprégnation des tréponèmes dans les tissus : ce sont ceux de Bertarelli, Yolpino et Bovero, Levaditi, et Levadili et Manouélian.

Sous sa forme améliorée donnée par Bertarelli et Yolpino (48 bis) , la méthode de Bertarelli, Volpino et Bovero , dérivée de celle de van Ermenghem , pour l’imprégnation des cils des bactéries, comporte les phases suivantes :

i° Fixation dans l'alcool de fragments de tissus ne dépassant pas o,G-o, 7 mm. d'épaisseur b — 2° Séjour de 3-

4 jours dans un bain contenant pour 5o cc. d’eau distillée et 5o cc. d’alcool à 96", 1 gr. 5o d’azotate d’argent et 4-

5 gouttes d’acide acétique pur. — 3° Lavages répétés à l’eau distillée. — 4" Séjour de 24 heures à la température de la chambre dans le réducteur de Van Ermenghem (tannin, 3 gr. ; acide gallique, 5 gr. ; acétate de soude, 10 gr. ; eau distillée, 35o gr. — 5° Lavage soigneux à l’eau distillée. — 6° Alcool, chloroforme, parafline, coupes de o,3- 0,7 [j.. Les tréponèmes apparaissent en noir sur fond jaune.

Ce qu’on reproche généralement à cette méthode est une insuffisante imprégnation des tréponèmes, ainsi que la formation de précipités, contre lesquels Hoffmann (a5o) a préconisé l’emploi du chlorure d’or.

1 Recommandation générale : dans toutes les méthodes à l’argent, n’employer que des fragments peu épais, sans quoi l’imprégnation ne serait complète qu’à leur surface, et l’examen des coupes en série donnerait l’illusion d’une moindre richesse en tréponèmes au centre qu’à la périphérie.

Quoi qu’il eu soit, celle de Levaditi (o3o, o33) , dérivée de celle de Ramon y Cajal, pour 1 imprégnation des fibrilles nerveuses, est beaucoup plus souvent employée.

Méthode. — i° Fixation des fragments, de i mm. d’épaisseur environ, dans le formol à 10 °/0, pendant it\ heures. — 2° Lavage et durcissement dans 1 alcool à 96°, pendant 2/j heures. — 3° Lavage à l’eau distillée pendant quelques minutes jusqu’à ce que les fragments tombent au fond du récipient. — 4U Imprégnation laite a 38" et prolongée 3-5 jours, suivant les tissus, dans une solution de nitrate d’argent, dont la concentration varie de 1,0 a o /„ (cette dernière pour pièces de biopsie). — 5° Court lavage a l’eau distillée et réduction ultérieure à la température de la chambre, par la solution suivante :

Acide pyrogallique . de 2 à 4 °/0

Formol 5 cc-

Eau distillée —

6° Lavage à l’eau distillée, déshydratation a 1 alcool , xylol, paraffine et coupes (5 g au maximum). — 7" Coloration de fond par l’un des procédés suivants : a) mélange de Giemsa pendant quelques minutes, lavage à 1 eau, différenciation a l’alcool absolu additionné de quelques gouttes d essence de girofle, éclaircissement à l’essence de bergamote et au xylol ; baume; b) solution concentrée de bleu de toluidine, dillérenciation à l'alcool additionné de quelques gouttes de mélange éther-glycérine (Unna) ; éclaircissement à l’essence de bergamote, xylol, baume (Manouélian). — - Les tréponèmes viennent en noir, les noyaux cellulaires en bleu , la substance fondamentale du tissu conjonctif en vert.

Ce procédé donne de très bons résultats , mais nécessite une imprégnation prolongée dans le nitrate d’argent, sans mettre, malgré cela, en évidence tous les tréponèmes d’une coupe.

La méthode de Levaditi et Manouèlian (33 7) remédie à ces inconvénients en utilisant la pyridine, substance qui possède le pouvoir de pénétrer rapidement dans les tissus imbibés d’eau . et qui a pu être ainsi employée comme véhicule destiné à faciliter la pénétration du sel d’argent dans les tissus.

Méthode. — î° Fixation des fragments de 1 à 2 mm. d’épaisseur, pendant 24-48 heures, dans une solution de formaline à 10 °/0. — a° Lavage à l’alcool (96°) pendant 12 à i(i heures. — 3“ Lavage à l’eau distillée jusqu’à ce (pie les pièces tombent au fond du récipient. — 4° imprégnation par une solution de nitrate d’argent à 1 °/0 , à laquelle on ajoute, au moment de l’emploi, 10 °/0 de pyridine (Cogit ou Bidault). Les flacons bouchés à l’émeri, contenant une assez grande quantité de ce mélange, sont maintenus 2-3 heures à la température de la chambre, 4- 6 heures à environ 5o° (temps de séjour dans le nitrate, variable suivant la perméabilité des organes). — 5° Lavage très rapide avec une solution de pyridine à 10 °/0. — G" Réduction par une solution d’acide pyrogallique à 4 °/0 à laquelle on ajoute, au moment de l’emploi, 10 °/(l d’acétone purifiée (5G/58) et i5 °/0 du volume total de pyridine. La réduction s’opèi'c déjà au bout de quelques heures. — 70 Alcool, xvlol, paraffine et coupes. Les coupes sont colorées au bleu de Unna ou au bleu de toluidine, et différenciées à l’aide du mélange éther-glycérine de Unna.

Les tréponèmes, de beaucoup plus nombreux que dans les préparations par l’ancien procédé, apparaissent en noir plus ou moins foncé, les tissus en jaune pâle; en outre, la double coloration permet d’apprécier les rapports entre les tréponèmes et les éléments cellulaires.

Pour être complet, il nous faut encore dire quelques mots de trois autres méthodes de coloration sur coupe. Celle de Mannesco et Mmea, simple variante de celle de Levaditi. s’inspire du procédé à l’ammoniaque

de Cajal. Celle de Petresco ulilise les bains argentiques de concentration croissante, et la lumière diffuse du jour y sert de réducteur; elle ne semble pas avoir été contrôlée, La dernière, enfin, a été employée par Juliusberg et Kaiser, qui ont réussi, sur des coupes par congélation, par la méthode de Bielschowsky , à mettre déjà en évidence, au bout de cinq minutes, des tréponèmes colorés en noir, se détachant parfaitement sur fond blanc [Neisser (/jo8-4o9)] h

d. — Coloration du tréponème dans le sang.

La rareté du tréponème dans le sang et I intérêt qu y présente sa recherche méritent qu on accorde a cette dernière une attention spéciale.

Si l’on ne dispose que de quelques gouttes de sang, recueillies par piqûre de la peau . le plus simple est de ne faire qu’un frottis au Giemsa ou au Manno : nombreux seront alors les échecs, tant a cause de la rarete du tréponème dans le sang que de la petite quantité du matériel examiné.

Si au contraire l’on a prélevé dans une veine du pli du coude un ou plusieurs centimètres cubes de sang, on pourra, après un traitement préalable que nous allons indiquer, les centrifuger, et les chances de succès seront ainsi très augmentées : tel est le principe des deux méthodes de Nattan-Larrier et Bergeron. et de Noeggerath et Stœhelin.

1 II est intéressant de noter que la méthode à 1 argent^ permet de déceler le tréponème même dans des pièces conservées dans le formol depuis fort longtemps : 3 mois [ Gierke (202) ], 4 mois [ Levaditi (333)], un an [Blaschko (60)]. 2 ans [Ravaut et Ponselle, Gierke (202), Reuter (490)], 7 ans [Paschen (445)].

La méthode de Nallan- Larrier et Bergeron, qui ne semble d’ailleurs pas avoir été vérifiée par d’autres expérimentateurs, utilise la technique suivante, que nous ne ferons que résumer :

5 cc. de sang sont hydro- hémolyses par mélange dans un flacon avec roo cc. d’eau distillée stérile, puis centrifugés. Le culot est étalé sur lames, en couche aussi mince que possible, la préparation séchée par quelques minutes d’étuve à 37°, puis fixée par l’alcool -éther. Comme, malgré tout, l’étalement forme une couche albumineuse d’une épaisseur appréciable, les auteurs ont pensé qu’il fallait traiter celleci comme une coupe histologique , et ont employé à cet effet soit la technique de \art Ermenghem à l’argent, soit celle de Heidcnhain à l’alun de fer, cpii ont l’une et l’autre donné de bons résultats.

« Aucune de ces deux méthodes, ajoutent cependant les auteurs, n’est parfaite; elles exigent des examens très minutieux et un œil exercé; mais elles donnent des résultats suffisants pour ne laisser aucun doute sur l'interprétation des figures. »

Beaucoup plus simple est la méthode de Nœggerath et Stœhelin, dans laquelle on décolore préalablement les globules rouges par l’acide acétique étendu :

On prélève au moins 1 cc. de sang (d’une veine ou d’un lobule de l’oreille), qu’on additionne de 10 volumes d’acide acétique à 1 j'S °/0. On centrifuge et on colore parle Giemsa.

C est cette méthode qu’on emploie toujours aujourd’hui, chaque lois cpie l’on a prélevé assez de sang pour pouvoir centrifuger.