III. — Technique de la «T yrosino-réaction » des crachats

Si quelques points de détail ont été élucidés après lui, c’est à M. Monceaux que revient l'honneur d'avoir le premier donné la technique exacte de la Tyrosino-réaction des crachats.

On recueille l’expectoration dans un récipient très propre, stérile autant que possible. Lors des premiers travaux sur la question, on faisait appel à des crachats de vingt-quatre heures; mais MM. Fiessinger et Blum, comme nous l'avons dit plus haut, recommandent d'opérer sur des crachats plus récents, quatre heures à peine, afin que toute cause d’erreur due à des microbes de souillure ne vienne entacher la réaction. On élimine les crachats sanglants et on veille également à ce qu'aucun antiseplique (phénol, gaicol, créosote ou leurs dérivés) n'ait été utilisé, soit en potion ou gargarisme, soit en inhalation ou n'ait servi à la désinfection du récipient; ces corps pouvant donner avec les ferments oxydants des réactions colorées.

Puis on additionne les crachats du double de leur volume d’eau bouillante et on les triture soigneusement avec un agitateur en verre pour dissoudre la tyrosine très peu soluble dans l'eau. Après dix minutes de contact on filtre. Comme la filtration est, en général, très longue et que plus particulièrement les dernières gouttes du filtrat sont riches en tyrosine, on laisse filtrer environ pendant douze heures. On fait du filtrat deux

parties égales que l'on verse dans deux tubes à essais à ouverture aussi large que possible afin d'augmenter le contact avec l'oxygène de l'air; puis on ajoute dans le tube n° 1, goutte à goulle, en ayant soin d’agiter afin de rendre le mélange plus homogène, de la macération glycérinée de « Russula delica », dans la proportion de I goutte par ce. de filtrat. On abandonne la réaction à elle-même pendant vingt-quatre heures dans l'obscurité, et cela à la température du laboratoire. Au bout d'un temps variable avec la teneur en tyrosine apparaît une coloralion brun clair qui, dans certains cas, va Jusqu'au brun très foncé. Au cas de réaction négative aucune coloration n'apparait. Et cela même sur une toute petite quantité de filtrat, 2 à 3 cc.

Pour lire la réaction, on regardera le tube par transparence et sur fond blanc. Si au bout de vingt-quatre heures la teinte brune n'apparaît pas nettement et qu'on hésite entre une réaction faiblement positive el une réaction négative, on ajoutera alors dans le tube n° 2 autant de gouttes de macération glycérinée que dans le n° 1. Si les teintes dans les deux tubes sont identiques, la réaction est négative; dans le cas contraire, le premier échantillon est plus foncé que le second.

\ Enfin une dernière précaution est à prendre, c’est celle de-

vérifier de temps à autre l’activité du réactif, c’est-à-dire de la macération glycérinée de Russule, soit avec une solution aqueuse de tyrosine à 0,50 p. 1.009, soitavec de l’eau gaïcolée, comme nous l'avons dit plus haut. Il est bien entendu que cette macération doit être conservée dans un flacon en verre jaune bouché à l'émeri et dont on fait toujours le plein avec des perles de verre.

À quoi est due l'intensité de la coloration? Logiquement, si la thèse de MM. Pissavy et Monceaux est exacte, elle devrait être, en raison directe soit de la quantité, soit de la qualité diastasique des bacilles de Koch dans l’expectoration. Qu pour être du même avis que MM. Fiessinger et Blum en raison directe du nombre et de l'efficacité proléotysante des polynucléaires. IL semble bien, d'après les travaux récents de deux auteurs,

MM. Stanley-Raper et Arthur Wormall, qu’un facteur impor-

lant doit entrer aussi en ligne de compte : l’alcalinité, la neutralité ou l'acidité plus ou moins grande du milieu.

but

ZAR SQ ee

Nous lisons dans The Biochemical Journal, 1923, vol. XVII, n® 4 et 5, à l’article « The tyrosinase, tyrosine-reaction By. Stanly Raper et Arthur Wormall », le passage suivant :

« The hydrion concentration of the medium has à marked influence on the velocity of the oxidation of lyrosine by tyrosinase and an even grealer influence onthe nalure ofthe pigment produced. The limits of PH belween which potalo-(yrosinase acts upon tyrosine are 5 and 10. In the neulral and acid solutions the main productduring the first six hoursis the «red substance » lut in alkaline solulions the conversion of into « melanin » is {ho,rapid that solution quickly darking and the preliminary reddening is not very marked. »

« La concentration acide du milieu a une influence marquée sur la rapidité de l'oxydation de la tyrosine par la lyrosinase, et même une très grande influence sur la nature du pigment produit. Les limites de P' entre lesquelles la lyrosinase de pomme de terre agit sur la lyrosine sont 5 et 10. Dans les solutions neutres et acides, le produit principal durant les six premières heures est la « substance rouge », mais dans les solu- Hons alcalines, la transformation de celui-ci en mélanine est si rapide que la solution noircit rapidement et le rougissement préliminaire n’est pas très marqué. »

On remarquera que ces auteurs ne s'adressent plus à la tyrosinase du suc de Russule, mais à celle de suc du lubercules de pommes de terre.

Mais qu'est-ce que ce PH? PH définit une activité diastasique qui est proportionnelle au degré d'ionisation du milieu. Exemple : si on met en solution dans l’eau de l'acide chlorhydrique, mais toujours en solution très diluée, HClest dissociée en ses ions et le PH du milieu qui représente son pouvoir diastasique est proporlionnel au nombre de « CI » chargés d'électricité négative et de«H» chargés d'électricité positive qui sont libérés.

Il en serait de même pour une solution de soude ou de NaCl. Comment mesure-t-on les PH? On sait que les solutions d’électrolytes sont d'autant plus conductrices que Les corps sont plus ionisés dans la solution. La mesure de PE se réduit donc à une.

mesure de conducübilité électrique ou de son inverse, la résistance au passage du courant.

La partie expérimentale de l'article du Biochemical Journal nous confirme bien quee’est entrele PH$ et le PH10 que la tyrosinase de pomme de terre agit sur la tyrosine.

PH-4-0 Pas d'oxydation apparente, c'est-à-dire aucun change-

ment de couleur.

PH-5-0 Très petite oxydation couleur rouge légère après cinq où six beures.

P4-6-0 Oxydalion rapide, couleur rouge foncé après une heure, devenant rouge intense après trois ou quatre heures. Au bout de vingt-quatre heures, lasolution est devenue plus sombre quoique la phase rouge soit encore très évidente.

P#-7-0 Rapide oxydation.

P#-8-0 Après une heure, la solution a une couleur rouge qui devient graduellement plus noire et plus intense. Le noircissement consécutif et la formation de inélanine était plus rapide que dans une solution à PH-7,

PH%-0 Noircissement léger avec une pelite coloration rouge après deux heures.

PH100 Très pelite oxydation.

PH10$ PH41-0 PH420 Pas d’oxydation apparente.