COLORATION DES BACTÉRIES. — IIÉMATOXYLINE, IODE

continuent un certain temps, vingt-quatre heures, par exemple, pour les bacilles en virgule du choléra; leur protoplasma est vivant, élastique, et malgré la coloration, certaines vivent et se développent. On peut étudier ce développement en chautTant la platine du microscope à 33». On apprécie très bien la diflërence de couleur entre le protoplasma et les grains plus colorés. En un mot celte étude des bactéries colorées entre les deux lamelles à l'étal frais donne des renseignements très exacts sur leur physiologie et sur leur manière d'être dans les cultures et les tissus. Le mouvement de certaines bactéries s'arrête quelques secondes ou quelques minutes après qu'elles ont été teintes par les couleurs d'aniline.

Les procédés de teinture des coupes de pièces durcies et de liquides desséchés en minces couches sur les lamelles sont très avantageux pour l'élude des bactéries; mais on ne peut voir de cette façon leurs mouvements. De plus les bactéries sont rétractées par leur séjour dans l'alcool.

Les différentes couleurs employées sont :

(a) Le CARMIN', qui colore en rouge pâle certains microbes ronds. Le carmin aluné ou boraté colore mieux que le picrocarminate les microbes arrondis, par exemple ceux de la pyémie. On prépare le carmin boraté de la façon suivante d'après Grenacher. A une solution de borax à 4 pour 100 d'eau distillée, on ajoute 4 pour 100 de bon carmin et on chauffe deux fois jusqu'à l'ébullition. On ajoute au liquide chaud une quantité égale d'alcool à 70". On laisse reposer pendant cinq jours et on filtre.

Pour se servir de ce liquide on y laisse les coupes pendant une minute, on les lave dans l'alcool faible additionné d'une solution à 2 pour 1000 d'acide chlorhydrique, puis on les monte dans le baume après les avoir fait passer par l'alcool et par l'essence de girofle. Nous verrons bientôt que le picrocarminate d'ammoniaque, tel que le prépare Ranvier, est un des meilleurs agents pour obtenir une double coloration des coupes.

(6) L'iiÉMAToxYLiNK.Cet agent, tel qu'il est préparé suivant le procédé de Ranvier, colore mieux que le carmin tous les microbes ronds, mais n'a généralement pas d'action sur les bacilles et sur les autres bactéries. L'hématoxyline pure (sans alun) a été employée en solution concentrée, par Koch, pour colorer le tlagellura des bactéries. Celui-ci ne se colore pas par les couleurs d'aniline, qui, au contraire, colorent le protoplasma des micro-organismes.

(c) L'iode dissous dans une solution d'iodure de potassium sort à teindre le protoplasma du bacillus amylobacler et des autres bactéries qui possèdent la réaction de l'amidon. Il est utile pour l'étude des champignons des moisissures.

74 TECHNIQUE IIISTOLOGIQUE.

La solution d'iodure de potassium iodé (1 gramme d'iodure de potassium pour 20 grammes d'eau avec addition d'iode métallique à saturation) sert à fixer les couleurs d'aniline sur les micro-organismes, de telle sorte que l'alcool employé ensuite décolore les tissus colorés par l'aniline, tandis que les bactéries restent colorées (procédé de Gram),

(d) Couleurs d'aniline. — On peut distinguer deux espèces de couleurs d'aniline, les unes dont le principe colorant est alcalin comme les dérivés de rosaniline (fuchsine, violet de méthyl, de gentiane, etc.), de triphényl de rosaniline (safranine, magdala, brun de Bismark, etc.), et les couleurs acides, comme l'éosine, la purpurine, la coccinine, le noir d'aniline, etc. Ces couleurs sont employées en solution aqueuse ou en solution alcoolique faible.

Pour s'assurer qu'on a affaire à des couleurs pures, on étale des poussières de ces couleurs sur du papier à filtre. On mouille la surface opposée du papier et on voit souvent apparaître alors des points de couleur différente (Ehrlich). En examinant à la loupe par exemple, on reconnaît que les violets sont souvent mêlés avec du bleu, du rouge, du vert, etc.

Violet de méthyl et de gentiane dans une solution d'huile d'aniline. — Les couleurs que nous avons le plus employées sont le violet de méthyl B (de Bâle), le violet 6 B et le violet de gentiane en solution aqueuse. Il est préférable de se servir, au lieu d'eau pure, pour dissoudre la couleur, d'une solution aqueuse d'huile d'aniline (3 grammes d'huile d'aniline pour 100 grammes d'eau distillée), qu'on agite et qu'on filtre. Ona,joute alors 11p. 100 d'une solution alcoolique concentrée du violet etlO p. 100 d'alcool absolu. On laisse dans celte solution les lamelles et les coupes pendant un temps variable suivant les bactéries qu'on veut étudier.

On emploie ensuite l'un des trois procédés suivants :

(1) Les objets colorés sont lavés rapidement à l'eau distillée, puis décolorés dans l'alcool pur jusqu'à ce qu'ils deviennent presque incolores. On les traite ensuite par l'essence de girofle, et on les monte dans le baume. Par ce procédé les noyaux restent colorés, ainsi que beaucoup de bactéries; les capsules des bactéries de la pneumonie sont aussi colorées.

(2) Lorsque les objets ont été colorés par un séjour d'un quart d'heure dans le bain colorant, on les place pendant quelques minutes dans la solution d'iodure de potassium iodé (Gram), composée ainsi qu'il suit :

Iode

lodure de potassium.

Eau distillée

1 gramme.

Us y deviennent brun foncé. On les décolore ensuite par l'alcool pur, puis

COLORATION DES BACTÉRIES. — VIOLET DE MÉTRYL ET DE GENTIANE. 7o

on achève leur déshyilratalion k l'essence de girofle et on monte dans le baume.

(3) On place les coupes dans un bain de violet de méthyl ou de gentiane pendant quelques heures. On les lave à l'eau distillée et on les place pendant une minute dans une solution de bichlorure de mercure à 1 p. 100 d'eau distillée, avec addition d'une quantité d'alcool suffisante pour dissoudre le bichlorure. On lave à l'eau distillée, puis à l'alcool absolu. Les bactéries restent alors seules colorées, de même qu'après l'action de la solution iodée. On achève la déshydratation dans l'essence de girofle et on monte dans le baume. Gram a montré au congrès de Copenhague (1884 de très belles préparations des bactéries de la flèvre typhoïde obtenues par ce procédé, que nous avons employé depuis avec avantage.

Les préparations décolorés par l'alcool sont éclaircies par l'huile de bergamote ou par l'essence de girofle.

Les préparations traitées par le procédé de Gram avec la solution iodée sont très instructives. Tout est devenu incolore à l'exception des bactéries. On peut voir ainsi presque toutes les bactéries, celles de la tuberculose, de la lèpre, du choléra, etc. Mais la méthode de Gram est surtout excellente pour colorer les bacilles de la septicémie des souris, de l'œdème malin et du charbon, les bactéries du rhinosclérome, de la diphtérie, les streptococci de l'érysipèle et du phlegmon, les staphylococci de la suppuration. Dans la plupart de ces maladies il suffît de laisser les coupes un quart d'heure dans le bain colorant, mais pour d'autres, comme le rhinosclérome, il est nécessaire de les faire séjourner pendant 24 ou 48 heures.

Il est facile d'obtenir une double coloration des coupes en donnant aux cellules et aux fibres une couleur rouge, tandis que les bactéries restent violettes, ou inversement. On emploie à cet effet plusieurs procédés :

Après la coloration dans le bain violet et le séjour pendant une minute dans la solution iodée, on lave dans l'eau ou l'alcool faible, on place les préparations pendant quelques minutes dans la safrauiile, le picrocarminate, l'éosine ou la coccinine, puis on les éclaircit dans l'alcool pur et l'essence de girofle, et on monte dans le baume. N"ous avons constaté les bons effets de la safranine qui colore à' peine les bacilles et qui donne au tissu une couleur très brillante.

La coloration au picro-carminate d'ammoniaque est aussi excellente en ce sens, qu'on peut obtenir une élection très nette du carmin sur les noyaux des cellules, tandis que les fibres sont plus pîiles ainsi que le protoplasma, et que les globules du sang restent jaune-verdàtre.

Violet de méthyl et de gentiane en solution aqueuse. — Le moyen le plus

76 TECHNIQUE HISTOLOGIQUE

simple tréludier les bactéries consiste à mettre une goutte du liquide qui les contient sur une lamelle, à le laisser dessécher à moitié, puis à colorer la lamelle avec une goutte d'une solution faible de violet de méthyl (solution concentrée 1, eau distillée; voyez page 72). On renverse ensuite la lamelle sur le porte-objet et on examine avec une lentille à immersion homogène. Un autre procédé consiste à placer pendant vingt-quatre heures les coupes dans une solution concentrée de violet; on lave ensuite dans l'eau, dans l'alcool et l'essence de girofle. Si la coloration est très intense, on peut laisser les préparations pendant deux ou trois jours dans l'alcool et l'essence de girofle. Par ce procédé, les noyaux sont colorés en même temps que les bactéries, surtout ceux qui sont en voie de multiplication, aussi bien que les débris de noyaux, les boules hyalines, l'éléïdine, la fibrine, les granulations élémentaires du sang, les globules blancs et môme certains globules rouges.

Le violet de méthyl en solution aqueuse réussit également bien dans la recherche des bacilles de la tuberculose et de la lèpre. On laisse alors les lamelles pendant plusieurs heures dans la solution concentrée de violet B, on décolore ensuite rapidement par l'acide nitrique ou chlorhydrique au quart et on lave dans l'eau distillée. On laisse sécher les lamelles et on les monte dans le baume. Les coupes sont traitées successivement par l'alcool, l'essence de girofle et le baimie.

On peut obtenir assez rapidement des préparations de bacilles colorés. Ainsi, une lamelle sur laquelle on a fait dessécher un liquide, mise pendant quelques minutes dans une solution concentrée de violet de méthyl à 60°, puis lavée rapidement dans l'eau distillée, est placée pendant une minute dans la solution iodée. On la lave, puis on déshydrate à l'alcool, à l'essence et on monte dans le baume. En sortant la lamelle de la solution d'iode, on peut la colorer par le séjour dans l'éosine pendant une minute et on obtient ainsi une double coloration. Les coupes doivent rester au moins une demi-heure dans la solution concentrée et chaude du même violet de méthyl.

Méthode d'Ehrlich. — Cette méthode bien connue consiste à mettre les coupes ou lamelles dans une solution d'huile d'aniline et de violet de méthyl ou de fuchsine préparée, comme cela a été indiqué ci-dessus, puis à décolorer rapidement dans de l'acide nitrique au tiers.

On peut, pour préparer la solution d'huile d'aniline, faire chauffer de l'eau distillée, dans laquelle on a ajouté I pour 10 d'huile d'aniline ou de toluidine, paratoluidine, ou orlhololuidine, ce qu'un de nous a indiqué le premier (1). On filtre, on ajoute 10 p. 100 d'alcool absolu et 11 p. 100 d'une

(1) Babes. Etude sur les bactéries de la lÀpre et de la tuberculose. Comptes reDdus de l'Acad. dcs&c, avril 1883.