SUBSTANCES GÉLATINISÉES EMPLOYÉES POUR LES CULTURES

Les tubes elles pelils inalras étant remplis, U faut encore s'assurer que le liquide qu'ils contiennent est bien stérilisé. Il convient alors de les laisser pendant plusieurs jours à 33° dans la grande étuve en bois à double paroi fabriquée par Wisnegg sur les indications de Pasteur ou dans une étuve d'Arsonval. Nous donnons plus loin la description de ces appareils.

MÉTHODES PLUS HÉCENTEs. — Dcpuis Ics premiers travaux de Pasteur, un grand nombre de botanistes, de physiologistes et de pathologistes ont apporté leur contingent à la technique des cultures, de telle sorte que les procédés ont été modifiés, simplifiés et perfectionnés.

Tels sont les procédés de culture sur des sub.stances gélatinisées, sur les pommes de terre, etc., imaginés par Brefeld, Grawilz, Koch; tel est l'emploi des lames de veiTe, sur lesquelles on étend les substances gélatinisées qu'on ensemence de bactéries ; des cristallisoirs et des cloches de verre où l'on enferme ces lames pour obtenir des cultures.

Dans ces méthodes, il faut toujours commencer par bien laver d'abord, puis stériliser tous les instruments, verres, cristallisoirs, cloches, lames de verre, couteaux, etc., en les portant pendant une demi-heure à la température de loO" dans l'air sec. Les instruments, les couteaux, aiguilles, pinces, etc., sont enfermés dans une boîte de fer à claire voie, dont le fond est couvert d'une feuille d'amiante, dont le couvercle est surmonté d'une poignée. Celte boite est placée dans la coi'beille du fourneau à gaz de la figure 6 (p. 89), avec la verrerie.

Pour stériliser avec la vapeur d'eau, on emploie un poêle cylindrique (fig. 16) entouré de feutre, dont le quart inférieur est rempli d'eau. Audessus du niveau du liquide se trouve une grille sur laquelle on place un panier grillagé contenant les tubes et flacons remplis de la substance gélatinisée ou des pommes de terre qu'on veut stériliser. L'eau est chauffée par un bec à gaz. Le poêle est fermé à sa partie supérieure par un couvercle qui laisse passer un thermomètre. Le thermomètre doit marquer 100" au moment où on introduit les substances.

Bouillons et substances gélatinisés employés pour les cultures. — Nous avons étudié déjà les conditions variées de l'e.Kistence des bactéries; les unes, aérobies ou aérophiles, vivent uniquement dans les milieux aérés pourvus d'une quantité plus ou moins grande d'oxygène ; les autres, anaérobies, comme certains ferments, se développent de préférence dans les milieux dépourvus d'oxygène. Certaines n'ont besoin que d'aliments hydro-carbonés, tandis que la nutrition de la plupart nécessite des aliments azotés. Un petit nombre d'entre elles fruclilienl dans un liquide

MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

acidifié, tandis que presque toutes ont besoin d'un milieu neutre ou alcalin. Ces diverses conditions de vie doivent être satisfaites dans les cultures artificielles.

Nous avons déjà indiqué le mode de préparation des infusions et bouillons employés par Pasteur et qu'on rend neutres ou alcalins en ajoutant des sels basiques.

Cohn s'est servi d'un liquide dans lequel, pour 20 grammes d'eau distillée, il mettait Qb'',! de phosphate de potasse, O^"",! de sulfate de magnésie, de phosphate de chaux tribasique elO^^,2 d'acide tarlrique.

Nœgeli recommande divers hquides, et en particulier celui-ci : eau 100 grammes, albumine soluble 1 gramme, phosphate de potasse 0s'',2, sulfate de magnésium 0b'',04, et chlorate de chaux 0e'",02. Souvent on emploie des solutions albumineuses contenant une quantité déterminée de sucre, d'amidon, d'acides gras, etc.

Lorsque ces différents liquides ont reçu des particules contenant des bactéries, celles-ci se développent sous forme de nuages, de flocons, de sédiments au fond du hquide et de peUicules à sa surface. Mais les différentes espèces de bactéries qui y pullulent se mêlent les unes aux autres, et il est difficile de les séparer pour obtenir isolément des cultures pures d une espèce déterminée. On y arrive mieux en employant des substances nutritives semi-solides ou solides, car le fragment contenant des bactéries, inoculé sur ces substances, donne lieu à des fructifications qui restent à leur surface au point touché, ou qui pénétrent dans la profondeur en présentant une forme souvent caractéristique.

Aussi ce fut un véritable progrès que la culture sur les substances nutritives solides. Depuis longtemps on s'était servi des œufs, des tranches de pommes de terre et de carottes; mais ce sont surtout la gélatine employée par Brefeld et Klebs, l'agar agar mêlés avec des peptones,le sérum de sang de bœuf gélatinisé préparé par Tyndall et Koch (I), qui sont le plus utiles, car leur transparence permet d'apprécier la couleur et la forme des cultures dans leur profondeur comme à leur surface. Ces difTérentes préparations ont été employées avec le plus grand succès par Koch, qui a perfectionné et généralisé la méthode de culture sur les milieux sohdes. Il a employé le premier les cultures transparentes et solidifiées pour isoler les différents germes.

Pour préparer les pommes de terre en vue des cultures, on les choisit assez grosses et à surface bien hsse. On les nettoie 'd'abord avec une brosse, on enlève avec un couteau les bourgeons et les parties altérées; on les place ensuite pendant une heure dans une solution de sublimé

(1) Mittheilungen d. k. Gesundheislamte, 1. 1 et t. II. — Deut. Med. Wochenschrift, 1884, n" 32. — Allgemeine Zeitung v. Mùnchen Deilage, 8 novembre 1884.

SUBSTANCES GÉLATINISÉES.

— GÉLATINE PEPTONIFIÉE.

à i) p. 1000, et enfin on les fait cuire pendant une demi-heure dans une étuve à vapeur. Pour s'en servir, on prend une pomme de terre entre le pouce et l'index de la main gauche qu'on a préalablement lavée au sublimé. On la coupe en deux avec un couteau chauffé au rouge, puis refroidi. On laisse tomber les deux morceaux dans une chambre humide composée d'un grand crislallisoir recouvert d'une cloche. Cette chambre humide a été stérilisée antérieurement. On coupe de même une seconde pomme de terre, de telle sorte qu'on a, au fond du crislallisoir, quatre morceaux que nous désignerons par les chiffres 1, II, lil, IV. Cela fait, on prend avec un couteau stérilisé un peu de la substance qu'on suppose i-enfermer des bactéries; on l'étalé avec un couteau à la surface de section du tronçon I ; on prend avec un autre couteau stérilisé une petite particule de la substance déjà étalée sur la pomme de terre I, et on l'étend sur toute la surface de section de la pomme de terre II. On répète la même opération pour les deux derniers tronçons, si bien que la pomme de terre IV contient très peu de germes.

Beaucoup de bactéries croissent très bien sur les pommes de terre et sur les carottes qu'on prépare de la même façon.

Pour se servir des œufs, on les fait durcir, on enlève la coquille, on les lave au sublimé, on les met de nouveau à l'étuve et on les coupe en deux comme les pommes de terre.

Pourpréparer la gélatine peptonifiée, on mêle bOO grammes de viande dépouillée de graisse et hachée à d litre d'eau distillée. On laisse reposer ce mélange pendant 24 heures en entourant de glace le vase qui le contient. On le passe ensuite dans un linge propre. On obtient de la sorte environ un litre de liquide. Si l'on obtient moins d'un litre, on ajoute de l'eau distillée de façon h compléter un litre. On additionne le liquide de 10 grammes de peplone sèche et de 5 grammes de sel de cuisine; on chauffe jusqu'à l'ébullilion, on filtre et on ajoute 100 grammes de gélatine pure et tout à fait incolore. On chauffe ensuite jusqu'à la dissolution de la gélatine; on neutralise le mélange avec le

Fig. 13. — Filtre pour la gél.itine peplone fabriqué par Wisnegg.

96 MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

carbonate de soucie jusqu'à ce que le papier de tournesol rouge devienne un peu bleuàlre et que le papier de tournesol bleu ne change pas de couleur; on chauffe encore au bain-niarie, dans l'eau bouillante, pendant une demi-heure; on s'assure de nouveau de la réaction légèrement alcaline du liquide, et on filtre enfin dans du papier Joseph et un filtre en verre placé dans le chauffoir métallique à double paroi rempli d'eau chaude (fig. 13). La gélatine est versée directement dans les tubes stérilisés.

La stérilisation des tubes se fait de la manière suivante : on lave les tubes à la solution de sublimé et ensuite à l'eau stérilisée, on les bouche avec de la ouate, puis on les prend par l'extrémité supérieure et on chaulTe fortement le fond sur une flamme d'alcool. On les laisse refroidir, puis on enfonce un peu la ouate et on chauffe leur extrémité supérieure en les tenant parleur fond, jusqu'à ce que la ouate devienne un peu rousse.

Si l'on possède les appareils perfectionnés de nos laboratoires, on lave les tubes à l'eau bouillante, on les bouche à la ouate et on les met pendant une demi-heure dans l'un des appareils représentés figure 6 ou lo, à 150°.

On verse dans chaque tube 10 grammes de gélatine. Avec la quantité de gélatine fabriquée d'après la formule précédente, on doit avoir environ quatre-vingt-dix à quatre-vingt-quinze tubes. Après avoir rempli les tubes, on les bouche de nouveau à la ouate et on les stérilise en les plaçant pendant dix minutes dans une étuve à vapeur chauffée d'abord à 100° et maintenue à cette même température. On les y met de nouveau, pendant le même laps de temps, les deux ou trois jours suivants. Cette gélatine peptonifiée contient 10 p. 100 de gélatine, 1 p. 100 de peplone sèche et 5 p. 1000 de sel de cuisine.

Nous avons employé aussi pour les cultures sur la gélatine les matras de Pasteur; mais ces derniers sont avantageusement modifiés en leur donnant la forme des ballons d'Erlenmeyer, de façon à ce que l'on puisse atteindre toutes les parties du fond du matras avec le fil de platine, soit pour faire les ensemencements, soit pour prendre les cultures qui s'y développent.

Lorsque la gélatine est employée à des cultures, on ne doit pas dépasser la température de 20 à 22°, car elle se liquéfie à une température plus élevée, et on perdrait le bénéfice d'une culture sur une substance solide.

Au lieu de gélatine, on peut employer l'agar agar, dont le grand avantage consiste en ce qu'on peut chauffer la substance gélatinisée par l'agar agar jusqu'à la température de 40° sans qu'elle se liquéfie. L'agar agar peptonisée donne un milieu moins transparent que la gélatine, mais en en mettant une petite quantité, elle est suffisamment transparente. On peut aussi mêler avantageusement l'agar agar avec la gélatine.