AGAR-AGAR. — SÉRUM SANGUIN GÉLÂTINISÉ

La préparation de l'agar-agar s'cITccLuc de la môme façon que la gélatine ; seulement on ajoute au suc de viande 0,o à 1 p. 100 d'agar-agar pulvérisé et 2 p. 100 de gélalino. Pour filtrer, on emploie avantageusement un linge do flanelle sur lequel on fait passer plusieurs fois le liquide. La flltration se fait surtout rapidement dans le vide, et donne un liquide bien clair. Il est bon de laisser gélatiniser obliquement l'agar-agar afin de pouvoir faire l'ensemencement à la fois par une piqûre et par une strie. Les cultures sont ainsi très démonstratives.

Le meilleur milieu de culture pour les bactéries pathogènes est le sérum du sang du bœuf, du mouton et du cheval. Voici le moyen d'obtenir le sérum gélatinisé. On saigne un animal en introduisant dans la veine jugulaire un Irocart stérilisé qui communique avec l'effilure latérale d'un ballon dont le col esl bouché à la ouate, et qui est également stérilisé (voyez fig. 9). On ferme ensuite l'effilure à la lampe. Il est bon de se servir, pour recueillir le sang, de petits ballons de la contenance de

Fig. li. — Appareil iiiKigioé par Kocli pour maintenir inclinées les éprouveltes contenant du sérum pondant la gélalinisalion. Cotte figure et les figures suivantes sont empruntées au catalogue du R. Muenckc, fabricant dos ustensiles spéciaux nécessaires à la culture des bactéries, à Berlin.

300 centimètres cubes. Ce procédé pour recueillir le sang est celui que Pasteur a mis en usage pour démontrer la pureté de ce liquide. Nocart s'en est servi pour fabriquer le sérum gélatinisé. On laisse les ballons au repos pendant un ou deux jours; le caillot se rétracte ; au-dessUs de lui il existe une couche de sérum limpide, représentant jusqu'à 200 grammes de liquide, qu'on verse dans des éprouvettes par l'effilure latérale en soufllanl par le col du ballon. Les éprouvettes bouchées à la ouate sont portées deux ou troisjours successivement à la température de 65° à 08° pendant une hnuro. Puis on gélatinisé leur contenu en les mettant dans un petit appareil inventé par Koch et qui consiste dans une boite carrée de fer-blanc à double fond rempli d'eau cliaufféc, couverte d'une lame de verre (fig. 14). Les éprouvettes y sont très inclinées, de (elle sorte que la surface du sérum soit aussi grande que possible. On chauffe à 70» jusqu'à ce ([u'il soit gélatinisé sans être troublé.

ConNii, KT iiAURS. — 2' dd. 7

MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

Ce procédé de gélatinisation doil durer de une à deux heuros. Le liquide est plus transparent si l'opéralion se fait lentement.

Nous nous sommes convaincus que si l'on prend le sang d'un animal sain avec toutes les précautions voulues, il ne se développe jamais de germes dans les ballons et les éprouvettes. 11 faut néanmoins laisser séjourner pendant plusieurs jours ces dernières, après qu'elles ont été remplies, dans une étuve à 36°, afin de s'assurer de la pureté de la substance.

Voici le procédé de Koch, qui est plus compliqué:

Pouv recueillir le saïuj, il se sert de vases cylindriques de 20 centimètres de

15. — Appareil de Koch pour stériliser l ig. llj. — Appareil à vapeur

les éprouvettes. de Koch.

hauteur sur 8 à 10 cent, de diamètre et fermés par des bouchons de verre. Ce vases, après le lavage, sont rincés avec une solution de sublimé à I p. 100 puis à l'alcool et enfin à l'éther; ce dernier liquide est évaporé à l'étuve. On y recueille le sang au moment où il jaillit de la veine d'un animal. La saignée est faile avec un couteau stérilisé ; la peau de l'animal a été lavée avec une solution au sublimé et on ne recueille pas le premier jet, qui peut contenir des poils et des impuretés. On remplit le vase jusque auprès du bord, on le bouche et on le place aussi vile que possible sur la glace, où il restera 24 à 30 heures pour permettre la formation d'un caillot solide.

Pour que la séparation du sérum et du caillot se fasse bien, il est nécessaire de laisser pendant tout ce temps le vase immobile près du lieu où

PRÉPARATION DU SÉRUM GÉLAÏINISÉ D'APRÈS KOCII.

on a recueilli le sang. Si on le transportait un peu plus loin, le sérum perdrait sa transparence. Le sérum sera pris avec une pipette et versé dans des éprouvettes préalablement stérilisées qu'on remplira au tiers, et qui seront bouchées avec de la ouate.

La stérilisation du séi'iim repose sur ce fait (Tyndall), que les bactéries sont tuées à une température relativement basse, au-dessous de la température de coagulation de l'albumine, tandis que leurs spores résistent. Un premier chaulTage tue les bactéries vivantes, mais leurs spores germent le second jour, le troisième, ou les jours suivants; le chauffage répété une fois tous les jours tuera les bactéries à mesure qu'elles se développent. C'est là le chauffage discontinu. Pour cette opération, on place les éprouvettes dans une étuve cylindrique à double paroi renfermant de l'eau chaude (tîg. 15). La température intérieure de l'étuve sera maintenue àbS", et l'opération sera répétée tous les jours pendant une heure pendant cinq à six jours consécutifs. Cette opération peut s'effectuer au bain-marie. On voit souvent se former sur le sérum stérilisé une pellicule de choleslérine qu'il ne faut pas prendre pour un développement de microbes.

On peut employer le sérum ainsi liquide et stérilisé. Mais lejplus souvent il est préférable de le solidifier.

En agissant exactement d'après celte méthode et surtout en recueillant le sérum assez vite et avec soin, il ne se développe presque jamais de bactéries et l'on peut procédera la gélinatisation sans attendre la stérilisation pendant huit jours.

Il est probable que le caillot qui se sépare du sérum retient les bactéries qui auraient pu entrer dans le sang pendant la saignée.

Pour obtenir la gélatinisation sur une surface aussi étendue que possible, on place les éprouvettes inclinées dans l'étuve aplatie et penchée (fig. J4). Le fond de l'étuve est garni de ouate et un thermomètre placé dans l'étuve sert il apprécier la température. Le point de gôlinatisalion étant de Go", on maintiendra la température au-dessus de OS», et au-dessous de 68", le point de coagulation du sérum étant do 75o. La gélatinisation est plus ou moins rapide suiviint la pi'ovenance du sang. Le sérum de mouton est celui qui se gélatinise le plus vile, le sérum de veau le plus lentement; en moyenne une demi-heure à une heure suffira. Un sérum bien gélatinisé est solide et durcomme du blanc d'œuf durci, do couleur d'ambre, transparent "I un peu lailcux seulement dans sa partie inférieure. L'eau de condensation qui se forme sur les parois de l'éprouvelte pendant le chauffage se réunit au l'oiid du tube, et forme un liquide de culture contenant en dissolution des substances nutritives. Si l'inoculalion a été pratiquée jusqu'à la partie liquide, on aura l'avantage de pouvoir observer en même temps le développement des bactéries sur un milieu solide et liquide.

iOO MÉTHODES DE CULTURR DES BACTÉRIES.

Les parties supérieures de la couche du sérum se desséchent, mais les parties moyennes et inférieures restent bonnes pendant des mois.

Isolement des bactéries à Vétat de pureté. — Pour obtenir des cultures pures, Klebs a employé la culture fractionnée, qui consiste à laisser croître d'abord toute espèce de germes, puis à transporter une petite parcelle du premier liquide dans un autre liquide stérilisé. Dans celui-ci il naît un moins grand nombre de bactéries, et en répétant plusieurs fois cette môme transplantation, on arrive quelquefois, mais non toujours, à voir prédominer l'espèce qui se reproduit le plus abondamment.

Bi'ofeld et Pasteur se sont efforcés de diluer tellement la culture que dans une goutle de liquide il n'y ait pins qu'un ou deux champignons. Bi'cfeld a appliqué cette mélhode à l'étude du baeillus subtilis. Il examine au microscope sur une lamelle une parcelle de liquide dilué et s'assure qu'il n'y a qu'un grand bacille ; puis il ajoute une goutte de gélatine et place la lamelle dans une chambre humide.

Pour isoler les germes, Brefeld fait entrer dans une chambre humide de Kuhne de la gélatine contenant des germes ; il vide la chambre humide ; mais il res'te une mince couche de gélatine adhérente au verre à l'intérieur de la chambre humide. Cette couche contient quelques germes qu'on peut observer isolément au microscope et voir se multiplier.

Un autre procédé employé par Na3geli consiste à diluer le liquide qu'on veut examiner jusqu'à ce qu'on suppose qu'il y ait peu de germes dans la partie qu'on doit ensemencer, ou bien on cultive d'abord et on dilue ensuite la culture qu'on ensemence de nouveau. Mais ces méthodes, livrées au hasard, ne donnent, on le comprend, aucune assui\ancc sur la pureté et sur la nature des cultures obtenues.

Ces méthodes n'ont plus en réalité qu'une valeur historique.

Cohn, en chauffant des bactéries pourvues de spores, a vu que les spores résistaient à des degrés de température variables, mais plus élevés que les bactéries.

Miquel (1) a isolé ainsi un bacille en chauffant le liquide à 108°.

Salomonsen a employé, pour étudier les bactéries de la putréfaction du sang, des tubes capillaires. Il a vu qu'il se développait dans ces tubes des taches noires qui répondent chacune à une colonie. Pour cultiver à l'état de pureté une de ces taches noires, on casse le verre et on l'inocule sur un milieu nutritif.

La seule méthode excellente pour isoler les cultures est celle de Koch, qui se base sur l'emploi des substances nutritives gélatinisées. Dans ce

(1) Bulletin de la Société chimique de Paris, 1879, t. XXXII.

ISOLEMENT DES BACTÉlllES A L'ÉTAT DE PUllETÉ D'APRÈS KOCII. 101

but, on prend une parcelle de la substance à examiner au bout d'une aiguille de platine et on la met dans un tube conlenaiit 10 centimètres cubes de gélatine stérilisée cbauHëe à 30». On agite le liquide pour que la substance soit bien mêlée à la gélatine, et on l'étalé régulièrement sur une lame de verre stérilisée de 10 à lîi centimètres de largeur. Ces lames de verre ont été stérilisées au préalable et conservées dans une boite en fer.

Si l'on n'a pas de lame de verre stérilisée, on en passe une sur une flamme d'alcool de façon à ce que ses deux faces soient bien chauffées.

La lamelle sera placée dans l'appareil suivant : à sa base cet appareil est

■iR. 17. — Appareil dostino à solidifier la gélatine sur les plaques de veiTc; t, trépied dont les pieds sont pourvus de vis; a, plaque de verre avec uu niveau d'eau, v, c, cloeho; n, plaque de verre sur laquelle on a verso la gélatine.

formé d'une table à trépied (fig. 17) sous laquelle on met une cuve remplie de glace recouverte elle-même d'une grande lame de verre. On rend cette lame tout à fait horizontale à l'aide des vis des pieds de la table inférieure, et on apprécie l'horizontalité de la lame de verre à l'aide d'un niveau d'eau.

Lorsqu'on s'est assuré que la grande plaque de verre esl bien horizontale, on y place la lamelle qu'on couvre ensuite de gélatine liquide. On prend soin que cette couciie de gélatine n'atleigne pas le bord de la lame. La

102 MÉTHODES DE CULTURE DES BxVCTÉRIES.

couche de gélatine aura une épaisseur de 2 à 3 niillinièlrcs. On couvre celte lame avec une cloche et on attend la gélatinisation.

Après celte première opération, on met la plaque dans une chambre humide.

Cette chambre humide est composée : 1» d'un crislallisoir de 20 centimètres de diamètre sur une hauteur de b centimètres, au fond duquel

ce»

î'i /) fj'"m"~: fi

Fig. 18. — Clianil)re humide composée d'une cuve renouvcrte d'une cloche et rciifermànt une lame de gélatine semée de diverses cultures; p, plaque de verre; g, gélatine sur laquelle il s'est développé des bactéries de l'air, qui liquéfient la gélatine comme en m ou qui ne la liquéfient pas, m' , c.

on dépose une feuille de papier à filtrer imbibé d'eau distillée stérilisée; 2° d'une cloche qui entoure et recouvre le cristallisoir. Dans le cristallisoir on place de petits bancs de verre ou mieux une petite échelle double sur lesquels on dispose des lames recouvertes de gélatine.

Dans le môme appareil on peut mettre aussi des pommes de terre, de petits cristallisoirs contenant de la gélatine ou du sérum solidifié, le tout bien stérilisé.

Nous avons déjà, parlé des appareils et des expériences de Koch et Hcsse pour étudier les bactéries de l'air et du sol. On peut s'en servir aussi pour la recherche des bactéries pathogènes.

ISOLEMENT DES CULTURES PAK LE PllOCÉDÉ DE KOCIl.

Cette méthode do culture sur des plaques est avantageuse dans certains cas. Mais le plus souvent il est nécessaire de diluer le liquide qu'on ensemence, parce que la gélatine contient tant de germes qu'ils se touchent et se confondent sur la plaque, de telle sorte qu'on ne peut pas les séparer les uns des autres.

Aussi avons-nous employé, dans nos recherches sur le choléra, la méthode suivante : nous avons mis d'abord la petite particule à examiner dans 10 grammes d'eau stérilisée. Après avoir agité cette eau, nous en avons pris une particule au bout d'une aiguille de platine et nous l'avons ensemencée dans un tube plein de gélatine liquide, qui a été ensuite versée sur une lame de la façon décrite ci-dessus.

Koeh, pour bien isoler les bactéries, emploie une méthode encore plus avantageuse. Il prend ordinairement trois tubes de gélatine liquéfiée. Il les distingue avec des étiquettes portant les chillres 0, 2 et 3. Il ensemence le tube 0 avec une particule de la substance à examiner. Il agite le tube, après quoi il ensemence le tube 2 avec un fil de platine courbé en anse qu'il a plongé dans le tube 0. Il ensemence le tube 3 avec cinq piqûres du tube 2.

Le nombre des ensemencements dépendra de la richesse en germes de la substance à étudier. Cette méthode est excellente en ce que sur les trois tubes il y en aura certainement un qui donnera de bons résultats.

On verse ces trois tubes, dont la gélatine est restée liquide, sur trois plaques de verre qui sont marquées des numéros 1,2 et 3 et qui sont placées l'une sur l'autre sous la même cloche, sur un petit échafaudage métallique.

La lame 0 est placée enbas, parce ques'ily a des cultures qui liquéfient la gélatine, celle-ci tombera dans le fond de la cloche et non sur les autres plaques.

Lorsque la gélatine a été inoculée, il faut l'exposer à une température propre à la germination des bactéries qu'on veut examiner. Souvent la température de la chambre suffit, comme cela a lieu pour les diplocoques de la pneumonie, etc. Mais si les bactéries qu'on veut étudier ne se développent qu'à une température comprise entre 20 et 36», on est obligé d'employer l'agar-agar.

F'our faire des plaques avec l'agar-agar, on place d'avance trois tubes contenant cette substance dans un bain-marie qu'on chauffe jusqu'à liquéfaction. On laisse refroidir ces tubes au bain-marie jusqu'à 40". A ce moment, on les ensemence de la même façon que nous venons de décrire pour la gélatine. On verse ces trois tubes sur des plaques; mais comme l'agar-agar glisse souvent sur les plaques, il est préférable de verser le liquide dans des cristallisoirs en verre très plats, recouverts d'un couvercle en verre, qui ont été stérilisés de la même façon que les plaques. 11 faut les choisir d'une grandeur telle que quatre d'entre eux puissent tenir dans

lO'j MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES.

une chambre humide (Babes). La chambre humide est placée dans une étuve à 36°.

Si l'on veut étudier des bactéries qui ne poussent pas sur l'agar-afçar, ou les inocule sur du sérum gélatinisé et stérihsé. On met cette substance dans des godets stérilisés couverts d'une plaque de verre ; on place quatre de ces godets dans une chambre humide, et on les inocule avec des couteaux stérilisés imprégnés de la substance à inoculer, de la môme façon que nous l'avons décrit à propos des pommes de terre. Avec un premier couteau, on inocule la surface du sérum du godet 1. Avec un second couteau, on prend une parcelle de la surface du godet 1 qu'on inocule sur le godet 2. Avec un troisième couteau stérilisé on prend de la substance

Fig. 19. — Godet de verre ensemencé avec de la substance tuberculeuse; c, culture pure des

bacilles de la tuberculose.

étalée à la surface du godet 2, et on inocule le godet 3, et ainsi de suite pour le 4« godet.

Si, quelques jours après l'ensemencement des quatre godets, il s'est développé des colonies sur le godet n" 4, on les examine au microscope. Si les bactéries développées ne répondent pas par leurs caractères à celles dont on attend l'éclosion, on ensemence quatre nouveaux godets avec les parties de la surface du godet n° 4 où rien n'avait germé. Ces quatre nouveaux godets enfermés dans une chambre humide sont placés dans une étuve d'Arsonval. Par celte méthode on peut réussir à isoler ceux qui se développent lentement et difficilement et qui jusque-là étaient mêlés à d'autres espèces (Babes),

Si les procédés précédents ne permettent pas le développement isolé de l'espèce de bactéries qu'on veut étudier, il faut chercher d'autres substance nutritives.

C'est ainsi qu'on obtiendra la culture de certaines bactéries sur la purée

ISOLEMENT DES tiULTURES PAR LK l'HOCÉUÉ DE KOGH. 105

de pommes de terre, ou sur le sérum de bœuf modifié par l'addilioii d'un tiers de suc de viande (Lœffler) (1).

Fig. i!0. — Flacon U'Erlcnmcycr contenant de la purée de pommes de terre, ensemencée avec la morve ; c, cultures des bacilles de la morve.

On peut améliorer la gélatine peptonifiée en ajoutant OB'", 5 p. 100 de sucre (Hucppe).

(I) On prnnd pour cela un doml-kilog. de viande hachée h laquelle on ajoute un litre d'eau distillée. On remue et on laisse reposer pendant vingt-quatre heures sur la glace ; on exprime et on ajoute de l'eau distillée jus<iu'.'i ce qu'on ail un litre de liquide. On ajoute nlors h cette infusion de viande 10 gr. de pcptone, 10 gr. de sucre de raisin, 5 gr. de chlorure de sodium; on fait bouillir; on neutralise avec du carbonate de soude ; on cuit de nouveau jusqu'à précipitation complète do l'albumine, puis on filtre. Ce bouillon est stérilisé h la marmite de Papin et ajouté, après refroidissement, au sérum. On procède ensuite à la stérilisation discontinue de ce dernier et à la gélatinisation.

106 MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

Dans ces divers appareils, surtout lorsqu'on a agi sur des substances très diluées, il se développe des colonies isolés d'un aspect caractéristique. On étudie d'abord ces colonies en plaçant la plaque sur laquelle elles se sont développées sur la platine d'un microscope qui doit être assez grande pour les recevoir. On examine au microscope à un grossissement de 100 diamètres en plaçant sous le système Abbé un diaphragme très étroit. On peut examiner aussi ces colonies à un plus fort grossissement, surtout si elles sontàla surface de la gélatine. On les recouvre alors d'une lamelle, et on étudie ainsi la forme et le groupement des microbes. Mais pour mieux les examiner, on les fixe sous le microscope, on touche avecunfilde platine stérilisé la colonie qu'on veut examiner, en contrôlant l'opération sous le microscope. Ce fil de platine sera agité dans une gouttelette d'eau sur une lamelle. On laisse sécher et on colore, puis on examine avec un fort grossissement la préparation ainsi obtenue.

Par le même procédé, on fait avec l'aiguille trempée dans une colonie une culture sur une chambre humide.

Enfin, on ensemence, avec un fil de platine trempé dans une colonie, des tubes contenant de la gélatine, de l'agar-agar ou du sérum de bœuf. Pour ensemencer le contenu d'un tube, on tient l'éprouvette de façon à ce que son fond soit tourné en haut pour éviter l'entrée des microbes de l'air ambiant. Sur les tubes où l'agar-agar a été gélatinisée obliquement pour avoir une plus grande surface de culture, on opère non seulement par piqûre, mais aussi par une strie faite avec la pointe de l'aiguille. Avec le sérum de bœuf, il est bon de frotter, sur la surface du sérum, l'aiguille imprégnée de la substance à examiner.

Il est nécessaire de pratiquer ces inoculations à la fois sur plusieurs tubes, dans la prévision que l'un d'eux ou plusieurs seront gâtés par la végétation de moisissures étrangères.

Comme ces cultures ont une vie limitée et variable il faut toujours avoir un matériel de tubes contenant les substances gélatinisées pour les inoculer successivement, si l'on veut en conserver de bons échantillons.

Thermostats. — Pour obtenir une température uniforme, on emploie plusieurs espèces d'étuves qui sont les mêmes que celles dont on se sert pour couver les œufs. On peut utiliser les couveuses des embryologistes. Les plus simples consistent en une caisse de fer-blanc à double paroi couverte de feutre de 30 centimètres de hauteur sur 60 centimètres de largeur. L'espace compris dans la double paroi est à moitié rempli de glycérine ou d'eau. En avant, la caisse est fermée par deux portes de verre.

La paroi supérieure porte trois ouvertures, l'une pour le thermomètre,

niVEllSKS ÉTUVES APPROPllIÉliS AUX CULTURES.

l'autre pour un tube montranl la hauteur du liquide, la troisième pour un régulateur, celui de Reicberlpar exemple, ou celui de Bunsen avec le mercure cl l'élher, qui est en rapport avec le gaz, et une ou plusieurs lampes à gaz. Il est utile d'interposer sur le trajet du tube un régulateur de la pression du gaz. On peut obtenir ainsi une température égale, avec une lampe à pétrole dont la partie supérieure de la mèche est remplacée par de l'amiante.

On se sertie plus ordinairement des étuves cylindriques en cuivre de d'Arsonval (fig.

21), qui sont constituées par un réservoir d'eau péripliériqueau milieu duquel se trouve la cavité où l'on place les objets à échauffer. Les becs de gaz, chaufTant l'extrémité inférieure conique de l'appareil, déterminent une excellente circulation du liquide chauffé.

Dans ces étuves bien connues, l'entrée du gaz est réglée par des lames de caoutchouc, c, qui se rapprochent, si l'eau se dilate, de l'orifice par où arrive le gaz, et qui modèrent l'écoulement de celui-ci. Les becs de gaz échauffent la partie conique inférieure de l'étuve. La température de l'appareil est réglée par l'élévation de l'eau dans la double paroi et surtout dans le tube de verre, t, qui communiiiue avec l'eau. On doit recommander de leur adapter l'appareil ingénieux de Koch, qui ferme automatiquement et complètement le robinet quand le gaz s'éteint.

Pasteur a fait contruiro à Wisnegg une étuve plus considérable, consistant en u^e grande caisse en bois à double paroi de 2 mètres de hauteur environ sur 1 mètre de largeur, fermée avec une double porte en verre. Un poêle chaulfé au gaz et rempli d'eau communique avec de l'eau placée entre les parois de la caisse. La caisse est partagée en trois étages dont la température est réglée à des degrés diflérents.

MÉTHODES DE CULTURE DES BACTÉRIES

L'un de nous a fait construire un appareil qui consiste en une caisse allongée à base conique, en fer, couverte de feutre, réglée par un régulateur de Bunsen, à l'aide duquel on peut obtenir une température qui ne varie pas de plus de deux dixièmes de degré. La caisse est à double paroi épaisse, remplie d'eau chaulfée par une lampe à gaz placée au milieu de sa base conique. Le bec de gaz est entouré d'une cheminée de verre de

Fig. 22. — Eluvc tic Babcs. (L'étuve qu'emploie M. Kocli dilTcre de celle-ci en ce qu'elle est fermée seulement par une porte en fer et que la cloison intérieure est immobile.)

Moscovie. L'intérieur de la caisse est partagé en quatre compartiments, chacun d'eux pouvant contenir deux chambres humides recouvertes de leur cloche. Elle est fermée par deux doubles portes en verre. La porte extérieure est recouverte d'un feutre qu'on peut soulever. On peut ouvrir les deux portes d'un côté sans ouvrir l'autre côté. Les compartiments sont séparés par une cloison médiane qu'on peut enlever.

Souvent, surtout en hiver, il est bon de mettre ces éluves dans une pièce séparée, fermée. 11 est utile aussi d'avoir, lorsque la température extérieure