COLORATION DES BACTÉRIES. — MÉTHODES DE KÎJHNE

méthylène, de telle sorte qu'une goutte du mélange, déposée sur du papier à filtrer, y laisse une tache foncée.

2» On lave à Teau.

3** La diCTércnciation est obtenue en plongeant les coupes pendant quelques secondes dans Teau très faiblement acidulée (1 d'acide chlorhydrique pour 500 à i 000 d*eau, suivant Tintcnsité de la coloration). Ou retire les coupes dès qu'elles deviennent d*un bleu pâle.

4° On lave de nouveau à Teau distillée et plusieurs fois de suite pour bien enlever Tacidito.

Sur uncouvre-ol)jet tenu sous Teau par une pince un peu spéciale, dont les mors sont courbés sur le plat, on étale chaque coupe très soigneusement sans la plisser et on la retire du liquide.

On enlève l'excès d'eau par du papier à filtrer, et, pour obtenir la dessiccation de cette coupe, on y dirige verticalement un courant d'air au moyen d'un tube de verre effilé relié à une poire en caoutchouc: cette dessiccation a pour résultat de faire bien adhérer la coupe à la lamelle. On achève d'évaporer l'eau d'imbibition en déposant quelque temps la lamelle chargée de la coupe sur une plaque de verre disposée de façon à pouvoir être chaulîée modérément par une lampe à alcool : la coupe s'éclaircit alors considérablement.

0® On traite quelques minutes par une huile éthérée, puis par le xylol, a?ant de monter dans le baume.

Ce procédé permet de s'assurer si, oui ou non, la préparation contient des micro-organismes : un très grand nombre de bactéries peuvent être ainsi décelées; mais on n'a, de cette façon, aucun renseignement sur leur siège, leurs rapports avec les éléments histologiques. Il est nécessaire, dans ce but, de traiter les coupes par les deux méthodes suivantes :

A. — Un certain nombre de coupes sont colorées par le bleu de méthylène, de la façon suivante (c'est ainsi qu'on colore très bien le bacille virgule du choléra; le violet, au contraire, imprègne trop le protoplasme, d'où la difficulté de différencier) :

l^' Coloration des coupes par une solution aqueuse concentrée de bleu de méthylène ajoutée, comme plus haut, à la liqueur ammoniacale (liquide très foncé), 5 à 15 minutes.

i^ Lavage à l'eau.

3^ Suivant l'intensité de la coloration, le procédé change un peu :

a) S'agit-il de coupes assez faiblement colorées, on les plonge dans Talcool absolu, mats on a eu grand soin d'y ajouter quelques gouttes de solution alcoolique de bleu de méthylène (en pratique, on doit encore apercevoir la coupe sur le fond du godet) ; de la sorte, la couleur ajoutée à l'alcool empêche une extraction trop forte de la matière colorante, on n'obtient que la déshydratation et non la différenciation. Celle-ci est obtenue par la fluorescéine ajoutée à l'huile de girofle (Pluorescein-Nelkenôl). C'est là que l'excès de matière colorante disparaît du protoplasme des cellules et de toutes les parties de tissu autres que les bactéries et les noyaux. (Pour môler la fluorescéine à l'essence, on broie la couleur dans l'essence et on filtre). Les

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coupes restent quelque temps dans ce liquide, jusqu*à ce qu'elles aient pris un ton vert clair. Si on veut obtenir une coloration rose du fond de la préparation, on dépose quelque temps les coupes dans l'huile de girofle éosinée. Pour obtenir cette huile de girofle additionnée d'éosine, on broie cette couleur dans un godet rempli d'huile de girotle et on filtre.

L'huile essentielle en excès est enlevée en déposant les coupes pendant <|uelque temps dans une huile éthérée bien fluide, telle que le térébène, puis quelques minutes dans lo xylol avant de monter dans le baume.

b) Si les coupes sont très fortement colorées, on recourt à la différtniciation par les acides étendus. Après la coloration on les lave, puis on les traite par Tacide acétique ai p. 100 ou l'acide chlorydrique (i : &00 — i : iOOO) jusqu'à ce qu'elles aient pris à peu près le ton clair voulu; on lave à l'eau où l'excès de matière colorante disparaît et, après déshydratation et éclaircissement, on monte dans le baume.

B, — Une autre série de coupes est en môme temps traitée par le violet de méthyle 6 B, et la différenciation est alors obtenue par la fluorescéine {Violett'Fluorescein-Methode).

1« Coloration par une solution aqueuse concentrée de violet ajoutée au liquide ammoniacal : les coupes y restent de 5 à 10 minutes. (Les bacilles de la tuberculose demandent 2 heures environ.)

2« Lavage à l'eau.

3» Solution d'iode ioduré : de 1 à 3 minutes.

4« Lavage à l'eau.

5<^ Fiuorescéine dissoute dans l'alcool absolu : la solution filtrée doit être bien limpide. Les coupes y sont agitées jusqu'à ce qu'elles commencent à s'éclaircir.

6» Le reste de la couleur violette et de la fiuorescéine est extrait par l'alcool absolu où on plonge les coupes jusqu'à décoloration.

7® On éclaircit par l'huile de girotle, où les coupes abandonnent encore un peu de matière colorante; on passe par le térébène, le xylol, et enfin le baume.

C'est par ce procédé que Kûhne colore, par exemple, les bacilles du iiharhon, de la septicémie des souris, de la lèpre, de la tuberculose. Cette méthode évite sûrement les précipitations si désagréables de matière colorante ; et la différenciation obtenue est si belle que les fins bacilles de la septicémie des souris peuvent ôtre distingués isolément à un grossissement de 100 diamètres.

Désire-t-on obtenir une double cobratiotif on peut se servir de la vésuvinc, ou bien, ce qui vaut mieux, les coupes sont colorées au carmin^ au