MÉTHODES DE PASTEUR

exister à la face interne des tubes et ballons sont détruits; Tair qu'ils contiennent est raréfié ; la ouate se roussit, et lorsqu'ils se refroidissent dans le fourneau même, l'air chau£fé, calciné pour ainsi dire, rentre dans les flacons en passant sur la ouate. Il est tout à fait pur de germes.

Pour remplir un tube à effilure avec du bouillon pendant que la solution nutritive bout à l'air libre dans une capsule de porcelaine, on passe rapidement l'effilure dans la flamme d'une lampe à alcool, on casse son extrémité sans choc, après y avoir tracé un trait à la lime, on repasse de nouveau la section dans la flamme, et on introduit l'effilure ainsi ouverte dans rinfusion en ébuUition. On aspire doucement par le col du tube; le liquide monte dans Teffilure, puis redescend lentement dans le tube. Lorsqu'il est suffisamment rempli, on chasse la goutte du liquide qui reste à l'extrémité de l'effilure et on la ferme à la lampe.

On agit exactement de la même façon pour remplir un ballon portant une effilure latérale (fig. 10).

Pour consener une assez grande quantité de bouillon préparé, on peut employer des ballons stérilisés sans effilure qu'on remplit du bouillon filtré. Ces ballons, dont on ferme le col à la lampe d'émailleur, sont chauffés dans un bain de chlorure de calcium à la température de Ho®. Le meilleur appareil pour chauffer ces ballons consiste dans l'autoclave fabriqué par Wisnegg et qui représente une grande marmite dePapin fermée hermétiquement et bien boulonnée, qui se chauffe au gaz par sa partie inférieure et qui est munie d'un manomètre. 11 est facile de porter ainsi la température à 130» en vase clos.

Si l'on veut avoir une série de tubes Pasteur remplis de bouillon, on se sert des tubes stérilisés à double réservoir de la figure 10, qui présentent deux effîlures latérales ^''doubie'^éservoii dont l'extrémité inférieure est fermée à la lampe, et dont et à double emle goulot est rempli d'ouate. Ces tubes sont à cheval sur ^^- ^^ /J* ^^

'^ ^ tube a est fermé

le montant d une planchette. à la ouate.

On casse le col d'un ballon fermé rempli de l'infusion en ayant soin de tracer, d'abord un trait à la lime, on suit ce trait avec un morceau de charbon enfiammé de façon à obtenir une cassure circulaire. On prend socessivement chacun des tubes, on casse leur extrémité, on la fiambe, on l'introduit dans le ballon et on aspire la liqueur ; on replace chacun de ces tubes à cheval sur la planchette (fig. 12). Quand ils sont tous remplis, on les ferme à la lampe.

Pour apprécier la température des liquides contenus dans les tubes qu'on met dans l'autoclave, on se sert d'un thermomètre qui sort du couvercle par une ouverture ménagée à cet effet et hermétiquement fermée. Le réservoir du thermomètre doit plonger dans le liquide d'un vase ou ballon, ou tube identique à ceux qu'on veut stériliser.

Au lieu de tubes, on emploie communément les matras de Pasteur qui sont représentés dans la figure 13. Ils consistent en un petit ballon à fond plat fermé par un bouchon à recouvrement à Témeri, qui se termine par

MÉl'HODES DE CULTURE DES BACTÉRIES.

un tu])c en verre obstrué par de la ouate. Ces matras ont été flambés au préalable. Quand on veut remplir une série de ces vases, on prend un des grands ballons scellés & la lampe dont on coupe le coi ; on remplit une pipette à gros ventre (fig. 4) avec le liquide qu'il contient. Cette pipette a

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Fro. 12. — Cette figure montre la disposition des tubes à double r(!*ser\'oir disposés sur une planchette pour l'opération qui con<<iste à les remplir d'un bouillon conservé dans le ballon placé à droite de la table (d'après Duclaux).

été au préalable stérilisée pendant qu'elle était fermée & son extrémité et remplie de ouate à son col. Puis on porte son contenu successivement dans plusieurs matras en soufflant par le col pour faire couler le liquide par l'extrémité inférieure. Les grands ballons à effilure latérale représentés dans la figure 9 sont plus commodes. En effet on les remplit directement avec le liquide du bouillon pendant son ébullition, puis on ferme à la lampe Teffilure et on les chauffe dans la marmite de Papin à 115 ou à 130*». Après cela on les conserve jusqu'au moment où l'on veut remplir les matras Pasteur. 11 suffit de casser l'extrémité do l'effllure et de souffler par le col du ballon pour faire passer le liquide qu'il contient dans les matras. L'opération finie, si le ballon renferme encore du liquide, on ferme l'effllure à la lampe et on conserve le ballon et son contenu jusqu'à ce qu'on en ait besoin de nouveau. Les tubes et les petits matras étant remplis, il faut encore s'assurer que le liquide qu'ils contiennent est bien stérilisé. Il convient alors de les laisser pendant plusieurs jours à 35* dans la grande étuve en bois à double paroi fabriquée par Wisnegg sur les indications de Pasteur ou dans une étuve d'Arsonval. Nous donnons plus loin la description de ces appareils.

Fio. 13. — Ma tras Pasteur.

CULTURES DANS LES MILIEUX tiÉLÂTlMSÉS. 105

Méthodes plus régentes. — Depuis les premiers travaux de Pasteur, un grand nombre de botanistes, de physiologistes et de pathologistes ont apporté leur contingent à la technique des cultures, de telle sorte que les procédés ont été modifiés, simplifiés et perfectionnés.

Tels sont les procédés de culture sur des substances gélatinisées, sur les pommes de terre, etc., imaginés par Brefcid, Grawitz, Koch ; tel est l'emploi des lames de verre, sur lesquelles on étend les substances gélatinisées qu'on ensemence de bactéries ; des cristallisoirs et des cloches de verre où Ton enferme ces lames pour obtenir des cultures.

Dans ces méthodes, il faut toujours commencer par bien laver d'abord, puis stériliser tous les instruments, verres, cristallisoirs, cloches, lames de verre, couteaux, etc., en les portant pendant une demi-heure à la température de 150® dans Tair sec. Les instruments, les couteaux, aiguilles, pinces, etc., sont enfermés dans une boîte de fer à claire- voie, dont le fond est couvert d'une feuille d'amiante, dont le couvercle est surmonté d'une poignée. Nous avons fait construire des boîtes avec beaucoup de tiroirs isolés afin de conserver stérilisés les instnimenls dont ou ne se sert pas. Ces boites, représentées dans la iig, 5, sont placées dans la corbeille du fourneau à gaz de la fig. 7 (p. 101), avec la verrerie. Le fourneau à gaz, carré, à porte s'ouvranl en avant, est plus commode que celui qui est représenté dans la fig. 7.

Pour stériliser avec la vapeur d'eau, on emploie l'autoclave de Wisnegg ou un poêle cylindrique (fig. 16) entouré de feutre, dont le quart inférieur est rempli d'eau. Au-dessus du niveau du liquide se trouve une grille sur laquelle on place un panier grillagé contenant les tubes et flacons remplis de la substance géiatinisée ou des pommes de terre qu'on veut stériliser. L'eau est chauffée par un bec à gaz. Le poêle est fermé à sa partie supérieure par un couvercle qui laisse passer un thermomètre. L'eau doit être bouillante au moment où l'on introduit les substances.

Bouillons et substances gélatinisés employés pour les cultures, — Nous avons étudié déjà les conditions variées de l'existence des bactéries ; les unes, aérobies ou aérophiles, vivent uniquement dans les milieux aérés pourvus d'une quantité plus ou moins grande d'oxygène ; les autres, anaérobies, comme certains ferments, se développent de préférence dans les milieux dépourvus d'oxygène. Certaines n'ont besoin que d'aliments hydrocarbonés, tandis que la nutrition de la plupart nécessite des aliments azotes. Un petit nombre d'entre elles fructifient dans un liquide acidifié, tandis que presque toutes ont besoin d'un milieu neutre ou alcalin. Ces diverses conditions de vie doivent être satisfaites dans les cultures artificielles.

Nous avons déjà indiqué le mode do préparation des infusions et bouillons employés par Pasteur et qu'on rend neutres ou alcalins en ajoutant des sels basiques.

Cohn s'est servi d'un liquide dans lequel, pour 20 grammes d'eau distillée, il mettait Ok',1 de phosphate de potasse, 0«',i de sulfate de magnésie, O",! de phosphate de chaux tribasique et 0»',02 d'acide tartrique.

Nœgeli recommande divers liquides, et en particulier celui-ci : eau

iOO grammes, albumine soluble i gramme, phosphate de potasse 08^,2, sulfate de magnésium 0*',04, et chlorate de chaux 0",02. Souvent on emploie des solutions albumincuscs contenant une quantité déterminée de sucre, d'amidon, d'acides gras, etc.

Lorsque ces diflérents liquides ont reçu des particules contenant des bactéries, celles-ci se développent sous forme de nuages, de flacons, de sédiments au fond du liquide et de pellicules à sa surface. Mais les différentes espèces de bactéries qui y pullulent se mêlent les unes aux autres, et il est difficile de les séparer pour obtenir isolément des cultures pures d'une espèce déterminée. On y arrive mieux en employant des substances nutritives semi-solides ou solides, car le fragment contenant des bactéries, inoculé sur ces substances, donne lieu à des fructifications qui restent au point touché, ou qui pénètrent dans la profondeur, en présentant une forme souvent caractéristique.

Aussi ce fut un véritable progrès que la culture sur les substances nutritives solides. Depuis longtemps on s'était servi des œufs, des tranches de pommes de terre et de carotte ; mais ce sont surtout la gélatine employée par Brefeld et Klebs, Tagar-agar ou gélose mêlés avec des peptones, le sérum de sang de bœuf gélatinisé pï*éparé par Tyndall et Koch^ qui sont le plus utiles, car leur transparence permet d'apprécier la couleur et la forme des cultures dans leur profondeur comme à leur surface. Ces différentes préparations ont été employées avec le plus grand succès par Koch, qui a perfectionné et généralisé la méthode de culture sur les milieux solides. Il a employé les cultures transparentes et solidifiées pour isoler les difTérents germes.

Pour préparer les pommes de terre en vue des cultures, on les choisit assez grosses et à surface bien lisse. On les nettoie d'abord avec une brosse, on enlève avec un couteau les bourgeons et les parties altérées; on les place ensuite pendant une heure dans une solution de sublimé à 5 p. 1000, et enfin on les fait cuire pendant trois quarts d'heure dans une étuve à vapeur. Pour s'en servir, on prend une pomme de terre entre le pouce et l'index de la main gauche qu'on a préalablement lavée au sublimé. On la coupe en deux avec un couteau chauffé au rouge, puis refroidi. On laisse tomber les deux morceaux dans une chambre humide composée d'un grand cristallisoir recouvert d'une cloche. Cette chambre humide a été stérilisée antérieurement. On coupe de môme avec un autre couteau stérilisé une seconde pomme de terre, de telle sorte qu'on a, au fond du cristallisoir, quatre morceaux que nous désignerons par les chiffres I, II, 111, IV. Cela fait, on prend avec un couteau stérilisé un peu de la substance qu'on suppose renfermer des bactéries; on l'étalé avec ce couteau à la surface de section du tronçon I; on prend avec un autre couteau stérilisé une particule de la substance déjà étalée sur la pomme de terre I, et on l'étend sur la surface de section de la pomme de terre II. On répète la môme opération pour

1. Miitheilungen d. k. Geaundheilsamte, 1. 1 et t. II. — Deutsch, Med. Wockenscrift 1884, H"» 32. — Àllf/emeine Zeitung v, Mûnchen Beilaffe, 8 novembre 1884.