POMMES DE TERRE. — GÉLATINE PEPTONIFIÉE

les deux derniers tronçons, si bien que la pomme de terre IV contient très peu de germes.

Pour cultiver les bactéries sur les pommes de terre, on emploie l'appareil décrit par Esmarch qui est basé sur les mêmes i)rincipes que celui que nous avons indiqué dans la seconde édition de notre iivre p. 184.

L'appareil de Roux consiste dans des cristallisoirs en verre de Bohême de 10 centimètres de diamètre, fermés par un couvercle qui recouvre le cristalHsoir. Ce dernier est percé latéralement de deux trous de la grosseur du doigt, bouchés par un tampon de ouate. Les tranches de pomme de terre sont placées dans le cristallisoir ; on recouvre ce dernier de son couvercle; on ficelle le couvercle afin qu'il soit bien maintenu et on met le tout dans l'autoclave I»(4idant une demi-heure, en ayant soin de le placer obliquement de façon à ce que la vapeur d'eau entre bien dans l'appareil. L'appareil étant ainsi stôrilisé, si on veut ensemencer la pomme de terre, on enlève le bouchon de ouate de l'un des trous et on passe par là l'aiguille de platine chargée de la substance à ensemencer.

Pour les culUnrs sur pommes de terre, le meilleur moyen consiste à en nieltre un parallélipipède allongé dans un tube dVssai. Au laboratoire de Pasteur on se sert depuis longtemps do ces tubes rétrécis un peu a leur fond de façon à ce que l'extrémité du tube contienne un peu d'eau. Le tube bouché à la ouale et contenant la pomme de ten*e est stérilisé à l'autoclave. Globig a taillé en biseau ses pommes de terre enfermées dans des tubes de façon à avoir une suiface oblique comme dans les tubes d'agar-agar.

On peut aussi se senir de tranches de noix de coco stérilisées qui ont l'avantage d'être tout à fait blanches et de permettre de bien voir la couleur des microbes colorés et chromogènes.

Beaucoup de bactéries croissent très bien sur les carottes qu'on prépare de la même façon.

Pour se servir des œufs, on les fait durcir, on enlève la coquille, on les lave au sublimé, on les met de nouveau à l'étuve et on les coupe en deux comme les pommes de terre.

Pour préparer la gélatine peptonifiée, on mêle 500 grammes de viande dépouillée de graisse et hachée à 1 litre d'eau distillée. On laisse reposer ce mélange pendant 24 heures en entourant de glace le vase qui le contient. On le passe ensuite dans un linge propre. On obtient de la sorte environ un litre de liquide. Si l'on obtient moins d'un litre, on ajoute de l'eau distillée de façon à compléter un litre. On ajoute au liquide 10 grammes de pcptone sèche, o grammes de sel de cuisine et iOO grammes de gélatine pure et tout âfait incolore. On chauffe ensuite jusqu'à la dissolution de la gélatine en ayant soin de ne pas dépasser 60*»; on neutralise le mélange avec le carbonate de soude jusqu'à ce que le papier de tournesol rouge devienne un peu bleuâtre et que le papier de tournesol bleu ne change pas de couleur; on chauffe encore au bain-marie, dans l'eau bouillante, pendant une demi-heure et ensuite dans l'appareil à vapeur de Koch pendant vingt minutes. On s'assure de nouveau de la réaction légèrement alcaline du liquide, et on filtre enfin dans du papier Joseph et un filtre en verre

placé dans le chauifoir métallique à double paroi rempli d'eau chaude (fig. 14). La gôlaline est versée directement dans les tubes stérilisés.

La stérilisation des tubes se fait de la manière suivante ; on lave les tubes à Teau bouillante, on les bouche avec de la ouate, puis on les prend par rextrémilé supérieure et on chauffe fortement le fond sur une flamme d'alcool. On les laisse refroidir, puis on enfonce un peu la ouate et on chauffe leur extrémité supérieure en les tenant par leur fond, jusqu'à ce que la ouate devienne un peu rousse.

Si l'on possède les appareils perfectionnés de nos laboratoires, on lave

les tubes à l'eau bouillante, on les bouche à la ouate et on les met pendant une demi-heure dans l'un des appareils représentés figure 7 ou 16, à 150».

On verse dans un tube 10 grammes de gélatine. Avec la quantité de gélatine fabriquée d'après la formule précédente, on doit avoir environ quatre-vingt-dix à quatre-vingt-quinze tubes. Après avoir rempli les tubes, on les bouche de nouveau à la ouate et on les stérilise en les plaçant pendant dix minutes dans une étuve à vapeur chauffée d'abord à 100* et maintenu à cette môme température.

On les y met de nouveau pendant le même laps de temps, les deux ou trois jours suivants. Cette gélatine peptoniQée contient 10 p. 100 de gélatine, 1 p. 100 de peptone sèche et 5 p. 1000 de sel de cuisine. Il est préférable de les stériliser en une seule fois dans l'autoclave.

Nous avons employé aussi pour les cultures sur la gélatine les matras de Pasteur ; mais ces derniers sont avantageusement modifiés en leur donnant la forme des ballons d'Erlenmeyer, de façon à ce que l'on puisse atteindre toutes les parties du fond du matras avec le fil de platine, soit pour faire les ensemencements, soit pour prendre les cultures qui s'y développent.

On peut verser aussi la gélatine dans des vases plats de différente forme stérilisés recouverts d'un couvercle formé d'une lame de verre et fermés, entre le couvercle et le vase, par une bande de caoutchouc.

Lorsque la gélatine est employée à des cultures, on ne doit pas dépasser

la température de 20 à 24<*, car elle se liquéfie à une température plus

élevée, et on perdrait le bénéfice d'une culture sur une substance solide.

Buchner prépare une gélatine avec 100 parties d'eau, 10 parties de gela-

Fig. 14. — Filtre pour la gélatine peptone fabriqué par Wisoegg.

SÉRUM SANGUIN GÉLATINISÉ. 109

tine, 0,5 d'extrait de viande de Liebig, 0,5 de peptone, 2 de sucre de canne et 0,5 de phosphate basique de chaux.

Pour étudier la fermentation du lait, on peut employer, à la place d'eau, du petit-lait ou de Turine neutralisés. Hueppe ajoute 5 p. 100 de sucre à la gélatine peptonifiée. Nous devons dire toutefois que cette addition empêche ou retarde la liquéfaction caractéristique de la gélatine par certaines espèces bactériennes.

Xous recommandons d'ajouter à la gélatine artificielle, préparée sans la viande, 5 p. 100 de glycérine.

Au lieu de gélatine, on peut employer l'agar-agar ou gélose, dont le grand avantage consiste en ce qu'on peut chauffer la substance gélatinisée par l'agar-agar jusqu'à la température de 40<^ sans qu'elle se liquéfie. L'agar-agar peptonisé donne un milieu moins transparent que la gélatine, mais en en mettant une petite quantité, elle est suffisamment transparente. On peut aussi mêler avantageusement l'agar-agar avec la gélatine.

La préparation de l'agar-agar s'effectue de la même façon que la gélatine; seulement, on ajoute au bouillon 0,5 à 2 p. 100 d'agar-agar pulvérisé et 2 p. 100 de gélatine. Pour filtrer, on emploie avantageusement un linge de flanelle sur le<{ucl on fait passer plusieurs fois le liquide. La filtration se fait surtout rapidement dans le vide, et donne un liquide bien clair. On peut même se dispenser de filtrer, on laisse alors se déposer les parties solides pendant 24 heures à une température élevée et ensuite on décante la couche superficielle du liquide.

11 est bon de laisser gélatiniser obliquement l'agar-agar afin de pouvoir faire l'ensemencement à la fois par une piqûre et par une strie. Les cultures sont ainsi très démonstratives.

Pour obtenir de Tngar-agar très clair, Roux emploie le procédé suivant. On laisse au bain-marie à 100® un litre de bouillon peptonifié auquel on ajoute 20 grammes d'agar. Au bout d'une heure on filtre sur une tarlatane qui retient les gros morceaux d'agar. Ce qui passe est presque clair. On le laisse se refroidir un peu tout en restant liquide et on y verse un blanc d'œuf battu dans de l'eau. On agite pour le mêler au bouillon. On chauffe ensuite au bain-marie à ébuliition. L'albumine de Tœuf coagulée retient dans ses mailles toutes les particules solides et on filtre simplement sur du papier Joseph.

Pour obtenir l'agar-agar glycérine, d'après le procédé de Roux et Nocart, on ajoute à ce dernier 5 p. 100 de glycérine.

Le meilleur milieu de culture pour les bactéries pathogènes est le sérum du sang du bœuf, du mouton, du cheval et du chien.

Le procédé de Koch est le suivant :

Pour recueillir le sang, il se sert de vases cylindriques de 20 centimètres de hauteur sur 8 à iO centimètres de diamètre et fermes par des bouchons de verre. Ces vases, après le lavage, sont rincés avec une solution de sublimé à 1 p. 100 puis à l'alcool et enfin à l'éther; ce dernier liquide est évaporé à l'étuve. On y recueille le sang au moment où il jaillit de la veine d'un animal. La saignée est faite avec un couteau stérilisé ; la peau de

ranimai a été lavée avec une solution au sublimé et on ne recueille pas; le premier jet, qui peut contenir des poils et des impuretés. On remplit le vase jusqu'auprès du bord, on le bouche et on le place aussi vite que possible sur la glace, où il restera 24 à 30 heures pour permettre la formation d*un caillot solide.

Pour que la séparation du sérum et du caillot se fasse bien, il est nécessaire de laisser pendant tout ce temps le vase immobile près du lieu où on a recueilli le sang. Si on le transportait un peu plus loin, lo sérum perdrait sa transparence. Le sérum sera pris avec une pipette et versé

FiG. 15. — Appareil de Koch pour stériliser les éprouvettes.

FiG. 16. — Appareil à vapeur de Koch.

dans des éprouvettes préalablement stérilisées qu'on remplira au tiers, et qui seront bouchées avec de la ouate.

La sténiisation du sérum repose sur ce fait (Tyndall), que les bactéries sont tuées à une température relativement basse, au-dessous de la température de coagulation de Talbumine, tandis que les spores résistent. Un premier chauffage tue les bactéries vivantes, mais leurs spores germent le second jour, le troisième, ou les jours suivants; le chauffage répété une fois tous les jours tuera les bactéries à mesure ({u'elles se développent. C'est là le chauffage discontinu. Pour cette opération, on place les éprouvettes dans une étuve cylindrique à double paroi renfermant de l'eau chaude (fig. 16). La température intérieure de Tétuve sera maintenue à 58°, et l'opération sera répétée tous les jours, pendant une heure, pendant cinq à six jours consécutifs. Cette opération peut s'effectuer au bain-marie. On voit souvent se former sur le sérum stérilisé une pellicule de choies-

SÉRUM SANGUIN GÉLATIMSÉ.

térine qu'il ne faut pas prendre pour un développement de microbes.

On peut employer le sérum ainsi liquide et stérilisé. Mais le plus souvent il est préférable de le solidifier.

En agissant exactement d'après cette méthode et surtout en recueillant le sérum assez vite et avec soin, il ne se développe presque jamais de bactéries et Ton peut procéder à la gélatinisation sans attendre la stérilisation pendant huit jours.

Il est probable que le caillot

qui se sépare du sérum retient

les bactéries qui auraient pu

rentrer dans le sang pendant la

- saignée.

Pour obtenir la gélatinisation sur une surface aussi étendue que possible, on place les éprouvettes inclinées dans l'éluve aplatie et penchée (fig. 17). Le fond de Tétuve est rempli do ouate et un thermomètre placé dans l'étuve sert à apprécier la température, il est avantageux de se senir, au lieu de ces éluvesdont

on ne peut pas bien régler la température et dont le fond est toujours trop chauffé, des grilles en fil de fer qu'on place dans Tétuve. Ces grilles ont doux pieds pour eu régler l'obliquité (fig. 18). De cette façon on peut préparer facilement une grande quantité de tubes dans lesquels le milieu nutritit présente une surface oblique. Le point de gélatinisation étant de 65°, on

Fig. 17. — Appareil imaginé par Koch pour maintenir inclinées les éprouvettes contenant du sémm pendant la gélatinisation. Cotte figare et les figures suivantes sont empruntées au catalogue du D"* R. Muoncke, fabricant des ustensiles spéciaux nécessaires à la culture des bactéries, à Berlin.

Fig. 18. — Grille à surface oblique, avec deux pieds pour régler l'obliquité.

maintiendra la température au-dessus de 65°, et au-dossous de 68°, le point de coagulation du sérum étant de 75°. La gélatinisation est plus ou moins rapide suivant la provenance du sang. Le sérum do mouton est celui qui se gélatinise le plus vite, le sérum de veau le plus lentement ; en moyenne une demi-heure à une heure suffira. Un sérum bien gélatinise est solide et dur comme du blanc d'oeuf durci, de couleur d'ambre, transparent et un peu laiteux seulement dans sa partie inférieure. L'eau de condensation qui se forme sur les parois de l'éprouvettc pondant le chauffage se

réunit au fond du tube, et forme un liquide de culture contenant en dissolution des substances nutritives. Si Finoculation a été pratiquée jusqu'à la partie liquide, on aura l'avantage de pouvoir observer en même temps le développement des bactéries sur un milieu solide et liquide.

Les parties supérieures de la couche du sérum se dessèchent, mais les parties moyennes et inférieures restent bonnes pendant des mois.

En ajoutant 5 p. iOO de glycérine à Tagar ou au sérum du sang de bœuf gélatinisé, ou au bouillon, on obtient un milieu nutritif très propice au développement de certaines bactéries, notamment celles de la tuberculose. (Nocart et Roux.)

Voici maintenant le procédé plus simple de Nocart et Roux :

On saigne un animal en introduisant dans la veine jugulaire un trocart stérilisé qui communique avec Teffilure latérale d'un ballon dont le col est' bouché à la ouate, et qui est également stérilisé (voyez fig. 9). On ferme ensuite Teffilure à la lampe. 11 est bon de se servir, pour recueillir le sang, de petits ballons de la contenance de 300 centimètres cubes. Ce procédé pour recueillir le sang est celui que Pasteur a mis en usage pour démontrer la pureté de ce liquide. Nocart s'en est servi pour fabriquer le sérum gélatinisé pris sur le cheval. On laisse les ballons au repos pendant un ou deux jours; le caillot se rétracte; au-dessus de lui il existe une couche de sérum limpide, représentant jusqu'à 200 grammes de liquide, qu'on verse dans les éprouvettes par l'effilure latérale en soufflant par le col du ballon.

On peut, pour recueillir le sérum sanguin, se servir d'un chien de grande taille, ce qui permet de faire toutes les opérations dans le laboratoire. On a d'abord stérilisé dans le four à flamber un vase de la contenance d'un litre dont le col, fermé par un bouchon en liège et entouré de ouate bien ficelée, reçoit un tube ouvert fermé par de la ouate et un tube efQlé assez long fermé à la lampe.

On mot à nu, avec toutes les précautions antiseptiques, l'artère crurale, on la soulève en plaçant deux fils à ligature. Entre les deux fils on fait pénétrer dans l'artère un trocart stérilisé. On retire l'aiguille du trocart et on la remplace par la pointe du tube effilé qu'on a cassée avant son introduction. Le sang pénètre alors de l'artère directement dans le vase qu'il remplit bientôt. On ferme alors l'extrémité du tube à la lampe et on porte sans l'agiter lo vase plein dans une glacière où on le laisse pendant cinq jours. Le caillot se rétracte et il suffit de déboucher le flacon et d'aspirer le sérum avec une pipette stérilisée. Sur un chien de forte taille, cette saignée, qui ne tue pas l'animal, donne environ 700 grammes de sang dont moitié de sérum.

On remplit des tubes qu'on bouche à la ouate et qu'on laisse pendant quelques jours à l'étuvo à 370*. Si quelques-uns des tubes se troublent, cela indique qu'ils sont adultérés et on ne s'en sert pas.

Les éprouvettes contenant du sérum et bouchées à la ouate sont portées deux ou trois jours successivement à la température de 63* pendant une heure. Puis on gélatinisé leur contenu en les mettant dans un petit appareil inventé par Koch et qui consiste dans une boîte carrée de fer-