ET LE POIDS D’ALBUMINE DISSOUTE

Quantité de pep3ine.

Albumine dissoute.

Albumine dissoute par 1 cc. de pepsine.

1 cc.

2,2 gr.

220 centigr.

LOI D’ACTION

Pour cette expérience, on a employé dans chaque essai 10 grammes d’albumine d’œuf cuite et râpée, délayée dans 100 cc. HCl à 0,3 °/0. La température était de 40°, et la transformation a été arrêtée au bout de 4 heures. La détermination de l’albumine dissoute se faisait d’après la teneur en azote du liquide filtré. Avec de faibles doses de pepsine, de 1 à 3 cc., la digestion marche avec une certaine régularité : on dissout de 220 à 200 centigrammes d’albumine par cc. de diastase. Mais si l’on augmente la dose, on s’éloigne de plus en plus de la constante et l’on arrive, avec 16 cc., à ne dissoudre que 50 centigrammes, au lieu de 220.

Cette irrégularité est due à des différentes causes. En première ligne, intervient l’état physique de l’albumine. L’albumine cuite est loin d’être une substance homogène, de sorte que des parcelles s’attaquent mieux les unes que les autres. Ensuite, et surtout, il y a lieu de considérer l’influence des produits dissous. Au début, la solubilisation se fait en présence d’eau pure, mais bientôt le liquide s’enrichit de plus en plus en produits d’hydrolyse, et l’action digestive se poursuit d’autant plus lentement, que la liqueur devient plus riche en ces substances. Quand on emploie de l’albumine très finement divisée et qu’on travaille avec une grande dilution, on écarte dans une certaine mesure cette cause retardatrice et l’on se rapproche d’une marche régulière.

Solubilisation en liqueur très étendue.

Emulsion d'albumine coagulée à 4 •/..

Pepsine.

Passage du liquide à l’état transparent.

1 milligr.

123 min.

Dans ces essais, on a employé un lait d’albumine très finement divisé, à la dilution de 4 %, et l’on a mesuré l’activité de la transformation en notant le temps nécessaire pour que la dissolution soit complète. On voit que pour une dose double

PEPSINE

de pepsine, on va 2 fois plus vite que pour une dose simple, et que pour dissoudre la même quantité d’albumine en 4 fois moins de temps, il faut 4 fois plus de diastase. Ainsi, lorsqu’on se place dans des conditions expérimentales telles que le travail produit soit relativement faible, soit en faisant les mesures dans le début de l’action, soit en opérant avec de petites doses de ferment, on constate que la double loi de proportionnalité — la quantité d’albumine solubilisée est en raison directe de la quantité de pepsine présente et du temps — est vérifiée.

Le pouvoir peptonisant, toujours dans les premières phases de la digestion, se trouve soumis aux mêmes lois que le pouvoir liquéfiant. Mais la démonstration ici devient encore plus difficile. En effet, non seulement on rencontre les mêmes difficultés que précédemment dans l’observation du pouvoir liquéfiant, mais encore il en surgit de nouvelles. Par suite de l’hydrolyse qui se manifeste dès le début, il se produit dans le liquide toute une série de substances intermédiaires, différents acides-albumines, différents albumoses, etc., qui, tout en se transformant progressivement, offrent à l’action de la pepsine une résistance très inégale : d’où une absence complète d’homogénéité. En outre, il faut mentionner le fait que la réaction de milieu change constamment au cours de la peptonisation et qu’on se trouve, par suite, en présence de quantités différentes d’acidité depuis le début jusqu’à la fin, circonstance qui empêche aussi une manifestation simple de l’action diastasique.

Toutes ces difficultés font qu’on ne peut qu’entr’apercevoir la loi, celle de proportionnalité, et encore, dans le début de la transformation seulement, alors que les causes perturbatrices n'influent pas encore. Le tanin, dissous en présence d’acide tartrique, réactif qu’on a déjà employé pour suivre la dégradation de la matière albuminoïde, peut à nouveau servir ici pour étudier la loi de la proportionnalité.

LOI D’ACTION

Peptonisation de la fibrine.

Temps.

Albumoses précipités par le tanin.

Produits non précipitables formés par heure.

Après 1 heure.

Ce tableau montre qu’après 3 heures, par exemple, la quantité de produits hydrolysés non précipitables par le tanin est de 100 — 73,4 = 26,6, soit par heure = 8,9, nombre qui est sensiblement le même pour les autres déterminations; ce qui prouve que la vitesse de peptonisation, durant les 5 heures de l’expérience, est restée à peu près constante.

Loi de Schütz-Borissow. — A côté de cette méthode très simple, détermination du poids de l’albumine simplement dissoute ou digérée jusqu’à l’état de produits non précipitables par le tanin, il en existe d’autres, qui peuvent également servir pour mesurer l’activité d’une diastase protéolytique. Si nous laissons de côté les méthodes physico-chimiques, qui consistent à suivre la variation, soit du pouvoir rotatoire, soit de là viscosité, soit enfin de la conductibilité électrique du liquide de digestion, nous trouvons que la plus employée est celle dite des tubes de Mett. Rappelons seulement ici en quoi elle consiste. On emplit une série de tubes de verre de 1 à 2 millim. de diamètre de blanc d’œuf très frais, on coagule le tout et l’on coupe ces tubes en fragments de 10 à 15 millim. de longueur. Pour l’étude, on met 2 de ces fragments dans le liquide à diastase, on laisse séjourner le tout à 37-40° pendant une dizaine d’heures et l’on mesure, au bout de ce temps, la longueur du cylindre gélatinisée ou dissoute aux deux extrémités du tube.

Que vaut cette méthode? L’expérience montre que la diffusion de la diastase dans le tube est assez régulière, du moins jusqu’à une certaine profondeur, égale à 4 ou 5 mm., autrement dit, que l’attaque, dans des conditions données, est sensiblement proportionnelle au temps d’action. Voici, d’après

PEPSINE

Vassilief, les longueurs d’albumine dissoutes par une pepsine, à 37°, durant des espaces de temps égaux à 2 heures :

Durée

De 0 à 2 h.

Longueurs dissoutes 1 mm. 10 1 14

La constance de la vitesse, à l’origine, tout au moins, est donc établie. Mais comment varient les longueurs dissoutes lorsque la quantité de pepsine varie? Ainsi que le fait remarquer Duclâux, à qui nous empruntons le raisonnement suivant, on ne peut plus admettre ici la loi de proportionnalité comme dans le cas des autres procédés où la diastase et la substance qui en subit l’action sont répandues uniformément dans le même volume du liquide. Dans l’expérience qui nous occupe, le cylindre d’albumine est en quelque sorte extérieur à la liqueur active, et n’est attaqué que par sa base. C’est donc la quantité de diastase, non pas par unité de volume, mais par unité de surface, qu’il faut envisager.

Si donc la quantité de diastase devient n fois plus grande par unité de volume, elle augmentera seulement par unité de surface de la quantité et en appelant l et V les longueurs dissoutes dans le premier et le second cas, on aura, selon toute probabilité, tout étant maintenant comparable :

v V«2 d’où v vi ni ii pi

Pour des temps égaux, les cubes des longueurs dissoutes devraient donc augmenter comme les carrés des quantités de diastase. Si les quantités de diastase sont comme 1 et 8, les longueurs d’albumine dissoutes seront comme 1 et ^/(8)2, soit 1 et 4.

En réalité, l’expérience n’est pas venue absolument confirmer ces vues théoriques. Par des voies différentes, E. Schütz, qui employait la méthode polarimétrique, et Borissow, qui se servait des tubes de Mett, constatèrent que les vitesses de

LOI D’ACTION

digestion, ou les longueurs dissoutes dans le même temps, sont proportionnelles aux racines carrées de la quantité de dias-

tase. Autrement dit, on n’a pas :

comme précédem-

ment, mais^. = Va. ; ce qui fait, dans l’exemple choisi, que

les longueurs d’albumine dissoute seront, non pas comme 1 et 4, mais comme 1 et \/8", soit 1 et 2,8.

D’après Duclaux, la différence serait imputable à ce que la diffusion ne renouvelle pas assez rapidement les surfaces à l’intérieur du tube lorsque la puissance de la diastase augmente, ce qui a pour effet de restreindre la longueur d’albumine qui aurait dû être dissoute.

D’autre part, Julien Schütz a vérifié la loi de Schütz- Borissow et a constaté qu’elle est exacte pour les solutions de ferment de moyenne concentration et en présence d’un excès de la substance protéique. Il est piquant de constater que cette dernière recommandation, faite en vue de permettre à la digestion de suivre la loi de E. Schütz, est précisément la raison pour laquelle la loi théorique de Duclaux ne se vérifie point. En effet, d’après l’expérience de Hedin, que nous retrouverons à propos de la loi d’action de la trypsine, un excès de substance albuminoïde, en absorbant une partie de la diastase, a naturellement pour effet de ralentir l’attaque de l’albumine. Quoi qu’il en soit, il semble bien, si l’on tient compte des irrégularités dues à l’imperfection des méthodes employées, que la loi théorique de Duclaux est vraie, c’est-à-dire que les prémisses dont il est parlé sont encore applicables ici, à savoir que la quantité de substance hydrolysée par le ferment protéolytique est, à l’origine, proportionnelle à la quantité de diastase employée et au temps.

Si l’on opère, non plus dans des tubes de Mett, mais avec des émulsions plus ou moins bien faites, et qu’on se propose de suivre la digestion pendant un certain temps, les choses, comme on l’a vu, se compliquent beaucoup. Il est évident qu’avec de tels mélanges hétérogènes, les résultats trouvés devront varier avec les conditions expérimentales. C’est ainsi

PEPSINE

que Huppert et E. Schütz ont constaté que la quantité d’albumose produite dans la digestion pepsique est directement proportionnelle à la quantité d’albumine et à la racine carrée du produit du poids de pepsine par le temps et la concentration de l’acide. Cette loi ne serait d’ailleurs pas acceptée par tous. Il est plus que probable que si l’on opérait avec la pepsine en milieu homogène, comme cela a été fait avec la trypsine agissant sur une solution de caséine, on constaterait l’exactitude de la loi logarithmique, qui est celle qui régit toutes les actions diastasiques.

Non-usure de la pepsine durant le travail de digestion. — La pepsine, comme tous les enzymes, agit comme catalyseur. Le travail qu’elle produit ne diminue pas son activité; et, en principe, avec une quantité donnée de pepsine, on devrait transformer une quantité infinie de substance albuminoïde. La non-usure de la pepsine peut être mise en évidence par l’expérience suivante : 5 gr. de blanc d’œuf cuit et réduit en menus fragments sont introduits dans 100 cc. HCl à 0,25 °/0; on ajoute 0,05 cc. de suc gastrique et l’on abandonne le tout à 40° jusqu’au moment où toute l’albumine est complètement dissoute. La dissolution, dans cet essai, a exigé 21 heures. On fait alors bouillir le liquide pour détruire la pepsine, on ajoute à nouveau 5 gr. d’albumine et 0,05 cc. de suc gastrique et l’on maintient à 40°. La présence des produits d’hydrolyse ralentit la dissolution. Le liquide ne devient clair, cette fois, qu’après 31 heures. On procède ensuite à un deuxième essai, dans les mêmes conditions : 5 gr. d’albumine se trouvent dissous en 21 heures. A ce moment, on ajoute encore 5 gr. d’albumine et on laisse la réaction se poursuivre. Le temps de digestion est alors de 32 heures. Il est évident que dans cette double expérience, il n’y a pas eu usure de la pepsine : en effet la dissolution de la seconde addition d’albumine par la pepsine qui avait déjà servi n’a pas exigé plus de temps que lorsqu’elle s’était réalisée sous l’action d’une pepsine neuve.

Cette expérience nous fournit aussi des données très intéressantes sur le poids de substance active entrant en jeu dans

le phénomène de la digestion. Le suc gastrique mis en expérience a été recueilli sur un chien. Il contenait 0,45 °/0 de substances solides et 0,15 °/0 de substances organiques actives. Or, 0,05 cc. de suc ont dissous 10 gr. d’albumine ; 1 cc. de la solution diastasique peut donc dissoudre 200 gr. d’albumine; et comme 1 cc. de la solution contient seul 0,0015 gr. de substance active, on en conclut que 1 gr. de substance active est capable de dissoudre en 21 + 32 = 53 heures 133.000 gr. d’albumine.

Sur l’identité possible de la pepsine et de la présure.

Dans un chapitre précédent, nous avons fait ressortir les difficultés qu’on rencontre lorsqu’on veut se prononcer sur l’identité des présures de diverses origines. Maintenant que nous connaissons mieux la pepsine, il convient d’élargir le débat et de se demander si réellement la présure et la pepsine sont des enzymes différents. La question de savoir si la présure constitue un type défini de diastase, est assez complexe. A l’origine, les propriétés coagulantes de la présure semblant caractéristiques, et, en tout cas, très différentes des propriétés dissolvantes et peptonisantes de la pepsine, on accorda volontiers à cette diastase une individualité propre ; et même plus tard, après qu’on eut reconnu qu’un grand nombre de sucs animaux ou végétaux possédaient aussi la propriété de coaguler le lait, mais avec quelques différences dans le mode d’action, on accepta l’idée de la pluralité des présures, distinctes suivant leur provenance. Cependant, les travaux récents parus sur les différents sucs coagulants ou peptonisants ébranlèrent fortement cette dernière notion et mirent même en doute l’individualité de l’enzyme présurant.

Théorie unitaire. — Une école, en effet, s’est formée qui nie l’existence de la présure et ne voit dans les propriétés de

PEPSINE

cette diastase qu’une des fonctions des enzymes protéolytiques. Les recherches effectuées en vue d’éclaircir le processus de la coagulation du lait ne furent pas tout d’abord étrangères à ce changement dans la manière de voir. On sait que l’opinion la plus généralement admise à ce sujet est que la présure dédouble le caséinogène du lait en deux substances : l’une, la caséine, qui se précipite, avec ou sans l’aide de sels de calcium; l’autre, une sorte d’albumose, qui reste en solution. L’action première de la présure sur le lait serait donc une hydrolyse protéique, et la coagulation n’en serait qu’une conséquence.

Les partisans de la théorie unitaire se prévalent en outre du fait que la présure ne se trouve pas seulement dans le suc digestif des animaux en voie de lactation, répondant ainsi à un besoin réel, mais aussi dans des organes végétaux ou animaux, où sa présence ne paraît nullement nécessaire. Pourquoi, disent-ils, rencontre-t-on de la présure, même parfois en quantités assez grandes, là où il n’y a pas trace de caséine, alors que, généralement, la sécrétion des diastases est toujours en rapport direct avec la quantité de substances qu’elles doivent transformer ? Par contre, ils font observer que toujours on trouve la pepsine associée à la présure. C’est donc, concluentils, que la présure et la pepsine ne font qu’une seule et même diastase : celle-ci, possédant à la fois les deux propriétés, coagulante et peptonisante, agirait dans un sens ou dans l’autre, suivant les conditions de milieu. On sait, en effet, que l’action coagulante se manifeste déjà dans une solution neutre, tandis que l’action protéolytique ne se produit que dans des solutions acides.

Cet argument de la présence simultanée des deux diastases dans la nature parut pouvoir être renforcé par cette constatation que ces deux diastases sont en outre toujours associées dans la même proportion. Blum et Fuld, en effet, crurent avoir démontré que les sécrétions de la pepsine et de la présure se font toujours parallèlement, non seulement dans le suc gastrique normal, mais aussi dans le suc obtenu dans les cas pathologiques. Le rapport entre les deux propriétés du suc

gastrique serait, d’après ces auteurs, tellement constant, qu’on pourrait uniquement analyser le pouvoir coagulant pour en conclure le pouvoir protéolytique. Nous verrons dans un instant ce qu’il convient de penser de cette affirmation.

Discussion. — Mais avant, reprenons, un à un, les différents arguments donnés en faveur de la théorie unitaire. Le premier est basé sur ce fait, que dans certains milieux on rencontre de la présure, alors que sa présence paraît tout à fait inutile. Pourquoi dès lors admettre l’existence d’une diastase qui ne répond à aucun besoin? La réponse à cette objection est puisée dans les travaux de Danilewsky. On sait que cet auteur a constaté que les peptones obtenues par la digestion pepsique peuvent se transformer, sous l’influence de la présure, en matières albuminoïdes plus complexes, et que ce travail de condensation se fait précisément dans des conditions qui sont défavorables à l’action de la pepsine. Dès lors, la présure apparaît comme une sorte de pepsine régressive, dont le rôle est précisément de mettre en réserve une partie des principes élaborés par la pepsine. ( Voir chapitre Plastéines.)

Passons au second argument. Le fait qu’on n’a '{ jamais rencontré, dans aucun organe animal ou végétal, delà présure, sans y trouver, à côté, de la pepsine, n’est pas probant; il est purement fortuit. C’est, du reste, le cas habituel pour les diastases de toujours se trouver dans la nature à l’état de mélange. Au surplus, si ces deux diastases se confondaient en une seule, il faudrait que cette diastase unique eût des propriétés coagulante et protéolytique toujours dans le même rapport. Or, il n’en est pas ainsi. Il existe, au contraire, des variations très sensibles, et cela, suivant la provenance des produits et les conditions dans lesquelles ils ont été obtenus. C’est ainsi que, si l’on compare les enzymes retirés, d’une part, de la muqueuse stomacale du porc, d’autre part, de la caillette de veau, on trouve :

Pouvoir digestif Pouvoir coagulant

Porc 1 1

Veau 1 9

PEPSINE

Voici comment ce résultat est obtenu : après avoir déterminé les pouvoirs digestif et coagulant de la diastase extraite du porc, pouvoirs qu’on prend pour unités, on dilue la diastase extraite du veau, de telle sorte que son pouvoir digestif soit le même que celui pris pour unité. On constate alors que le pouvoir coagulant de l’enzyme de caillette de veau est 9 fois plus grand que celui de l’extrait de porc.

Ces données cadrent d’ailleurs avec les indications de Bang et Hammersten, qui ont trouvé, le premier, qu’il y a une différence entre les présures retirées des muqueuses stomacales de l’homme et du porc ; le second, entre les présures provenant du brochet et du veau. En outre, les substances actives retirées de la caillette de veau varient aussi suivant l’âge et le mode de nutrition de l’animal :

Pouvoir coagulant Pouvoir digestif

Veau allaité 4 1

Nourri avec de l’herbe 1 2

On voit que le veau allaité a un suc gastrique riche en présure et pauvre en pepsine, tandis que l’animal nourri avec de l'herbe fournit un enzyme relativement plus riche en pepsine et plus pauvre en présure. On trouve encore des variations plus grandes si l’on compare les enzymes coagulants du commerce :

Pouvoir coagulant Pouvoir digestif

Pepsine 1 1

Présure liquide (1 à 15.000) .... 13 1

Présure en poudre (1 pour 100.000) . 27 1

Pour une unité de diastase digestive du lab en poudre, on trouve 27 fois plus de diastase coagulante que dans la même unité de pepsine. Il y a plus : on peut, par des précipitations convenables, augmenter l’une des deux propriétés au détriment de l’autre, autrement dit, ébaucher la séparation de ces deux enzymes. C’est ainsi que du sulfate d’ammoniaque, ajouté, jusqu’à saturation, à une solution renfermant les deux enzymes, les précipite tous deux, tandis qu’en employant le chlorure

de sodium, on ne précipite presque exclusivement que la présure et on laisse la pepsine dans la solution. En répétant à différentes reprises, avec la même préparation, cette précipitation au chlorure de sodium, on peut enrichir progressivement le précipité en présure.

Van Hasselt précipite par NaCl une macération dans l’eau de caillette de veau. Il recueille le précipité, le dissout dans l’eau, précipite à nouveau, etc. La marche de la purification se trouve exprimée dans le tableau suivant :

Pouvoir coagulant.

1er précipité 53

Pour une unité digestive, il se trouve dans le premier précipité 53 unités coagulantes; dans le 3e, le pouvoir coagulant est monté à 900. En partant d’une macération de muqueuse stomacale de porc, faite en présence de 5 % de NaCl, on arrive à obtenir une solution de pepsine relativement très pure : il suffit de saturer le liquide par NaCl, ce qui détermine un précipité qui renferme surtout de la présure qu’on élimine ainsi, de dialyser ensuite le liquide filtré pour enlever la majeure partie du NaCl, puis de précipiter la solution par le sulfate d’ammoniaque. Le précipité obtenu est redissous dans l’eau et on dialyse la liqueur contre une solution de HCl à 0,2 % : la solution ainsi préparée est excessivement riche en pepsine et contient seulement très peu de lab-ferment.

En vue d’arriver à une séparation analogue, Hammarsten propose l’emploi de la caséine pour purifier le lab extrait de la caillette de veau. La caséine précipite la pepsine, tandis que la présure reste en solution. La macération de caillette est faite en présence de 2,45 gr. HCl par litre. La précipitation se fait à l’aide d’une solution de caséate de soude à 4 %. 130 cc. de macération acide sont additionnés, petit à petit et en remuant, de 200 cc. solution de caséate de soude neutre. On ajoute ensuite de la NaOH à N/10 jusqu’au moment où le précipité n’augmente plus. Ce précipité contient la pepsine, tandis que la présure reste en solution.

PEPSINE

Ces faits sont certainement très favorables à l’idée de l’existence réelle de la présure à côté de celle de la pepsine, mais ils ne sauraient en constituer une preuve. Un doute subsiste; en effet, il se trouve toujours dans les liquides, en même temps que les diastases, pepsine et présure, de l’antipepsine et de l’anti présure, ainsi que des corps étrangers, dont l’action défavorable empêche l’une ou l’autre des deux propriétés diastasiques de se manifester avec toute l’intensité voulue, si bien que si l’on produit, par exemple, un accroissement du pouvoir peptonisant par rapport au pouvoir coagulant, on peut l’interpréter aussi bien par l’augmentation du pouvoir antiprésurant ou par la diminution du pouvoir antipeptonisant, que par des influences de milieu.

En somme, la question de l’identité ou de la non-identité de la présure et de la pepsine reste pendante. Voici néanmoins comment les partisans de la théorie unitaire envisagent la solution. Pour eux, la molécule de pepsine contient deux groupements différents correspondant, l’un à l’action protéolytique, l’autre à l’action coagulante. Sans que le produit soit complètement détruit, on peut affaiblir l’un ou l’autre de ces deux groupes par la saturation de certaines chaînes latérales, et mettre ainsi en relief l’autre propriété qui n’a pas été modifiée.

Il est certain que cette question de la dualité de la présure et de la pepsine, très complexe par elle-même, se trouve encore rendue plus obscure par l’existence des anticorps qui se produisent par immunisation et qui, dans certains cas, agissent à la fois sur les deux propriétés. C'est cependant dans cette voie qu’il faut s’engager, si l’on veut arriver à quelque lumière. Jusqu’ici, l’antiprésure a toujours été obtenue par immunisation, à l’aide d’une présure possédant aussi les propriétés de la pepsine. Il s’en suit que l’anticorps ainsi préparé réagissait à la fois sur les deux enzymes. Mais ce qu’il faudrait faire, c’est partir de produits purifiés, dans lesquels les deux fonctions ont été nettement séparées. On examinerait alors les anticorps formés : s’ils sont vraiment spécifiques, agissant uniquement sur une diastase à l’exclusion de l’autre, on pourra conclure de

l’existence de ces deux anticorps, antiprésure et antipepsine, à l’existence des deux enzymes correspondants. Si non, c’est la théorie unitaire qui aura gain de cause, puisqu’il serait invraisemblable que les substances qui masquent l’un des groupements dans la diastase inoculée se retrouvassent également, fixées au même endroit, dans l’anticorps formé.

Un pas a été fait dans cette voie, grâce aux travaux de Hedin. Ce savant prépare différents zymogènes à l’aide de muqueuses d’estomac qu’il fait macérer à froid dans de l’eau en présence de carbonate de calcium. Le liquide obtenu est filtré : une partie est additionnée de 20 cc. HCl à 1 °/0 par 100 cc. et est abandonnée à la température ordinaire : on obtient ainsi une solution active, pouvant coaguler le lait. D’autre part, on prend un même volume de cet extrait, mais non activé par HCl ; on ajoute 20 cc. NH3 à N/10 par 100 cc., on abandonne quelques heures à 37° et on neutralise ensuite. Ce liquide ne coagule plus le lait, mais il a acquis des propriétés tout à fait nouvelles : il est devenu un paralysant. Il ralentit ou arrête complètement la coagulation du lait, suivant la dose.

Ces antilabs ont été obtenus avec des zymogènes de porc, de cochon d’Inde, de veau et de brochet. Ces anticorps sont spécifiques, c’est-à-dire que l’anticorps provenant d’un animal paralyse très activement la présure préparée à partir de ce même animal, mais n’agit pas du tout sur la présure provenant d’un autre animal. Les paralysants qu’on a obtenus avec le cochon d’Inde et le brochet ne résistent pas à la température de 100° et perdent complètement leur propriété. Les deux autres la perdent partiellement ; mais, chose très curieuse, ils perdent leur spécificité et deviennent paralysants pour les quatre espèces. Le zymogène, traité par HCl, ne fournit plus d’anticorps quand il est traité ensuite par NH3, puis neutralisé. L’anticorps, traité par HCl, et ensuite neutralisé, perd sa propriété anticoagulante : il devient lui-même coagulant jusqu’à un certain degré. De ces expériences, il résulte que la présure est toujours accompagnée d’un anticorps : quand on traite le zymogène par HCl, on détruit l’anticorps et il

PEPSINE

apparaît une action coagulante ; quand on traite par NH3, on obtient un effet contraire, on détruit en grande partie la présure et il en résulte une action anticoagulante.

Ces données sont évidemment de nature à justifier l’idée de l’existence de plusieurs présures, mais elles ne nous fixent toujours pas sur la non-identité de la présure et de la pepsine. Cette question ne pourra être résolue que le jour où l’on trouvera dans une plante une seule de ces deux diastases, ou encore, quand on aura préparé par immunisation l’anticorps s’appliquant à une seule diastase, la présure ou la pepsine, sans toucher à l’autre.

Travail chimique de la pepsine.

Sous l’action de la pepsine, en milieu légèrement acide, les matières albuminoïdes, qui sont insolubles dans l’eau, soit à l’état naturel, soit par suite d’une coagulation, se solubilisent plus ou moins rapidement. Si, à ce moment, l’on neutralise la liqueur, on obtient un précipité. Le filtrat, porté à l’ébullition, donne en outre un coagulum. Le précipité qu’on obtient par neutralisation porte le nom acide-albumine ou de syntonine : il résulte de l’action de l’acide, et non point de celle de la pepsine. Quant au coagulum, il est constitué par de la substance albuminoïde non transformée.

Si la digestion est un peu plus avancée, le liquide ne se trouble plus, ni par la neutralisation, ni par le chauffage à 100°. A partir de ce moment, les progrès de l’hydrolyse peuvent être suivis par les précipitations plus ou moins abondantes que provoque dans le liquide l’addition de sels neutres, tels que le NaCl, le S04(NH4)2 ou le S04Zn. Au fur et à mesure que la peptonisation avance, les précipités obtenus diminuent. Les substances précipitées par les sels portent le nom d 'albumoses ou de protéoses ; les complexes non précipités sont désignés par différents auteurs sous le terme de peptones.

TRAVAIL CHIMIQUE

Kuhne et Chittenden ont distingué deux classes d’albumoses : les albumoses 'primaires, qui précipitent par le NaCl à saturation en milieu neutre, et les albumoses secondaires ou deutéro-albumoses , qui ne précipitent par le NaCl à saturation qu’en solution acide, et encore incomplètement. D’ailleurs, les albumoses primaires se divisent en hétéro-album oses, insolubles dans l’eau pure froide, mais solubles dans les solutions salines diluées, et, par suite, précipitables par dialyse, et en proto-albumoses, solubles dans l’eau pure et les solutions salines diluées.

Les albumoses primaires, qui correspondent à peu près à ce qu’on désigna un moment sous le nom de propeptones, jouissent en outre des trois propriétés suivantes :

1) Ils sont précipités, par l’acide azotique étendu, en solutions salines diluées, et ce précipité disparaît à chaud, pour se reformer par refroidissement.

2) Le ferrocyanure de potassium et l’acide acétique précipitent leurs solutions : ce précipité soluble à chaud reparaît par refroidissement.

3) En acidulant à froid par l’acide acétique un mélange, à volumes égaux, d’une solution de propeptone et d’une solution saturée de NaCl, on détermine la production d’un précipité soluble à chaud réapparaissant par refroidissement.

Les transformations que nous venons de décrire peuvent se résumer dans le schéma suivant :

D’après Kuhne et Neumeister, la peptone formée sous l’action de la pepsine se compose de 2 fractions, l’une, très résistanle à l’action de la trypsine, qu’il nomme antipeptone; l’autre, qui se laisse facilement hydrolyser par ce second

Albumine

Syntonine

Protoalbumoses

Hétéroalbumoses

Deutéroalbumoses

Deutéroaibumoses

Peptones

PEPSINE

enzyme, avec formation d’acides aminés, et qu’il appelle hémipeptone. Ces auteurs concluent que l’antipeptone dérive de l’hétéroalbumose, qui correspond lui-même à la partie la plus difficilement attaquable par les diastases digestives, tandis que l’hémipeptone provient du protoalbumose. La molécule albuminoïde se trouve donc scindée dès le début de l’hydrolyse en deux groupe : l’un, hémi ; l’autre, anti. Le mélange des deux peptones, anti et hémi, est désigné par Kuhne sous le nom d ’amphopeptone. Voici comment on peut représenter cette manière de voir :

Albumine

Groupe hémi Syntonine Groupe anti

Protoalbumoses (Albumoses primaires) Hétéroalbumoses

Deutéroalbumoses (Albumoses secondaires) Deutéroalbumoses Hémipeptones (Amphopeptones) Antipeptones

Les notions apportées par Kuhne et Neumeister ont contribué beaucoup au développement de la chimie des albuminoïdes. Ces auteurs ont appuyé leur théorie d’une série de faits nouveaux d’une valeur réelle, mais qui n’ont pu sauver la conception erronée de l’hémi et de l’antigroupe; celle-ci, en effet, après avoir été adoptée d’une façon à peu près générale, ne peut plus être, à l’heure actuelle, sérieusement soutenue. Les connaissances qu’on possède maintenant sur l’hydrolyse profonde de la matière albuminoïde, sous l’influence des acides, des alcalis ou des enzymes, nous montrent qu’on se trouve en présence d’un agrégat formé d’un très grand nombre d’acides mono et diaminés, et que, sous l’action des catalyseurs énergiques, comme la trypsine et l’érepsine, cette molécule complexe, en s’hydratant, se dédouble successivement et intégralement : il ne reste donc aucun groupe anti, plus résistant à la trypsine que les autres, ainsi que le pensait Kuhne.

La pepsine fournit les premiers termes de la dégradation hydrolytique des albuminoïdes. Ceux-ci conservent encore beaucoup des propriétés des corps dont ils dérivent; ce sont

TRAVAIL CHIMIQUE

des polypeptides de différentes complexités : ceux dont le poids moléculaire est le plus élevé et se rapproche le plus de celui de la substance primitive, constituent les albumoses; les autres, déjà plus dégradés, représentent les peptones.

Il est possible de séparer les peptones des albumoses en saturant leurs solutions, soit avec du sulfate de zinc, soit avec du sulfate d’ammoniaque. L’albumose est précipité tandis que la peptone reste en solution. La peptone, débarrassée de l’albumose, peut être fractionnée en deux parties : l’une, qui est soluble dans l’acide phosphotungstique; l’autre, qui est précipitée ; cette dernière fraction correspond aux acides diaminés complexes. Parmi les albumoses, on arrive à distinguer différentes espèces de produits, soit à l’aide de précipitations fractionnées, soit par solubilisation dans des liquides convenables, soit encore par l'emploi de toute autre propriété individuelle, ainsi qu’on le verra plus loin.

Pour se rendre compte du travail chimique produit au cours de la digestion pepsique on devrait suivre l’apparition, puis la disparition des différentes fractions d’albumoses et enregistrer l’accumulation du produit final de la réaction, qui est la peptone. Mais cette méthode, en pratique, laisse encore beaucoup à désirer. Les albumoses ne sont pas des corps parfaitement caractérisés; la peptone n’est pas, non plus, un terme stable et définitif. Dans la digestion pepsique, on n’arrive jamais à une hydrolyse correspondant à la disparition complète des albumoses, et la peptone même qu’on obtient, ainsi qu’on l’a dit plus haut, peut être divisée en deux parties plus ou moins nettes, comprenant chacune des complexes assez mal connus, au point de vue chimique.

Quoi qu’il en soit, le mode opératoire adopté est susceptible de donner une image très approchée du chimisme de la réaction. Dans les grandes lignes, on se trouve en présence d’un phénomène analogue à celui de la saccharification de l’amidon. Pour arriver au terme final, le sucre, maltose ou glucose, on passe par toute une série de dextrines qui conservent encore quelques-unes des propriétés de l’amidon

PEPSINE

initial, tout en se différenciant de celui-ci, et aussi les unes des autres. Les différents albumoses qui apparaissent au cours de l’hydrolyse peuvent être comparés à la formation de ces dextrines. Dans la saccharification de l’amidon, tout le processus chimique consiste en une suite d’hydratations amenant le complexe primitif à un état simple, le sucre. Dans la peptonisation, on assiste à une pareille transformation : la molécule albuminoïdique très complexe, de poids égal à 6000, ou peutêtre 15000, est dégradée jusqu’à donner des albumoses de poids moléculaire égal à 2400 et des peptones d’une valeur de 400. Ces corps intermédiaires sont en quelque sorte des dextrines azotées qui seront plus tard attaquées à leur tour pour arriver à des produits relativement simples, de composition définie et stable, mais en nombre assez considérable.

Les divers procédés employés pour différencier les albumoses et les peptones sont tous basés sur la méthode de la précipitation fractionnée. Avant de rechercher comment s’effectue la marche de l’hydrolyse par la pepsine, et afin de pouvoir suivre tous les changements qui se produisent, il est indispensable que nous nous arrêtions d’abord sur les divers réactifs mis en œuvre pour cette étude : nous examinerons en premier lieu l’action des sels.

Étude des différents albumoses par la méthode de la précipitation fractionnée.

La propriété que possèdent certains sels de précipiter les matières albuminoïdes de leur solution a fourni à Hofmeister la base d’une méthode de précipitation fractionnée, en vue de séparer les divers complexes qui se forment au cours de la protéolyse. Cette méthode est de plus en plus employée, bien que ses résultats ne soient pas également appréciés par tous les savants : elle compte même parmi ses adversaires des hommes de science d’une indiscutable compé-

ÉTUDE DES ALBUMOSES.

tence. Cependant elle peut, dans certaines conditions, rendre de grands services, et il serait déraisonnable de renoncer à elle, d’autant plus qu’on ne saurait actuellement par quelle autre la remplacer.

Notions générales sur le pouvoir de précipitation des sels. — Beaucoup de sels ont la propriété de précipiter les matières albuminoïdes de leur solution. La nature du précipité diffère radicalement, suivant le sel employé. Dans certains cas, le précipité obtenu est un composé métallo-organique, produit par une réaction des sels sur les substances albuminoïdes. C’est ce qui se présente avec l’acétate de fer, l’acétate neutre ou basique de plomb, le sulfate de cuivre, le chlorure de mercure. Avec d’autres sels, tels que, par exemple, le sulfate d’ammonium, le sulfate de zinc, l’acétate de potasse, le sulfate et le chlorure de sodium, le précipité est d’une tout autre nature. La matière albuminoïde précipitée n’a subi aucun changement; le précipité peut être facilement débarrassé des sels y adhérant, et il se dissout dans l’eau en une solution identique à la solution primitive. Ainsi, suivant le sel, on obtient deux actions différentes : l’une, d’ordre chimique; l’autre, d’ordre physique.

L’action physique des sels a attiré tout spécialement l’attention des chimistes. Le pouvoir de précipitation, exercé par les sels sur les matières albuminoïdes, diffère essentiellement d’après la nature respective de ces corps, et l’on peut ainsi diviser ceux-ci en trois catégories, suivant leur puissance d’action :

a) Le sulfate de zinc, d’ammonium, l’acétate de potassium, sont les agents les plus actifs : ils précipitent toutes les matières albuminoïdes naturelles et l’albumose. Dans la même catégorie peuvent entrer les nitrate et chlorure de calcium, ainsi qu’un mélange de sulfate de magnésium et de sulfate de sodium; seulement, le précipité obtenu avec ces derniers sels change de nature par un séjour prolongé en présence de ces réactifs. Tous ces sels agissent très efficacement à concentration relativement faible; leur pouvoir de précipitation augmente avec la densité du liquide : c’est-à-dire que plus la solution se rapproche du point de saturation, plus elle est active.

PEPSINE

b) Le sulfate de magnésium, qui possède aussi un pouvoir de précipitation assez considérable, mais cependant bien moins élevé que les précédents.

c) Enfin, le chlorure do sodium, le nitrate et le sulfate do sodium. Ces sels ne précipitent plus toutes les matières albuminoïdes, et mêm9 faut-il une solution très concentrée et souvent une saturation pour obtenir un précipité complet.

Les conditions chimiques et physiques du milieu influencent considérablement le pouvoir, que possèdent les sels, de précipiter les matières albuminoïdes de leur solution. La présence dans la solution albuminoïde de substances étrangères, la température et la réaction du milieu, sont des facteurs qui ont une grande importance dans le pouvoir de précipitation des sels. Dans un liquide légèrement acide, la précipitation est plus rapide et plus complète que dans une solution neutre. Il faut remarquer aussi qu’une partie de l’acide contenu dans le liquide est toujours entraînée avec le précipité, ce qui fait penser que l’acide et les matières précipitées sont probablement combinés.

On a cherché à établir une relation entre le poids moléculaire des sels et leur pouvoir de précipitation, mais ce rapport n’existe pas ; leur solubilité ou leur teneur en eau de cristallisation n’ont pas, non plus, d’influence marquante. Il est également difficile d’établir un rapport entre les autres propriétés physiques des sels et leur pouvoir de précipitation. Le mécanisme de la précipitation reste encore à expliquer. Les sels, qui se montrent actifs dans la solution albuminoïdique, ont le même pouvoir dans la solution d’hydrate de carbone et dans celle de savon. Pour certains auteurs, la séparation des substances de leur solution, par l’action des sels, provient du degré d’affinité de ces substances pour l’eau. Mis en contact avec des substances ayant peu d’affinité pour l’eau, le sel leur enlève une partie de celle-ci indispensable à leur dissolution; de là, la précipitation de ces matières. Hofmeister, qui ne se contente pas de cette explication, incline à admettre que le phénomène de dissociation qui se produit dans le sein du

ÉTUDE DES ALBUMOSES.

liquide joue un rôle dans la précipitation des matières albuminoïdes par les sels. Posternak développe l’idée émise par Hofmeister. Voici ce qu’il dit : « La matière albuminoïde ne peut être précipitée de sa solution qu’à la condition que ses micelles soient entourées d’une couche de molécules salines non dissociées qui les défendraient contre l’action dissolvante des ions. Mais en présence des micelles dissoutes dans le liquide, la distribution des molécules non dissociées n’est plus uniforme comme dans un milieu libre d’albuminoïde. Les micelles, exerçant leur attraction plus ou moins grande sur les molécules non dissociées, suivant la constitution chimique de ces dernières, forment des centres où la concentration des molécules est plus grande que dans l’intervalle entre les micelles. Plus l'affinité dos micelles pour un sel quelconque est grande, plus facilement sera atteinte autour d’elles la concentration des molécules nécessaires pour précipiter l’albuminoïde. »

Les notions que l’on possède sur le pouvoir de précipitation des sels vis-à-vis des matières albuminoïdes ont servi de point de départ à un grand nombre de recherches scientifiques. Différents auteurs emploient les sels pour purifier, séparer, caractériser les différentes matières protéiques, ainsi que les nombreux produits de leur dédoublement. En particulier, on a fait un classement des matières protéiques, suivant la facilité avec laquelle les sels précipitent leurs solutions.

La caséine, le fibrinogène appartiennent à un groupe de matières protéiques facilement précipitables. La caséine peut être précipitée complètement par le sulfate de magnésium, ainsi que par le chlorure de sodium à saturation. Le fibrinogène est précipité de sa solution, si l’on ajoute à celle-ci un volume égal de chlorure de sodium saturé. Le groupe des globulines forme la limite des corps facilement précipitables. Elles précipitent complètement par le sulfate de magnésium à saturation, ou encore, de leur solution neutre, par le chlorure de sodium. L’albumine n’est pas précipitée complètement par le chlorure de sodium, ni par le sulfate de magnésium, mais elle

PEPSINE

l’est complètement par le sulfate de zinc et le sulfate d’ammonium. Les produits du dédoublement des matières protéiques se comportent très différemment vis-à-vis des sels : l’hétéroalbumose, par exemple, est complètement précipité de sa solution neutre par le chlorure de sodium ; d’autres, comme le deutéro-albumose C, ne précipitent qu’en présence de sulfate d’ammonium à saturation dans un milieu acide.

En effet, en changeant la réaction du milieu, on obtient aussi des résultats différents, qui fournissent souvent des renseignements utiles sur la nature des matières protéiques. L’albumine ne précipite point de sa solution quand on l’acidifie par l’acide acétique, ou lorsqu’on sature sa solution neutre par le chlorure de sodium. Mais si, après avoir saturé de NaCl la solution d’albumine, on l’acidifie ensuite avec l’acide acétique, on obtient un précipité. On constate le même phénomène en précipitant l’albumose par du chlorure de sodium : quand on ajoute à une solution d’albumose primaire du chlorure de sodium jusqu’à demi-saturation, on n’aboutit pas à une précipitation ; mais le précipité apparaît aussitôt que la réaction du liquide devient acide. Le précipité ainsi obtenu est l’hétéro-albumose.

Rappelons enfin, pour terminer, que les diastases, qui, à différents point de vue, se rapprochent des albuminoïdes, sont précipitées par le sulfate d’ammoniaque.

Différenciation des substances albuminoïdes naturelles par la méthode de la précipitation fractionnée. — Comme nous venons de le voir, les sels se comportent de façon très différente avec les diverses matières albuminoïdes, et leur pouvoir de précipitation peut fournir, en certains cas, de très utiles indications. Un pas en avant a été fait dans cette voie par Hofmeister et ses élèves. Ce savant a démontré qu’on peut aboutir à la différenciation des diverses substances albuminoïdes en se servant d’un seul sel, employé à des doses différentes. La méthode de Hofmeister est basée sur les observations suivantes : Quand on ajoute avec précaution à une solution d’albumine une solution de sulfate d’ammonium, on

ÉTUDE DES ALBUMOSES.

constate, qu’en présence d’une certaine dose de ce sel, le liquide, d’abord transparent, se trouble. Si, après un repos, on filtre, le trouble reparaît dans le liquide transparent, sitôt qu’on y ajoute une nouvelle quantité de sel et ainsi de suite, jusqu’à ce que l’albumine soit entièrement précipitée. La précipitation est donc continue et graduelle jusqu’à la complète disparition de l’albumine de la solution. Les deux limites : commencement et fin de la précipitation, correspondent à des teneurs constantes de sel. La limite inférieure correspond à une dose de sel provoquant un trouble persistant ; la limite supérieure, à une dose de sel donnant une précipitation complète.

Les deux limites caractéristiques de précipitation ne s’observent pas seulement avec les solutions d’albumine, mais avec toutes les matières albuminoïdes. Seulement, les concentrations de sel, correspondant aux deux limites de précipitations, diffèrent considérablement, suivant les matières albuminoïdes employées. Il résulte donc qu’on peut aboutir à une différenciation des différentes substances appartenant à la classe des albuminoïdes, par la détermination des deux limites de précipitation. Pour obtenir des résultats constants par la méthode de précipitation fractionnée, il faut se placer dans des conditions toujours les mêmes et strictement déterminées. Voici comment on procède dans ces sortes d’essais :

La solution albuminoïde est amenée à une teneur d’environ 2 °/0 ; la solution de sulfate d’ammonium est préparée par saturation à froid ; elle a un poids spécifique de 1,253-1,255. On prend une série de tubes à réaction, numérotés. Dans chacun, on verse 2 centimètres cubes de solution protéique. On ajoute 6 centimètres cubes d’eau dans le tube n° 1 et l’on mélange; on verse ensuite dans ce tube 2 centimètres cubes de solution saturée de sulfate d’ammonium, on agite le tube avec précaution pour éviter la formation d’écume et on laisse reposer. Dans le tube n° 2 et les suivants, on ajoute la solution saline, en augmentant chaque fois de 1/10 de centimètre cube, tandis qu’on diminue en conséquence l’eau ajoutée, afin d’arriver dans tous les tubes à un volume de 10 centimètres cubes.

PEPSINE

Le premier tube dans lequel apparaîtra une opacité durable nous indiquera la limite inférieure de précipitation. On exprimera cette limite par le nombre de centimètres cubes de la solution de sulfate employée.

Pour déterminer la limite supérieure, on laissera reposer tous les tubes troubles pendant 24 heures, après quoi on filtrera. Le liquide, filtré et complètement limpide, sera additionné de 2/10 centimètres cubes de solution saline. Le tube dans lequel n’apparaîtra plus de trouble au contact de la solution saline indiquera la précipitation complète et marquera par conséquent la limite supérieure. Voici les résultats qu’on obtient avec cette méthode, en opérant sur les solutions de matières albuminoïdes naturelles :

Limite

inférieure.

supérieure.

Fibrinogène

Caséine

Globuline

Albumine

Le fibrinogène et la caséine ont une limite inférieure de précipitation assez rapprochée. Le premier commence à précipiter quand la solution est additionnée de 1,9 cc. de sulfate d’ammonium saturé ; la seconde commence à précipiter avec 2,2 cc. de ce sel. La globuline ne commence à précipiter qu’en présence d’une concentration supérieure de sel. Entre la globuline et l’albumine, l’écart entre les limites inférieures est plus grand encore : de 2,9 à 6.4. La même gradation se retrouve dans la limite supérieure ; le fibrinogène précipite complètement en présence de 2,8 cc., tandis que l’albumine précipite complètement en présence de 9 centimètres cubes. Toutefois la dose qui provoque la précipitation complète est toujours plus caractéristique que celle en présence de laquelle la précipitation commence à se former.

Nous avons vu plus haut que, par un choix judicieux de sels comme matière précipitante, on pouvait faire un certain classement des matières albuminoïdes. Le fibrinogène et la

ÉTUDE DES ALBUMOSES.

caséine sont précipités par le chlorure de sodium, tandis que la précipitation de la globuline ne s’obtient qu'avec le sulfate de magnésium; enfin, l’albumine ne précipite ni parle chlorure de sodium, ni par le sulfate de magnésium. Avec la méthode de précipitation fractionnée on arrive à un classement analogue : le fibrinogène possède la limite inférieure la plus basse, et l’albumine, la plus élevée.

Différenciation des produits de transformation des matières albuminoïdes. — La méthode de précipitation fractionnée permet, dans beaucoup de cas, de séparer de leur solution diverses matières albuminoïdes naturelles qui s’y trouvent mélangées. Ainsi, on peut arriver à séparer de la même solution le fibrinogène, la globuline et l’albumine. On peut aussi tirer profit de la connaissance des limites supérieures pour la purification d'une substance albuminoïde quelconque. Enfin, Hofmeister et ses élèves ont appliqué cette méthode à la séparation des produits d’hydrolyse des matières protéiques. Ils sont parvenus à isoler et à caractériser différents produits de dédoublement, et, à l’heure actuelle, la méthode se trouve strictement liée, non seulement aux notions que l’on possède sur la marche de la peptonisation, mais aussi à l’idée qu’on se fait du groupement moléculaire des différentes substances albuminoïdes. Si, après avoir fait subir à une matière albuminoïde naturelle l’action de la pepsine, on traite la liqueur par une solution de sulfate d’ammoniaque, on constate que le liquide de digestion se comporte de la même façon qu’une solution contenant un mélange de différentes substances. La limite supérieure n’est plus une limite stable, comme c’était le cas pour une solution ne contenant qu’une seule substance, mais la liqueur accuse plusieurs limites supérieures très facilement reconnaissables.

En appliquant la méthode de précipitation fractionnée aux matières albuminoïdes naturelles ayant subi l’action de la pepsine, on arrive d’abord, à l’aide de doses relativement faibles de sulfate, à une limite supérieure. Le liquide, débarrassé de son précipité, ne précipite plus par une nouvelle

PEPSINE

addition de 0.2 cc. de sulfate; mais quand on augmente sensiblement la dose de sel, un nouveau précipité apparaît, et, par une addition graduelle de solution saline, on aboutit à une nouvelle limite supérieure. Celle-ci est suivie d’un point neutre, où il n’y a plus de précipitation, puis vient une nouvelle limite inférieure, où commence un précipité, suivie d’une troisième limite supérieure. Voici, d’après Pick, la marche de la précipitation fractionnée d’une solution de peptone Witte à 5 °/o.

Existence des limites inférieures et supérieures