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t:z Plasinodium vivax. — b] Plasniodiuni falciparuni. c" Plasinodium nialariœ. — d) Cilobules rouges et globules blancs.

A. Maloiuc ci fils. Èdit.

Imp.. /'an':

BACTEJUOtOGJE 129

2^ Recueillir le pus à la pipette ;

3® Faire un frottis sur une lame ;

4® Ensemencer un tube de bouillon ;

5' Aspirer un peu de pus dans un tube d'épreuve que Ton ferme ensuite aux deux bouts sur la lampe à alcool, de façon à éviter Tévaporation ;

6" Porter 24 heures à l'étuve le tube de bouillon et le tube* d'épreuve ;

7® Après 24 heures, on fait des frottis de bouillon et du tube d'épreuve. Le plus souvent, nous faisons le premier frottis et les deux autres frottis sur la même lame. On fixe à la chaleur. On colore et on sèche ;

8® On compare les trois frottis au sujet de l'abondance en bactéries. La comparaison avec la culture sur bouillon n'est pas nécessaire, comme l'ont admis dernièrement sir A. Wright et P. DelbeL

Ce qu'il faut voir :

I ® 11 y a dans le frottis du tube d'épreuve (pyoculture) une multiplication très nette des microbes. Les chaînettes sont plus longues que sur le premier frottis quand il s'agît de streptocoque. Les grappes de staphylo plus serrées. Les gros bacilles sont devenus des filaments, etc. La pyoculture est positive ;

2^ Les microbes ne se développent pas dans le pus, mais diminuent. Les humeurs sont bactéricides. "La pyoculture est négative ;

3** Certains microbes sont tués, tandis que d'autres se développent dans le pus. Fixer l'espèce qui se développe. La pyoculture est élective, positive pour la ou les espèces qui se multiplient, négative pour les autres.

Ce qu'il faut dire :

D'après le professeur Delbet :

Si la pyoculture est positive et surtout si le développement des microbes est plus abondant dans le pus que dans du bouillon = pronostic sérieux, souvent nécessité de débridement.

Si la pyoculture est nulle, le malade lutte inutilemept = aider cette lutte sans la troubler.

Si la pyoculture est négative, il faut s'abstenir;

Si la pyoculture est élective, elle n'a guère de significations que lorsque la multiplication intéresse les gros bacilles Gram positifs (perfringens ou vibrion), elle a alors la même signification qu'une pyoculture positive.

En réalité, l'expérience a montré que la pyoculture n'a pas une valeur suffisante pour indiquer ou contre-indîquer l'acte chirurgical. Il faut y voir seulement une source de renseignements pronostiques au sujet de l'évolution d'une suppuration. Ce renseignement prend place dans le faisceau des renseignements cliniques et ne possède pas à lui seul une valeur absolue.

Reoherohe des amibes dysentériques dans les selles

La recherche des amibes dysentériques est devenue une technique courante 3e laboratoire, non seulement dans les pays tro-

Fig. 43. — Amibes dysentériques dans des matières fraîches. L'amibe dysentérique comprend une partie grànufeuse contenant le noyau et des hématies phagocytées et une partie transparente et éminemment mobile. Ceite partie transparente émet des pseudopodes. L'amibe dysentérique est très mobile, ses grandes dimensions la distinguent des deux leucocytes et des quatre globules rouges que contient la préparation.

picaux, mais aussi. dans nos contrées. Le retour des dysentériques da[ns la niétropole,. la possibilité d'observer des dysenteries amibiennes autochtones nécessitent la connaissance approfondie de cette technique,^ qui, seule, apporte le signe de certitude de la ^dysenterie amibienne, en découvrant la présence de l'élément • pathogène*

A. Priêpahations fraigubs.

Ce qu'il faut :

I® Faire aller le dysentérique à la selle, sur un bassin préalablement lavé à l'eau bouillante, séché et maintenu à une température tiède pour la main ;

2^ Une platine chauffante, un fil de platine ;

3^ Des lames et des lamelles tièdes sur la platine ;

4® Du bleu de méthylène ;

5' Un microscope avec un objectif 6.

Ce qu'il faut faire :

Recueillir le plus tôt possible, après l'émission, une parcelle glaireuse et sanguinolente de matières avec le fil de platine, préalablement flambé, et la porter sur une lame tiédie.

Ajouter une goutte d'eau distillée tiédie, si cette parcelle est trop consistante. Recouvrir ensuite d'une lamelle.

On peut aussi ajouter, dans la goutte d'eau, une gouttelette de bleu.

Examiner à sec, avec l'objectif 6, en diaphragmant fortement.

Ce qu'il faut voir :

I® Les amibes dysentériques. Elles apparaissent sous forme de masses claires, réfringentes, d'autant plus visibles que le fond est plus coloré, d'où l'avantage qu'il y a à y ajouter du bleu. Les amibes apparaissent alors comme des « étoiles brillantes dans le ciel ». Ces petites masses se déforment et se déplacent en poussant des pseudopodes. Elles sont formées de deux parties : une granuleuse, le corps de l'amibe, et une réfringente, les pseudo-

podes. Dans la partie granuleuse, on voit souvent des globules rouges ou des débris de globules rouges. C'est là un caractère propre à Tamibe dysentérique ;

a® D^ amibes enkystées, masses arrondies, inertes et inco^ lores ;

3® Les amibes du côlon, masses protoplasmiques, elliptiques, très granuleuses, émettant peu de pseudopodes, ne présentant pas une structure différente pour les pseudopodes et le corps de Tamibe ; enfin, ne contenant jamais de globules rouges ;

4^ Des leucocytes. Beaucoup plus petits et immobiles. Sanç phagocytose de globules rouges ;

5^ On peut voir aussi dans ces matières des protozoaires de typés différents qui peuvent, dans quelques cas, à eux seuls, en absence de toute amibe dysentérique, provoquer des entérites chroniques avec diarrhée rebelle = Lamblia intestinaliSj Tetramiius mesnili et Trichomonas intestinalis.

Fig. 4i.

Lamblia intestinalis Te tramitus Mesnili Trichomonas intestinalis

En somme, Tamibe dysentérique se reconnaît par ses pseudopodes actifs et ses globules rouges.

B. Préparations stables.

Ce qu'il faut :

De Talcool à go* ; Du sublimé acétique :

Sublimé 4 grammes.

Acide acétique glacial. ... 1 centimètre cube. Eau 100 — -

ou Tacide osmique à i p. loo ; De l'alun de fer à 3 et à i p. lOo ; De lliématoxyline à i p. loo :

Hématoxyline 1 gramme.

Alcool à 90* 10 —

Eau dislillée 90 —

Ce qu'U faut faire :

1° Faire un étalement avec une parcelle de mucus sanguinolent ;

2^ Fixer aux vapeurs osmiques a minutes, ou au sublimé acéti(^e 4 heures ;

3° Laver à Talcool à 90*, renouvelé 2 fois, laisser en contact 1/2 journée ;

4^ Plonger 24 heures dans la solution d'alun à 3 p. 100 ;

6* Puis 24 heures dans la solution dliématoxyline ;

6® Différencier sous micro à Taiun de fer à i p. 100 de 5 à 10 minutes ;

7". Déshydrater par l'alcool à 90**, Talcool absolu. Passer au xylol. Monter au baume sous lamelle.

Ce qu'U faut dire :

La présence d'amibes à pseudopodes et à globules rouges permet d'affirmer la dysenterie amibienne. On confirmera ce diagnostic en inoculant, dans le rectum d'un jeune chat, 10 centimètres cubes de matières fraîches. Dans ces conditions, si les selles sont incontestablement dysenlériques, on observe des signes de dysenterie expérimentale après le quatrième jour.

Reoherohe des kystes amibiens dans les matières

On connaît, depuis les travaux classiques de G. Mathis et de P. Ravaut, l'importance des rejets de kystes après la guérison de la dysenterie amibienne. Il est nécessaire de suivre cette élimination. Les kystes représentent la forme de résistance des amibes et sont cause des contaminations.

Ce qu'il faut :

1° Des matières fraîches ;

2*^ Des lames et des lamelles ;

3' Une solution d'acide osmique à i p. loo ;

4" Une solution aqueuse d'hématoxyline à i p. 200.

Ce qu'U faut faire :

I® Examen frais. Déposer siir une lame une parcelle de matières que l'on dilue dans une goutte d'eau chlorurée à 8 p. 1000 si nécessaire. Recouvrir d'uae lamelle.

Fig. 45.

^ Bn haut» 3 kystes d'amibes dysentériques ; double paroi, quatre noyaux, chromidium (en bâton noir), taille 10 à 15 ji.

En bas, 3 kystes d'amibes eoli : double paroi, plus de quatre noyaux, pas de chromidium, taUle 15 à 20 1».

BACTERIOLOGIE 135

Examiner d'abord à Tobjectif 5, puis à lobjeclil 8, pour ce dernier diaphragmer fortement ;

2® Examen rapide, avec fixation (Mathis). Etaler avec un fil de platine une parcelle de matière sur une lame, exposer avant dessiccation la lame pendant 3o secondes aux vapeurs d'acide osmique à I p. 100 ; sur le frottis toujours humide verser une goutte de la solution aqueuse d'hématoxyline ; attendre quelques secondes, puis recouvrir d une lamelle, chasser Texcès de liquide au papier buvard ;

3** Préparation sèche. Procéder comme pour les amibes (voir p. i33).

Ce qu'il faut voir :

1° Examen à frais : objectif 5, les kystes apparaissent comme des taches réfringentes sur le fond granuleux.

Objectif 8, ils ont un double contour et des noyaux que Ton peut compter ;

^^ Examen rapide (technique Mathis) : le cytoplasma a une teinté brune tirant sur le violet, les noyaux ont une membrane plus foncée avec des granulations périphériques. Les enveloppes des kystes se détachent en brun presque noir sur. le fond clair de la prét)aration.

Les kystes typiques d'amibes dysentériques sont pourvus de 4 noyaux et présentent î\ leur intérieur des masses oblongues d'une substance réfringente à frais et qui se colore en noir intense par la laque ferrique :• c'est le chromidium. Les noyaux de I à 3 jt , montrent une couronne de granulations appliquées contre la membrane et un amas de granulations centrales. Les kystes dysentériques ont de lo à i5 p..

Les kystes ifypiqùes d'amibes CoZi sont pourvus de 8 noyaux et plus, n'ont pas de chromidium. Les noyaux ont la même structure. Les kystes d'amibes coli sont plus volumineux quelles kystes dysentériques, ils ont de i5 à 20 [Jt..

On ne confondra pas ces kystes avec :

Les gouttelettes de graisses, jaunes à frais, sans double paroi.

Les débris végétaux, sans noyaux.

Les kystes de lamblia, avec leurs lignes flexueuses à l'intérieur.

Blastocystis homînis, double paroi faisant saillie à deux pôles intérieurs et contenant à ce niveau s noyaux.

En somme ne conclure à kystes dysentériques qu'après constatations :

D'une double paroi ; "

De q\iatre noyaux ;

D'un diamètre au-dessous de lo (x.

Reoherohe des kystes dysentériques par le prooédé du tamisage de J. Caries et Ed. Barthélémy^

La recherche, dans les matières des kystes dysentériques et des œufs de parasites prend de jour en jour une plus grande importance. Pour avoir une valeur, cette recherche doit porter sur la quantité la plus volumineuse possible de matières. La méthode de tamisage de J. Carlbs et Ed. Barthélémy peut à ce sujet être particulièrement précieuse. Nous l'avons employée avec M. le médecin major Besson au laboratoire du Val-de-Grâce avec d'excellents résultats.

Ce qu'il faut :

i' Des niatières fraîches. Les matières solides sont aussi utiles que les matières liquides. Pour faire un examen plus fructueux, quand il s'agit de rechercher des kystes amibiens, on fera* prendre la veille un lavement avec :

Iode gr. 25.

lodure de potassium. ... 1 gramme.

Eau 1.000 —

Les selles seront recueillies de lo à 24 heures plus tard. Pour l'examen, il faut environ 20 grammes de matières ;

1. Jacques Garles : La dysenterie amibienne et les entérites chroniques de guerre, Vigot, 1918.

2^ Les tamis suivants :

Un tamis métallique :

s La toile métallique ordinaire des laboratoires suffit, à maillés de I millimètre.

Un tamis de soie :

Pour les kystes dysentériques, il faut un tamis dé 60 maillés par centimètre ;

Pour les œiifs d'helminthes, il faut un tamis de 82 mailles par centimètre.

Voici comment on dispose ces tamis : on découpe un carré de i5 centimètres de côté, on le plie en quatre et on le dispose dans un entonnqir sous forme de filtre sans, pli ;

3* Comme solutions :

Une solution salée physiologique formolée à lo p. loo.

Une solution formo-citrique :

Acide citrique .... 12 grammes

Eau ,. . §6 — Densité : 1.047

Formol à 40 %. / . . "^2 — )

De réther ; .

4** Une forte centrifugeuse.

/" Ce qu'il faut faire :

I® Dçposer les 20 grammes de matières dans un verre à expérience de 125 centimètres cubes et ajouter en délayant avec un agitateur de verre de la solution salée formolée jusqu'à ce qu'on obtienne une émulsion homogène ; •

2® Premier tamisage sur le filtre ^métallique ;

3° Deuxième tamisage sur le filtre de soie ;

4® Centrifuger le liquide filtré une minute à la vitesse de 1 ,8oD tours ;

' 5^ Vider le liquide surnageant. Délayer le culot dans la solution formo-citrique et ajouter 2 cent, d'éther. Agiter fortement pour détacher le culot ;

6^ Centrifuger une deuxième fois, 3o secondes à 1.800 tours ;

13d DIAGNOSTICS BIOLOGIQUES EN CLIENTÈLE

7** Délayer avec une effilure de pipette, ferméCvà la lampe, la zone de séparation de Téther et du liquide dans laquelle quelques kystes auraient pu être entraînés. Centrifuger à nouveau 3o secondes à 1 .800 tours ;

8^ Vider brusquement tout le liquide surnageant et ne conserver que le culot.

Ce qu'il faut voir : . -

On examinera le culot ainsi obtenu, dilué avec une goutte de la solution de Lugol, entre lame et lamelle. Débarrassé des graissa, des leucocytes, des hématies, d'une grande quantité de bactéries et de résidus alimentaires/ celui-ci ne contient que les ^ystcs de Protozoaires, les œufs d'Helminthes et quelques débris de densité élevée.

Cette méthode comporte divers avantages :

I " Elle permet de faire porter les recherches sur la totalité des kystes contenus dans 20 à 3o grammes de matières ;

2* Grâce à l'emploi de l'éther et de la solution formo-citrique, on supprime la presque totalité des matières étrangères ;

3® On peut observer dans un seul champ un nombre important de kystes ;

4* On découvre souvent en même temps des kystes de VE. dysenteriœ, de VE. coli, ceux de Lamblîa et des œufs de Trichocéphales et autres parasites.

Cette méthode est simple et rend de grands services dans les recherches des parasites de protozoaires intestinaux.

Comment préparer un vaooin iodé par la méthode de Banque et Senez

On peut préparer des vaccins différents suivant lô mode de stérilisation de la culture microbienne. Les vaccins chauffés à 56** ou 60® ou vaccins dé Wright sont de beaucoup les plus répandus. Ils ont l'avantage d'être de préparation facile et de conservation prolongée. Ils ont à notre avis l'inconvénient d'être plus

toxiques que les vaccins iodés. Les vaccins stérilisés à Téther ne sont pas de réalisation facile dans la pratique courante. Nous employons depuis bientôt 2 ans des vaccins préparés suivant la technique.de Banque^ et Senez de Marseille. La technique fixée par ces auteurs est des plus simples. Elle est à la portée de tous les laboratoires de bactériologie. J*ai pratiqué depuis 2 ans des auto ou hétérovaccinations dans la méningite cérébro-spinale, dans la fièvre typhoïde, dans la grippe, dans la furonculose, dans le rhumatisme blennorrhagique, dans les infections graves des plaies. Pas lé moindre accident, quelques résultats très encourageants dans la furonculose, les infections des plaies et dans le rhumatisme blennorrhagique. Les injections de vaccins sont très peu douloureuses ; même avec des souches très virulentes comme le sont les streptocoques des plaies de guerre, je n'ai jamais observé la moindre tendance phlegmoneuse et cependant des expériences faites avec Banque et Senez sur Tanimal nous prouvaient que ces vaccins engendraient bien les réactions immunisante^ antimicrobiennes ^.

Ce qu'il faut :

i* Une culture sur gélose inclinée de 24 heures du inicrobe dont on veut préparer le vaccin. Ce microbe est d'origine différente suivant qu'on prépare un vaccin de stock ou un vaccin autogène.

Vaccin de stock : ensemencer le microbe d'une souche pure. Vaccin autogène : ensemencer le microbe isolé et sans association provenant du malade à vacciner. Lorsqu'il s'agit de furoncle, le médecin recueille à l'aide d une pipette stérile et flambée (prendre une grosse effilure, le pus est épais) un peu du pus du furoncle. Aspirer un peu d'air pour faire monter la goutte de pus et fermer ensuite l'effîlure à la lampe. Pour expédier cette pipette il faut la raccourcir ; enfoncer le bouchon avec une épingle à chapeau flambée

1. Voir Noël Fiessinger, Banque et Senez, Société de Biologie, 13 avril, 25 mai, 6 juillet 1918.

jusqu'à ce que le bouchon reste à quelques millimètres du pus et sectionner le tube au-dessus avec une lime à ampoulô dont chaque médecin possède une collection de réserve, mettre la pipette dans une boîte dans du coton, la boîte sera de préférence en bois ou en fer, l'énergie intempestive des postiers né permet pas l'usage des boîtes de carton, où, par expérience, j'ai appris que tout se cassait.

L'ensemencement proprement fait d'un pus de furoncle ne. fait cultiver que du staphylocoque doré dans la grande majorité des cas ;

a^ Une installation de laboratoire avec une étuve à 87^, un microscope avec immersion et un objectif 6 ou 7 ;

3® De l'eaû salée isotonique à 8 p. 1000 stérilisée en tube de 10 centimètres cubes ;

4® De la liqueur iodo-iodurée au centième :

Iode 1 gramme.

lodure de potassium. ... 2 — Eau .200 —

5^ Une solution d'hyposulfîte de soude à 2 p. 100 stérilisée à 120**, puis par ébullition avant chaque emploi ;

6® Un hématîmètre de Malassez, au début pour la numération des microbes ; \ .

7" Effiler sur le chalumeau des ampoules. Faire sur le chalumeau des pipettes, en chauffant à flamme étroite de façon à obtenir une effilure biusque. Sur cette pipette, à la hauteur nécessaire pour obtenir environ une ampoule de 2 centimètres cubes, pratiquer une effilure sans séparation complète. On a ainsi une pipette ampullaire. C'est un procédé d'improvisation. Mieux vaut posséder des petites bouteilles stérilisées comme celles du vaccin Vincent, ou des ampoules toutes préparées, stérilisées et à remplissage automatique ou par le vide. Ces techniques conviennent pour la préparation des stocks i; dans la pratique médi-

1. A ce sujet, le matériel breveté de Ranque et Senez, qui permet' le remplissage automatique des ampoules en milieu stérile, né peut être dépassé au point de vue sécurité scientifique.

BACTÉRIOLOGIE 14d

cale des autovaccins, point n'est besoin de préparer de grandes

quantités de vaccin, la simple mise en pipette-ampoule suffit.

Ce qu'il faut faire :

I® Lorsque Ton possède une culture pure en apparence* sur gélose inclinée, on en fera la preuve par l'examen d'une ou plusieurs colonies étalées sur lame, fixées et colorées par la méthode de Gram ;

2^ Avec une pipette dont la pointe sera ,un peu recourbée à la flamme, on a caresse » la culture. J'emploie intentionnellement ce verbe à la place de gratter. J'ai vu souvent , gratter une gélose, ce grattage ramène autant de gélose que de culture. Il faut la culture sans la gélose, c'est la raison pour laquelle je préfère la pipette effilée, qui est plus douce, au fil de platine qui est trop brutal ;

3® Quand la pipette est chargée de culture, la porter sans souîl-^ lure après avoir flambé et refermé le tube de culture dans un tube d'eau salée stérile dont on aura au préalable flambé l'orifice. Cette eau se trouble* On recommence proprement cette dilution jusqu'à la concentration désirée.

Comment savoir qu'elle est atteinte ? Avec un peu d'habitude, c'est facile. On doit obtenir un trouble à peu près semblable à celui du vaccin de Vincent.

Si on hésite, on doit faire une numération microbienne.; il faut en général obtenir uh vaccin qui contienne par centimètre cube soit 800 millions, soit i milliard de germes. On aspire à la pipette de Malassez et on dilue au 1/200 avec du sérum salé. On dépose dans la chambre de l'hématimètre et on numère dans un tout petit carré. On doit y trouver de a à 3 éléments microbiens,

3 X 20 X 20.000 = 1.200.000 par millimètre cube soit par centimètre cube : i milliard 200 millions.

Si la concentration obtenue est supérieure, on la dilue avec du sérum stérile ; si elle est inférieure, on continue l'émulsion. 11 faut savoir que l'approximation est toute relative, les vaccins

iodés ne sont pas toxiques, il n'y a pas d'inconvénient à dépasser un peu les doses ;

4* Quand Témulsion est à sa concentration optima, on la stérilise en y versant pour lo centimètres cubes de 6 à lo gouttes de solution îoduréc. Laisser une demi-heure en contact ;

5® Pendant cette demi-heure il est utile de transvaser le vaccin avec une pipette stérile dans un tube stérile pour éviter les inconvénients qui résulteraient d'une non stérilisation des microbes déposés sur les parois du verre au-dessus du niveau du liquide ;

6"* Après cette demi-heure, ajouter au mélange 2 à 6 gouttes de la solution stérile dTiyposulfite de soude. L'iode est neutralisé. Le vaccin s'éclaircît, il est stérilisé. Mais il faut savoir qu'à partir de ce moment il peut être souillé ;

7* La mise en ampoule doit être aussi aseptique que possible. Si le vaccin doit être utilisé sur place et tout de suite, on peut le répartir en simples tubes stériles fermés au coton. Pour le conserver, on le met en ampoule. Remplir par aspiration l'ampoule pipette, fermer horizontalement sur la petite flamme du Bunsen l'effîlure supérieure, puis l'effilure inférieure. Raccourcir les pointes à la flamme.

J'ai aussi employé pour établir des stocks la technique suivante : faire bouillir en récipient couvert et dans de l'eau pendant une demi-heure des verres à ampoules fermées à un bout, refroidir, les ampoules se remplissent d'eau, orf les retire avec une pince flambée, on les prend par l'effilure fermée pour porter la zone liquide sur une flamme bleue (alcool de préférence) jusqu'à ébullition et expulsion du jet de leau intérieure, plonger alors rapidement cette extrémité dans la culture, l'ampoule se remplit toute seule, on la ferme ensuite.

Ces vaccins iodés doivent être conservés à froid, si possible à la glacière.

Ce qu'il faut voir :

Le vaccin doit être homogène, lactescent sans grumeaux et sans flocons. Les souillures floconneuses sont dues à des chamt-

pignons de souillure. Ces inconvénients n'existent pas si Je vaccin est employé dans les deux ou trois semaines qui suivent la préparation.

. Gomme quantité, on commencera par a5o à 5oo millions. Dans la furonculose, je fais 4 à 5 injections de suite espacées de 24 heures et je cherche à atteindre une densité de a milliards. L'injection est très peu douloureuse et très bien supportée. Cette ataxicité est une des caractéristiques des vaccins iodés. J'ai toujours vu réussir cette vaccination dans la furonculose et dans les anthrax quand tous les autres médicaments échouaient. Je ne parlerai pas de l'emploi des vaccins iodés dans le traitement de la fièvre typhoïde, Ranque et Senez s'en montrent très partisans. Dans le rhumatisme blennorrhagique, ils donnent dans quelques cas d'excellents résultats, comme d'ailleurs certains autres vaccins commerciaux.

Comment préparer un vaccin chauffé

La technique de préparation et de numération est la même que la précédente. Quand l'émulsîon bactérienne est prête, on la met en ampoule ou en tube avant toute stérilisation. Quand les ampoules sont fermées à la lampe, on les porte dans un bainmarie à 56'-6o* pendant trois quarts d'heure. Ce chauffage remplace l'iode. Il a l'avantage de stériliser le vaccin après fermeture des ampoules ^t ainsi d'exposer moins que la stérilisation à l'iode à des infections secondaires. Mais il a l'inconvénient d'être plus toxique et plus douloureux en injections que le vaccin iodé.

On ne doit, pas stériliser par la chaleur des microbes qui sont sporulés, le chauffage h 6o' ne suffît pas pour empêcher la germination des spores.