EXAMBN DES FROTTIS FIXÉS ET COLORÉS

Ce procédé offre l'avantage de ne pas nécessiter une préparation spéciale d'un objectif et d'un éclairage ; mais, par contre, il a comme inconvénient d'être moins rapide.

Deux méthodes classiques peuvent être employées : la méthode rapide, la méthode lente. Une troisième méthode connue sous le nom de méthode de Fontana-Tribondeau est préférable et sera étudiée plus loin.

Ce qu'il faut faire :

A. Méthode rapide. ...

I** Sécher les frottis à Tair et fixer la préparation à Talcool-

éther ;

2® Colorer au colorant de Giemsa ainsi préparé. On mêle dans une éprouvette :

Solution de Giemsa X gouttes.

Eau. distillée ....... 10 centimètres cubes.

Solution de carbonate de soudo

aul/4000« '. . . . . X gouttes. ,

Cette solution est versée trois fois sur la lame, et chaque fois, on chauffe à la lampe, jusqu'au dégagement des vapeurs. Laver à l'eau. Sécher. Examiner à l'objectif à immersion.

B. Méthode lente, -. ■ \^ Verser dans une boîte de Pétri le mélange :

Solution de Giemsa 1 centimètre cube.

Eau distillée 10 — ■ —

2*^ Les lames, fixées au préalable à Talcool-éther,' y sont déposées, les frottis regardant en bas ; elles sont appuyées à une de leurs extrémités, sur une courte baguette de verre de' façon à laisser un espace libre entre leur face et le fond de la boîte ;

3° Porter vingt-quatre heures à une température de 20 à 3o® ;

h^ Laver à l'eau. Sécher. Examen à l'immersion homogène.

Ce qu'il faut voir :

Le tréponème est très fin, pâle. Ses spires sont régulières et très étroites et leur nombre, poux chaque élément, dépasse le plus souvent le chiffre de 6 à 8.

Le spirochœte refringens, fréquent au niveau des ulcérations muqueuses, est plus épais ; ses spires, moins nombreuses et plus lâches ; sa coloration, plus vive.

Le spirille de Vincent ^ plus large, plus coloré, plus abondant, associé au bacille fusiforme. . .

Ce qu'il faut dire : '

La présence du tréponème est une preuve indéniable d'infection syphilitique.

Reoheroho du tréponèmo de Sohaudinn

dans les ulcérations,

par la procédé Foniana-Tribcndaau ^

Il y a un intérêt majeur à dépister tôt la syphilis pour la mieux traiter, aussi doit-on rechercher le tréponème dans toute ulcération suspecte (organes génitaux, muqueuses, peau), voire même dans des ulcérations apparemment guéries (par exemple dans le nodule sous-épidermique, reliquat d'un chancre épîdermisé). Le procédé de Fontana et Tribondeau convient très bien à cette recherche.

1* Ce qu'U faut :

I**. Un bistouri (ou lancette) ; dee lames de verre porte-objets nettoyées à l'alcool ; une flamme petite (veilleuse de bec Bunsen, ou lampe à alcool, ou lampe à pétrole) ;

2* De Teau distillée ;

3® De la solution de Ruge :

Acide acétique pur 1 centimètre cube.

Formol à 40 p. 100 (formol du

commerce) 2 — —

. Eau distîUée ....... 100 — —

4** De l'alcool fort (absolu ; à défaut, alcool à 96" ou go* ou 80**) ; 5® De la solution tannique :

Acide tannique (tanin). ... 1 gramme.

Eau distillée, chaude. ... 20 centimètres cubes.

(A préserver des moisissures avec un peu de camphre, en flacon bien bouché.)

I..N0US avons à plusieurs reprises employé avec succès cette méthode et les renseignements qui suivent, dus au D' Tribondeau, médecin principal de la marine. La méthode Tribondeau est universellement employée et mérite de l'être.

6^ De la solution de nitrate d'argent ammoniacal (solution de Fontana) : .

Nitrate d'argent cristallisé, mis

en poudre

Eau distillée, froide

1 gAmme.

20 centimètres cubes.

Réserver quelques centimètres cubes de cette première solution. Introduire le reste dans un verre à pied ; lui ajouter

Fig. J^, — Frottis de « rosée sanglante » de chancre induré. Imprégnation au Fontana-Tribondeau. ,

Bn paie, on voit quelques globules rouges. Quatre tréponèmes sont visibles.

peu à peu de Tammoniaque avec un compte-gouttes (ou une pipette), tandis qu'on remue constamment le mélange à l'aide d'un agitateur ; le liquide, d'abord clair, se trouble, se colore en sépia» fonce de plus en plus, et enfin se décolore progressivement, sous l'influence de l'addition continue d'ammoniaque; on arrête cette dernière quand toute teinte marron a disparu. Verser alors, dans la solution obtenue, de la solution première mise en réserve jusqu'à obtention d'un louche persistant après agitation à la baguette (on évite ainsi un excès d'alcalinité nui-

sible à la coloration ultérieure). «A notre avis, il est préférable de préparer cette solution avant chaque emploi en petite quantité, il nous a semblé qu'elle se conservait mal.

V Ce qu'U faut faire :

i^ Faire des frottis avec le suc (sérosité sanglante) de l'ulcération. Poûï* cela, là bien déterger au moyen de tampons humides (dans le pus de surface il y a beaucoup de germes sans intérêt et peu de tréponèmes) ; si elle est vaste ou multiple, rechercher le» points les mieux caractérisés par leur aspect et l'induration sous-jacente. Pratiquer à l'endroit choisi, à la limite même de l'ulcère (donc, en pleine zone d'activité de la lésion), quelques scarifications rayonnantes, à cheval sur l'ulcère et sur sa bordure épidermique, parallèles entre elles, courtes (2 à 3 millimètres environ), et juste assez profondes pour que du sang apparaisse. Pincer (quand la région s'y prête) l'ulcère entre deux doigts, et recueillir par raclage avec l'instrument ayant servi aux scarifications (dans la bouche, avec une spatule ou un tampon monté) la sérosité sanglante qui suinte ; l'étaler sur lames en couche mince. Si, au début, du sang pur s'écoulait en abondance, le rejeter.

2** Sécher les frottis par agitation à l'air, sans chauffer et ne pas fixer (sans quoi, on ne pourrait plus se débarrasser de Thémoglobine).

3® Déshémoglobîniser le frottis en le couvrant, à 2 ou 3 reprises, de solution de Ruge, méknge .qui, sans entraîner les éléments figurés, dissout et élimine diverses substances avides d'argent (principalement l'hémoglobine : tant celle restée dans les hématies que celle répandue dans la sérosité); lesquelles masqueraient les tréponèmes, et les empêcheraient de se colorer. Les frottis récents perdent vite leur hémoglobine ; avec lès frottis anciens il faut insister un peu plus sur le Ruge. Egoutter en secouant.

H^ Laver à l'alcool, verser goutte à goutte sur le frottis tMiu incliné (pour éliminer la solution de Ruge qui nuirait à la nitra-

tation par son acidité et en donnant avec le tanin du taùno^ forme). — Ëgoutter.

6** Verser encore quelques gouttes d'alcool sur le frottîè et les enflammer (pour compléter la fixation).

6® Couvrir le frdttis de solution tannique. Chauffer doucement sur la flamme en évitant de faire bouillir ; retirer de la flamme des émissions nettes de vapeur ; laisser agir le liquide chaud pendant 3o secondes. — Ëgoutter.

7® Laver à l'eau pendant 3o secondes (eau distillée de préférence, mais l'eau du robinet peut servir sans inconvénient). — Ëgoutter.

8® Couvrir le frottis de solution de Fontana. Chauffer comme à 6^. Laisser agir le liquide chaud i5 secondes. — Ëgoutter.

Ô** Laver à Teau distillée,, Ce lavage peut être rapide (quelques secondes) ; itiais il importe; à moins d'avoir une eau de robinet très pure, de le faire à l'eau distillée sous peine de décolorer le frottis qui, du marron à reflets métalliques, passe au jaune sans reflets. — Ëgoutter.

lo® Sécher au buvard, puis en agitant au-dessus de là flamme. Déposer une goutte d'huile de cèdre directement sur la lame, et examiner à immersion 1/12 ou i/i5, de préférence à la lumière du jour. Enlever le plus tôt possible Thuile avec du xylol, car elle décolore la préparation. Si, pour des démonstrations, on voulait laisser cellerci longtemps sous le microscope, il y aurait avantage à monter à la glycérine neutre sous lamelle ; mais éviter le baume du Canada qui est uil décolorant puissant.

Les préparations peuvent être recolorées en recommençant les temps 6 à 10. Dans le cas oti, à côté des parties jaunies d'autres sont restées colorées, on peut, pour éviter des surcolorations de ces dernières, commencer par tout décolorer dans du Lugol dilué ; ensuite on lave soigneusement, et on recolore.

3* Ce qu'il faut voir :

Les tréponèmes apparaissent avec une netteté remarquable, même dans les points encombrés d'hématies et de débris ; ils

sont colorés en marj*on, tirant parfois sur le noir. On les distingue des autres spirochètes parce que, longs, ténus et très spirales, ils donnent une impression très spéciale d'élégante gracilité.

4' Ce qu'U faut dire :

La constatation dû tréponème fait conclure à la syi^ilis. Mais une recherché négative n© veut pas dire absence de syphilis. Il faut se rappeler, notamment, qu'après des applications locaks de càlomel, ou des injections de salvarsan, on trouve très peu ou pas du tout de tréponèmes dans les chancres syphilitiques. (Aussi une telle thérapeutique ne devrait-elle être instituée que si le diagnostic clinique est certain, surtout en ce qui concerne l'emploi du calomel qui, même; hâtif, ne peut enrayer l'infection i^yphilitique).

Nota. — La réaction se recommande par sa rapidité (moins de 5 minutes), sa simplicité d'exécution, et ses résultats évidents pour Toeil le moins exercé.

En dehors du diagnostic des ulcérations, elle est applicable aux frottis d'organes (elle a permis à Levaditi de déceler les tréponèmes dans 1© cerveau des paralytiques généraux ; Tribondeau la recommande pour s'assurer de leur présence dans les foies de fœtus utilisés dans la réaction de Wassermann), et à la coloration des spirochètes saprophytes et pathogènes contenus dans la salive, dans les mucosités des selles, etc.. (Tribondeau).

Coloration négative des tréponèmes è l'encre de Chine

Tous les praticiens n'ont pas d'ultramicroscope et cependant beaucoup possèdent un microscope et rien n'est plus facile pour eux de se procurer de l'encre de Chine. Avec un microscope et de l'encre de Chine on peut remplacer un ultramic^roscope.

Cette méthode de coloration négative consiste à silhouetter

les microorganismes, Tencre de Chine les respecte et ils se projettent en blanc sur le fond noir formé par l'encre de Chine. Cette méthode est applicable à toute la bactériologie, elle est surtout utile pour la recherche du treponema pallidum.

1* Ce qu'U faut :

i" Un microscope avec objectif à immersion et un fort éclairage Abbe ;

2® Unie solution concentrée d'encre de Chine, cette encre doit être fine et homogène ;

3® Des lames ; •

b!* De la sérosité à examiner recueillie exiemporanément provenant d'un chancre ou d'un condylome bien nettoyé.

2* Ce qu'il faut faire :

I** Déposer dans une goutte d'eau distillée, une petite goutte de la sérosité à examiner ;

2** Ajouter à la pipette une gouttelette d'encre de Chine, juste ce qui monte dans la pipette par capillarité. La gouttelette sera mêlée à la goutte de sérosité à examiner ;.

3* Ëtaler soit avec une lame, soit ayec une feuille de papier à cigarette ; ^

4^ Sécher la lame sans la recouvrir d'une lamelle ;

5® Examiner avec un bon éclairage à l'objectif à immersion l/l2.

3' Ce qu'il faut voir :

Un fond noir ou gris uniforme. Sur ce fond noir apparaissent les profils et silhouettes de nombreux microbes, de cellules et de tréponèmes très faciles à "reconnaître, dont on peut compter tous les tours pressés de spires, dont les extrémités s'effilent sur le fond noir.

La réaction est faite en 5 minutes.

Elle est éminemment pratique, et ne demande qu'un peu d'habitude pour la préparation et la mise au point.

Procédé pratique pour faire une réaotion de Waeeermann

La technique que nous recommandons, pour la pra ligue courante, est la technique de Levaditi. Dans celle-ci, on utilise comme antigène l'extrait alcoolique de foie syphilitique, et comme globules rouges à hémolyser, les globules rouges de mouton contre lesquels le sérum humain normal possède une hémolysine naturelle.

Ce qu'il faut :

I* Du sérum frais provenant d'un malade à explorer ;

2** De l'antigène (extrait alcoolique de foie syphilitique) et extrait de cœur de veau. Pour plus de sécurité, il est prudent de faire là réaction en présence de plusieurs antigènes ;

3® Des globules rouges de mouton' ;

4** Des tubes et des pipettes à hémolyse Levaditi.

I** Du sérum frais.

Il faut avoir au moins a ou 3 centimètres cubes de sérum, donc 8 à lo centimètres cubes de sang.

Le procédé de fortune est l'application de 3 ventouses scarifiées. Le contenu de ces 3 ventouses est versé dans une seule ventouse ou dans une bouteille. On attend la coagulation ; la ventouse ou là bouteille qui cohtierit le sang est fermée avec un bouchon hermétique de liège ou de caoutchouc que l'on aura fait bouillir au préalable.

Il est préférable de ponctionner une veine avec une aiguille courte, à biseau court et du calibre d'une aiguille à ponction lombaire. Le sang est recueilli dans un tube h essai, propre, bouilli, et séché à la flamme. On ferme au bouchon. Ne jamais boucher les tubes avec du colon, si on doit transporter le sang, car le coton aspire le sérum exsudé. Il sera utile d'attendre l'exsudation du sérum, en déposant le sang le plus tôt possible au frais, au repos et à l'abri de la lumière après avoir détaché le caillot des parois du tube à l'aide d'un tour de fil de platine.

Quand le sang arrive au laboratoire, le premier soin est de détacher le caillot de la paroi du verre à l'aide d'un fil métallique de façon à lui permettre de se rétracter.

Le sérum doit être utilisé dans les a 4 heures après la prise. Après ce temps, il est nécessaire de le séparer à la pipette des caillots et des hématies, si on veut qu'il conserve encore du complément.

Avant la réaction; transvaser dans des tubes coniques et centrifuger si nécessaire pour -séparer le sérum des globules rouges.

a** De Vantigène,

On se procure, dans un grand laboratoire, une certaine quantité de poudre de foie syphilitique ; mais on peut aussi le préparer suivant la technique suivante :

Recueillir aseptiquement, immédiatement après la mort d'un fœtus hérédo-syphilitique non macéré. L'organe est découpé aseptiquement, puis broyé au mortier. La bouillie obtenue est mise à sécher dans une cloche à vide sulfurique. Après 48 heures, cette dessiccation «st obtenue, la substance desséchée est pulvérisée. On peut faire, dès lors, l'extrait alcoolique qui se conserve indéfiniment : verser la poudre dans l'alcool absolu dans la proportion de i gramme pour 3o d'alcool, agiter, laisser a4 heures en contact. Décanter, l'alcool a une belle couleur jaune transparente, et titrer l 'antigène i. *

Pour utiliser cet extrait alcoolique, on le dilue au dixième dans de l'eau physiologique. C'est cette dilution qui est employée sous le nom d'antigène. Elle a une couleur blanc opaque laiteux.

Tribondeau emploie l'antigène de Noguchi qu'il prépare suivant la technique suivante :

Se procurer à Tabattoir un cœur de veau récemment tué. Supprimer les oreillettes, les valvules aurlculo-ventricfulaires et leurs cordages tendineux; laver la cavité des ventricules, puis l'assécher; enlever l'épicarde avec le tissu graisseux et les vaisseaux sous-jacents* La paroi musculaire des ventricules ainsi dépouillée est coupée en morceaux et débitée à la

i. On trouve dans le commerce en ampoule de l'antigène titré en solution alcoolique avec le taux de dilution nécessaire dans le sérum cblomré sodîque pour obtenir un excellent antigène.

hacbeuse de caisine très propre. Additionner le hachis d'un tiers environ de son volume de sable fin calciné et lavé (sable des laboratoires de chimie). Triturer h fond dans un mortier jusqu'à réduction en pulpe. Répartir cette pulpe, avec le sable qui y est incorporé, dans plusieurs flacons. Ajouter, en tout, un litre et demi d'alcool à %* (ou, si Von préfère, 10 centimètres cubes d'alcool par gramme de pulpe); les flacons ne devront pas être complètement pleins; les boucher très hermétiquement. Mettre à l'étuve, h 37% et laisser macérer pendant quinze jours, en ayant soin de secouer tous les jours, deux fois en moyenne.

Vider le contenu liquide et solide des flacons suç un linge propre, tenu lui-même au-dessus d'un filtre en papier. Laisser s'écouler I'hIcooI, puis exprimer la pulpe en tordant le linge. La totalité du liquide filtré est placée à 37* (étuve), en une large cuvette photographique de verre ou de porcelaine, jusqu'à dessiccation complète.

Reprendre le résidu de la dessiccation, après refroidissement, avec de l'éther sulfuriqno. R<^partir en tubes à centrifugation, centrifuger et décanter de façon à se débarrasser des substances en suspension dans l'éther. Rassembler dans un verre à pied la solution éthérée provenant de la décantation des tubes. Faire évaporer cette solution, loin de toute flamme, jusqu'à réduction à 10 à 20 centimètres cubes environ de liquide fortement concentré. Pour cela, - tenir le verre à pleine main pour le -chauffer et, tandis qu'on lui imprime un mouvement de rotation qui fait monter l'éther en couche mince le long des parois, souffler doucement au-dessus de l'ouverture.

Ajouter alors d'un seul coup 50 centimètres cubes environ d'acétone; un abondant précipité jaunâtre se forme aussitôt et tombe rapidement au fond du verre. Décanter et rejeter l'acétone surnageante. Récolter à la spatule de Roux le précipité déposé au fond du verre à pied et sur ses parois; le placer dans un verre de montre préalablement pesé, et l'exprimer avec la spatule de manière à chasser le peu d'acétone qui l'imprègne encore. Les lipoïdes Obtenus ont un aspect cérumineux. Les peser.

Dans un flacon bouctiant à l'émeri, bien propre, bien sec/ et au fond duquel on a placé des billes de verre, on verse autant de centimètres cubes d'éther sulfurique qu'il y a de fois gr. 30 dans le poids des lipoIdes. Déposer les lipoïdes contre la paroi interne de ce flacon avec la spatule de Roux. Boucher et secouer pour dissoudre les lipoïdes dans l'éther avec l'aide dés billes de verre qui les triturent. Mesurer, dans une éprouvette graduée, autant de fois 9 c. c. d'alcool méthylique absolu <^u'on a employé de centimètres cubes d'éther. Verser cet alcool d'un coup dans le flacon ; reboucher immédiatement, et agiter fortement pendant quelques instants. Placer le flacon bien bouché à la glacière ou au frais jusqu'à ce que la solution alcool o-éthérée de lipoïdes se soit clarifiée.

La solution jaune d'or obtenue sera enfermée en ampoules, scellées comme suit, pour éviter l'évaporation de l'éther. Etrangler au chalumeau des tubes à essai près de leur extrémité ouverte. Les laissor refroidir, puis les mettre debout dans un récipient contenant de la glace cassée. Verser la solution dans les tubes. Les sceller ensuite au niveau de leur étranglement sans les sortir complètement de la glace de façon que la

chaleur ne se propage pas & l'éther et ne provoque pas un dégagement de vapeurs sous pression qui perceraient le verre fondu et empocheraient la fermeture^

Gardés h la glacière ou au frais, les extraits Noguchi se conservent, en ampoules, pendant des années.

Quand on met une ampoule en service, on en vide le contenu dans un petit flacon bôurhé hermétiquement à l'émerî, qu'on conserve à la glacière ou an frais dans Tintervalle des réactions.

Au moment de pratiquer les réactions, on fait avec ces lîpoîdes une émulsîon à 1 p. 60 (dans 6 c. c. d'eau salée à 9 p. 1.000, verser c. cl 1 d'extrait alcoolo-éthéré. et mélangé aussitôt). La dose optima de cette émulsion est, ordinairement, c. c. 8 pour c. c. 1 de sériim humain (méthode de Hecht). On la titre d'ailleurs tout comme une émulsion de lipoîdes à l'alcool.

3® Des globules rouges de mouton.

Si on a un mouton, recueillir le sang par quantité de ao à 5o grammes par ponction de la jugulaire externe. Ou bien il faut aller à Tabattoîr avee des ballons à perles stériles et bouchés. Ces ballons doivent être épai9 de façon à ne pas se casser durant l'agitation de la défibrination. On recueille, dans ce ballon, le sang qui jaillit après section de la carotide, en évitant de souiller l'orifice du ballon. On bouche avec le tampon de coton stérile et on agite pendant lo minutes pour le défibriner. Rentré au laboratoire, on centrifuge le sang à la centrifugeuse et on décanta par aspiration à Ja pipette à boule le liquide qui surnage, on le remplace par une égale quantité d'eau chlorurée sodique à 0,9 p. 100 et stérilisée, on agite et on centrifuge à nouveau. On fait ainsi 3 lavçiges. Les globules rouges du dernier mélange recevront en plus, pour faciliter leur conservation, i centimètre cub^ de formol en solution à 10 p. 100 par 5 centimètres cubes.

On répartît* les globules rouges en ampoules de i centimètre cube que Von conserve au frais et dans l'obscurité, ou mieux à la glacière. Pour faire la dilution classique à 5 p. 100, on prendra une ampoule de i centimètre cube de globules rouges pour 19 centimètres cubes d*eau physiologique.

d^ Des tubes et des pipettes.

Les tubes pour la réaction sont des. tubes de 6 à 8 centimètres de haut sur i centimètre de large. Ils doivent être très propres

et, de préférence, stérilisés avant l'emploi . On les place dans un porte-tubes qui leur est ajusté. Les pipettes sont de longues pipettes divisées en dixième de centimètre cube. Ces pipettes seront réservées chacune pour Je même élément : une pipette pour Tantigène, une pipette pour le sérum, une pipette pour le liquide chloruré sodique à 0,9 p. 100 et une pipette pour les globules rouges.

Ce qu'il- faut faire :

Avant tout, titrer une fols pour toutes avant son emploi l'antigène. Le tableau suivant résume l'opération :