SELS

QUANTITÉ POUR lOO

o,oi "/„

Bichlorure de mercure. .

Nitrate d'argent

Cyanure de potassium .

Le bichlorure de mercure a donc une influence retardatrice très faible; en présence de 0,1 pour 100 la diastase est très peu affaiblie. Le cyanure de potassium est un paralysant très énergicpe; en présence de 0,02 pour 100 le pouvoir ferment devient 16 fois moindre. Le nitrate d'argent retarde d'abord, puis accélère la transformation, grâce, d'après M. Duclaux, à l'acidité qu'il produit dans la solution sucrée.

Enfin l'alcool à 10 pour 100 produit un retard exprimé par le chiffre : i,3. L'essence d'ail et d'autres essences ne produisent sur la marche de l'inversion que des effets presque inappréciables.

Formation de sucrase dans les cellules vivantes. — ÎNous avons vu plus haut que toutes les cellules qui se nourrissent de sucre de canne sécrètent de la sucrase. Nous allons maintenant déterminer quelles sont les conditions les plus favorables à la sécrétion de l'invertine par les cellules vi>antes.

8G LES ENZYMES

Dans les cellules de levure de bière, cultivées dans un moi^il nutritif contenant du saccharose, on voit apparaître de la sucrase. Pour expliquer ce phénomène on peut admettre que les cellules se trouvant en présence de substances non assimilables, produisent une sécrétion capable de transformer ces substances en matières assimilables. Mais en étudiant le phénomène de plus près, on constate que la sécrétion de sucrase n'est pas précisément provoquée par le mode de nutrition de la cellule ; qu'elle semble être plutôt intimement liée à la nature de l'organisme et qu'elle se produit indépendamment des besoins réels de la cellule.

Si, par exemple, on remplace dans le moût nutritif le sucre de canne par un hydrate de carbone directement assimilable, on voit, malgré ce changement, la sécrétion de sucrase se continuer. Dans ce cas, cependant, la nutrition delà levure ne nécessite nullement la présence de cet enzyme.

Si la nature du sucre ne possède aucune influence sur la sécrétion de la sucrase, on n'en doit pas conclure que, d'une façon générale, la sécrétion de Ja diastase est indépendante du mode de nutrition de la cellule. L'expérience a montré, au contraire, que la sécrétion diastasique est directement liée au mode d'alimentation, tout en étant indéjDcndante de l'hydrate de carbone employé. Les levures cultivées dans un moût de bière sécrètent des quantités bien plus considérables d'invertinc que les levures cultivées en solution simplement sucrée ; la sécrétion de la sucrase est favorisée, dans ce cas, par les matières azotées du malt. L'expérience a démontré par exemple que l'addition de peptones augmente la quantité de sucrase dans le milieu de culture.

Les substances les plus favorables à la culture de la levure ne sont pas toujours celles qui favorisent le plus la formation de la sucrase.

C'est ainsi que les phosphates, par exemple, qui influent très favorablement sur la levure, sont au contraire nuisibles à la formation de la sucrase.

SUCBASE 87

Les matières azotées ne sont donc pas les seules ayant une influence sur la sécrétion de la sucrase. Malheureusement, on connaît foi'l peu les conditions qui favorisent la forniaiit 11 de la diastase, conditions dignes cependant d'une élude approfondie, car elles sont de nature à nous fouinir des renseignements très intéressants au point de vue tliéorique.

Si les données nous manquent sur les conditions favorables à la formation de l'invertine, nous sommes beaucoup mieux i-enseignés sur le mode de diffusion de la sucrase au travers des cellules.

Pour étudier le mode de formation de la sucrase dans l'aspergillus niger, Fcrnbach a procédé de la manière suivante : il a ensemencé un certain nombre de cuvettes renfermant des volumes égaux de liquide Raulin, avec un nombre déterminé de spores provenant toutes de la même culture d'aspergillus. Il soumit ensuite le liquide ensemencé à une température constante de 35°.

Il détermina chaque jour dans un des essais le poids des plantes produites, le sucre restant, l'acidité, ainsi que la dose de sucrase fournie.

Chaque cuvette renfermait /i 00 centimètres cubes de licpiidc Ilaulin, ly^^ô de saccharose, eto"'',72 d'acide tartrique libre.

Les résultats qu'il a obtenus sont consignés dans le tableau suivant :

xfi

■Tj ryi

CI g

Cj

Apres 2 jours

3, io5

0,11 Cl

I 2 . cS

iT-C»

o,oû8

traces

En suivant sur ce tableau les chiffres placés sous la rubrique sucrase, on voit qu'au début du développement de la jeune plante, alors qu'elle dispose de grandes quantités de sucre, la sucrase n'apparaît pas dans le liquide de culture et que l'on ne peut constater son apparition qu'au moment oii, le milieu étant privé de sucre, l'inversion ne se produit plus.

Ce fait présente un grand intérêt; il nous montre cjuc l'inversion ne se produit pas dans le liquide cjui entoure la moisissure. La présence dans le liquide de 8,3 grammes de sucre interverti au bout de deux jours, tend à confumer que la transformation se fait à l'intérieur de la cellule.

Si nous acceptons cette hypothèse, nous devons en même temps admettre que la sucrase existe dans la cellule depuis le •début et que la diffusion constatée se produit par suite d'une modification du contenu cellulaire.

En réalité, Fernbach en recherchant la sucrase dans la plante a constaté que la quantité maxima de diastase sécrétée parles cellules apparaît dès le début de son développement et ■que le moment de son apparition à l'extérieur coïncide avec l'instant où la plante a déjà fait disparaître la plus grande ■quantité de sucrase.

ff! a

te H

Après I jour

-< 'fi

kM

La diffusion de la sucrase au moment de la disparition du sucre peut donc être considérée comme une conséquence de

SUCBASE 89

ia dénulrUion de la plante. Pour peu qu'on y réll(X'liisse, on conçoit en effet que, dans des cellules bien nourries et munies de réserves alimentaires, la dilTusion doit se faire très difficilement.

Au moment de la disparition du sucre interverti dans le liquide, les cellules commencent à consommer leurs réserves ; il se produit donc des vides celkdaires qui se remplissent d'eau, laquelle facilite certainement la dilTusion.

Du reste, voici des expériences très concluantes qui prouvent que la diffusion des diastases caractérise un état pathologique des cellules :

On plonge deux cultures jeunes et identiques d'aspergillus niger, l'une dans l'eau, l'autre dans un milieu nutritif assez riche. Après /jS heures on analyse les deux liquides et on trouve que le premier milieu contient une grande quantité de matières actives, tandis que le second n'en contient nulle trace. La dénutrition favorise donc la sécrétion de la sucrase.

On peut, d'autre part, prendre une culture d'aspergillus aiger et la mettre à l'abri de l'action de l'air. On empêche ainsi la fructification et cette circonstance anormale amène, tout comme la non-nutrition, une abondante dilTusion de diaslase dans le milieu de culture.

On peut enfin chauffer, pendant quelques secondes à 100°, de la levure de bière en suspension dans l'eau. On détruit ainsi complètement la substance active ainsi qu'une grande partie des cellules de levure. En laissant refroidir le liquide on constate cependant, au bout d'un certain temps, l'apparition de sucrase. La sécrétion de l'enzyme peut être attribuée à des cellules qui ont échappé à l'action destructive de la chaleur tout en étant fortement endommagées par la haute température à laquelle elles ont été portées. Elles se trouvent alors dans un certain état pathologique, et diffusent avec facilité la substance active qu'elles contiennent.

Comme nous le voyons par ces expériences, le manque de

svicre ou d'oxygène, l'élévalion de la température, etc. , peuvent également favoriser la diffusion de la sucrase sécrétée par les cellules.

Dosage de la sucrase. — On peut facilement constater la transformation du saccharose en sucre interverti à l'aide de la liqueur de Fehling. Le sucre de canne ne réduit pas cette solution, tandis que o^'",/i94i de sucre interverti réduisent loo centimètres cubes de liqueur de Fehling,

La transformation du saccharose en sucre interverti peut se constater également par le changement de rotation qui accompagne la transformation. Le sucre de canne est dextrogyre et le mélange, produit par l'hydrolyse, est au contraire lévogyre. Le saccharose donne une rotation à droite de a j -j- 73. 8., et le sucre interverti une rotation à gauche de — 44- Le dosage de la sucrase a, comme point de départ, la détermination de la quantité de sucre interverti. Or, une même quantité de sucrase peut fournir des quantités plus ou moins grandes de sucre interverti. Ces variations sont dues, aux différents facteurs que nous avons indiqués: l'acidité du milieu, la température, la durée de l'action, etc. Il ne faut pas oublier non plus que la proportionnalité entre les quantités, de ferment employé et de sucre interverti obtenu, n'existe qu'au début de l'action, et avant qu'il se soit transformé 20 pour 100 du sucre total soumis à l'action.

Il résulte de tout ceci qu'il est absolument indispensable,, pour pouvoir comparer deux produits diastasiques, de se placer dans des conditions identiques. Pour éviter des erreurs, provenant de l'acidité, on a soin de neutraliser le liquide aussi exactement que possible, puis de l'aciduler avec i pour 100 d'acide acétique.

Le choix de l'acide acétique n'est pas arbritraire, il est dû aux raisons suivantes : l'acide acétique peut être employé en quantités assez grandes, et par conséquent facilement déterminables. Il a la propriété de ne point déplacer les

suc RASE f),

aulrcs acides organiques de la soin lion, el, enfin, d'influer peu sur la sucrase.

Il faut encore, dans le dosage, ne pas négliger lout ce qui est nécessaire pour éviter l'oxydation de la sucrase el, dans ce but, faire l'antilyse le plus rapidement possible. On laisse généralement la sucrase agir seulement pendant une lieiu-e.

Pour éviter les erreurs qui pourraient naître de la cessation de la proportionnalité entre la quantité d'enzyme employée et la quantité de sucre interverti, on rechcrcbe la quantité de sucrase susceptible de transformer une quantité déterminée de sucre de canne, et non la dose de sucre que peut intervertir une quantité donnée de sucrase.

Dans le mode de dosage créé par Fernbach, on prend comme unité la quantité de sucrase susceptible d'intervertir 20 centigrammes de saccbarose en une heure, à la température de 56" en présence de i pour 100 d'acide acétique.

Pour opérer ce dosage, on neutralise préalablement la solution de sucrase, puis, dans une série de tubes à réaction contenant chacun 4 centimètres cubes d'une solution de saccharose à 5o pour 100, on ajoute i, 2, 3, /i, 5 centimètres cubes de la solution de sucrase qu'on veut analyser ; on additionne le mélange de i centimètre cube d'acide acétique au ]/io; on amène le volume dans tous les tubes à 10 centimètres cubes; on laisse i heure à la température de 56°; on refroidit rapidement; on ajoute quelques gouttes d'une solution de soude pour arrêter l'inversion, et on cherche dans chacun de ces échantillons la quantité de sucre interverti formé à l'aide de la liqueur de Fehhng. On peut ainsi voir dans quel tube les 20 centimètres cubes de sucre ont été intervertis.

Admettons que ce soit dans l'essai contenant 5 centimètres cubes de sucrase : on se trouve alors en présence d'une solution ne contenant que des traces de sucrase. La dose d'acide acétique qu'on a employée dans l'essai donnant déjà par ellemême quelques centigrammes de sucre interverti, il se peut

que ce soient des substances étrangères et non la diastase •qui aient produit le reste de l'inversion.

Pour avoir la certitude que la transformation du saccharose ■est due à l'effet d'une diastase, il faut faire l'essai une fois à froid, puis une fois avec une solution chauffée à loo" el voir si les résultats sont identiques.

Dans le cas où il suffit de i , de 2 ou même de 3 centimètres cubes de solution pour obtenir la transformation des 20 centigrammes de sucre, on se trouve en présence d'un liquide -assez énergique et, en répétant l'expérience avec i 1/2, i S/Zj. 2, 2 1/4, etc.. centimètres cubes delà solution à essayer, on peut arriver à un dosage très précis de l'activité diastasique.

Dans le cas où il faudrait, par exemple, i 1/2 centimètre cube de solution pour obtenir 20 centigrammes de .sucre interverti, on dira que la dose unité de sucrase se trouve dans i 1/2 centimètre cube et, en conséquence, que la solution possède les 2/3 du pouvoir diastasique pris pour unité.

La méthode de Fernbach donne des résultats assez précis, mais elle demande beaucoup de tâtonnements et une longue série de dosages qui prennent beaucoup de temps.

Quand il s'agit d'une appréciation plutôt qualitative que quantitative, on peut supprimer complètement le dosage du sucre.

Pour rechercher la sucrase dans les liquides nous employons une méthode très expéditive demandant seulement 1/2 heure et dans laquelle l'inversion est constatée par la coloration que prend le liquide interverti sous l'action de la soude.

Nous nous servons pour ces sortes d'essais d'une solution de sucre à 10 pour 100. Le liquide dans lequel on dose la sucrase est neutralisé le plus exactement possible avec de la soude à i/iooo. Dans deux tubes à réaction, A et B, on verse TO centimètres cubes de solution sucrée; on ajoute en A I centimètre cube de la solution diastasique et en B, i centi-

suc II A SE 9.S,

inèlre cube de la iiièine Sdliilion pivalahiciiiciii cliaiillée pendant quelques minutes à luo". (Jii laisse les deux tubes 1/2 heure à bo'^. On ajoiile i centimètre cube de soude normale dans chacun des tubes et on chauffe 5 minutes à q8". Si l'on se trouve en ]jrésencc d'une solution de sucrase, le tube A prend une coloration beaucouj) plus foncée que le tube B.

Il est possible, d'ailleurs, de transformer ce procédé en une méthode colorimétriqne .