DÉGAGÉ
lénol).
Après 4 h.
lénol).
Hydroquinone (paradiphénol) Pyrocatéchine (orthodiphénol) Résorcine (métadipliénol)
On voit que la quantité d'oxygène absorbé est presque nulle pour le métadipliénol, tandis que le paradipbénol s'oxyde très faiblement.
Ces faits se sont' reproduits dans toutes les expériences de Bertrand ; la phloroglucine, où toutes les oxydriles sont en meta, se refuse, pour ainsi dire, à toute oxydation, tandis que son isomère, le pyrogallol, absorbe l'oxygène avec rapidité.
Les différents polyphénols examinés par Bertrand ont montré que leur oxydabilité est en raison directe de la facilité avec laquelle ils se transforment en quinones.
La totalité, ou une partie des oxydriles des polypliénols, peuvent être remplacés par des radicaux amidogènes (NH^), sans que la marclie de l'oxydation soit modifiée.
Le paramidophénol :
^NH2(4)
est facilement oxydable ; le métamidophénol, au contraire,
■NH^(3)
ne fixe que des quantités minimes d'oxygène.
D'après L de Rey Pailhade, la laccase existerait dans les grains en germination. L'enzyme agirait sur une matière oxydable : le philothion, également contenu dans ces grains. La laccase jouerait, par conséquent, un rôle dans la respiration des cellules végétales. Toutefois, il n'a nullement démontré que l'enzyme oxydant trouvé dans les grains est la laccase.
TYROSIXASE ,V,7
Il y a (oui lien d'admcllro fiu'on so Iroino en |)r('sencc (riinc autre oxydasc.
Nous pou\ons à pivscnl dc'iorminor d'une nianièrc j)liis générale le mode d'action de la laccase.
La laccase est un l'ermcnt sokible ])rocluisant l'oxydation des corps de la série benzinif(uc, qui ])ossèdent an moins deux groupements, 011 ou NIP, lorsque ces groupcmenis occupent la position para ou ortho.
Ici s'arrêtent les observations spécialement applicables à la laccase. Les travaux ultérieurs de Bourquelot et de Bertrand se rapportent à une autre diastasc, ou ])lulôt à vm mélange de laccase et d'un autre enzyme, la tyrosinase, dont ces savants ont reconnu la présence dans un grand nombre de véeétaux.
Tyrosinase.
Les sucs extraits des betteraves et de quelques autres végétaux prennent, lorsqu'on les met au contact de l'air, une coloration rouge, puis noire. Ce phénomène est dû à l'oxydation de la tyrosine qui se trouve dans ces végétaux, oxydation qui se produit par l'intervention d'une diastase.
La formule rationnelle de la tyrosine ou acide oxyphénylamidopropionique est :
CO^H NH2
HC
HC
CH
on
K\8 LES ENZYMES
On Yoil, cra])rès celte formule, que la Ivrosine n'apparlienl pas coniplèlemeiil à la classe des corps que nous avons reconnus comme étant certainement oxydables par la laccasc, c'est-à-dire à la classe des polyphénols dont les liydroxyles sont dans la position para ou ortlio.
La tyrosine en efï'et, soumise à l'action de la laccase, n'absorbe pas d'oxygène.
D'antre part, Bertrand a constaté par diverses expériences c[ue l'oxydation de la tyrosine ne se pi'odnisait plus lorsque le suc extrait des ]3lantes avait été chaufle à ioo°. Ce fait indiquait l'intervention d'une diastase.
L'oxydation de la tyrosine pouvait s'expliquer par l'action de la laccase sur un produit de dédoublement de la tyrosine, produit préalablement élaboré par un autre enzyme non oxydant contenu dans le liquide.
Pour contrôler cette hypothèse, Bertrand mit dans un ballon une certaine dose de suc extrait de la Russula et quelques grammes de tyrosine. Après 2l\ heures, le tout fut chauffé à ioo°; l'addition de laccase au liquide et l'exposition à l'air, ne déterminèrent alors aucune oxydation.
Il était clone démontré, par cette expérience, que la laccas'e est absolument sans action sm^ la tyrosine, et qu'il ne se produit pas dans le liquide d'action diastasique préalable permettant l'oxydation par la laccase.
En réalité, la fixation de l'oxygène se produit par l'intermédiaire de la tyrosinase, enzyme analogue à la laccase, mais agissant sur d'autres corps.
La tyrosinase a été isolée, par Bertrand, de plusieurs végétaux. Extraite des pommes de terre, des dahlias, etc., elle ne possède qu'un très faible pouvoir oxydant ; extraite, au contraire, des champignons, elle oxyde très rapidement la tyrosine.
Bourquelot prépare la tyrosinase avec le Russula nigricans qu'il broie dans de l'eau chloroformée. Le liquide, après filtration, constitue la solution diastasique.
TYliOSLWASE 3 ',9
Pour conslalcr l'aclion tlo la lyrosinasc, on iiirl dans des Liibcs à rcaclion 5 ccntiiiiclros cultes do soin lion tliaslasique. puis 5 ccnlimèlrcs cubes d'une solution de lyi'osine et, en agitant ensuite de temps en lenips pour introduire de l'air, IjC liquide devient d'abord rouge, puis noir.
Grâce à cette réaction et à celle du gaïac, Bourquelot a démontré l'existence de la tyrosinase dans les cliam|)ignons suivants :
Boletus, Russula, Lactarius, Parillus, Psalliola, Ilcijcloma, . Vman it a , Sclcrodcr ma .
Certains cbampignons ne donnent de réaction, ni avec le gaïac, ni avec la tyrosine et l'on en peut déduire qu'ils ne renferment aucune diastase oxydante.
La tyrosinase ne se trouve pas aussi répandue dans la nature que la laccase; mais elle se rencontre très souvent, simultanément avec celle-ci, dans le même suc végétal. Certaines solutions diastasiques extraites des plantes transforment, en effet, aussi bien la tyrosine que les polyphénols.
Dans une série d'expériences exécutées à 5o", 60° et 70", lîertrand a remarqué que la faculté que possèdent les sucs végétaux de transformer la tyrosine disparaît à des tempéralures relativement basses, tandis que les propriétés analogues à celles de la laccase persistent encore dans le liquide à des températures plus élevées. Cette différence d'altérabilité des deux diastases a permis de les séparer l'une de l'autre de la manière suivante :
i5oo grammes de Russula delica fraîche sont réduits en pulpe et mis à macérer à froid avec leur poids d'eau chloroformée. En exprimant le suc de la pâte ainsi obtenue, oji obtient 2 litres environ d'un liquide mucilagineux que l'on additionne de 3 litres d'alcool à gS" ; il se forme un précipité f[u'on sépare par filtration. Le liquide alcoolique, dont on a séparé le précipité, est réduit, par distillation dans le vide à 5o", à un demi-litre environ. Le produit ainsi obtenu oxyde 1res rapidement l'hydroquinone et le pyrogallol en laissant la
35o LES ENZYMES
lyrosine absolument intacte. La précipitation par l'alcool et l'élévation à 5o° ont détruit jusqu'aux traces de tyrosinase.
Cette dernière diastase se retrouve dans le précipité qu'on a séparé du liquide alcoolic[ue. On purifie ce précipité par un délayage clans l'eau chloroformée ; on le précipite de nouveau par 2 volumes d'alcool et on le sépare du liquide. Le produit, après un second traitement identique, est desséché a 35°. Il réagit à peine sur les polyphénols et produit une oxydation très rapide de la tyrosine.
L'individualité des deux enzymes est donc bien prouvée.
Influence du milieu sur l'oxydation. — Bourquelot, dans un travail très complet, a mis en évidence la relation qui existe entre la composition du milieu et l'activité diastasique du ferment oxydant des champignons, ferment composé, ainsi c{ue nous l'avons vu, d'au moins deux enzymes oxydants : la laccase et la tyrosinase.
Une solution d'aniline, en présence d'une infusion de champignons riches en oxydase s'oxyde très lentement, car on n'observe qu'un léger changement de couleur.
Bourquelot fut donc amené à se demander si l'alcalinité cpie l'aniline communique au milieu n'exerce pas une influence défavorable sur l'action oxydante de l'enzyme, et il étudia l'oxydation de l'aniline en présence de doses croissantes d'acide acétique.
Le champignon choisi pour ces expériences fut la russula clelica parce que le suc fdtré de sa macération donne une solution aqueuse claire, permettant par conséquent d'observer facilement les changements de coloration. La macération fut i'aite en prenant 5 parties d'eau pour une partie de champignons et on obtint ainsi, après filtration, un liquide à peine coloré en jaune.
Cet extrait, additionné d'acide acétique cristallisable à doses variant de i à 5o pour looo, hit mis en essai avec la teinture de gaïac.
TYnOSINASE
Bourffiiclol vit alors a[)parailrc la coloralion biciic avec la même iiilensitc et la même vilcssc, dans tous les essais qu'il [)rali(|iia. Le réactif n'est donc pas influencé par de fortes doses d'acide acétique et, dans ces conditions, on peut étudier l'influence de l'acide sur l'action de l'axydasc. Celte action est indiquée, pour différentes doses d'acide, par le tableau suivant :
Essai
