PLANCHE II

F13. 2. — Aspect d’une culture, en tube, de siccharomyces cerevisie àâgée de 6o heures (milieu: liquide de Mayer additionné de o gr. 0016 o o de

facteur accessoire, extrait d’une culture de Mucor Mucedo).

TABLEAU XI (suite) : Culture de S.cerevisiæ ANALYSES EFFECTUÉES 4 JOURS APRÈS ENSEMENCEMENT.

IE. — Recnercnes DU PLUS PETIT POIDS DE MATIÈRE ACTIVANTE À L'ÉTAT PUR NÉCESSAIRE POUR MANIFESTATION D'ACTIVITÉ

Poids de végétal par 1U0 ce.

RES DE par rapport Alcool à l'étal au 0/0 sec temoin Numéralion en mer. en mer.

1. Liquide de Mayer, témoin. 10300 HT 16 2. Liquide de MAYER +0 mg. 2

malière accélératrice pour DONC NE ee eee SP ns < de 22010 18 LES 19 . Liquide de Mayer + o mg. 41 matière accélératrice pour DD SRE LS ele rte 1°902 17 Æ 5 1) h. Liquide de Mayer + 0 mg. 83 è matière accélératrcie pour DO er ee ee AE 3°200 47 “02 89

En possession de tels chiffres, nous voici capables d'établir quelques proportions.

C’est ainsi que l'influence de cette matière se fait sentir, et ceci avec son maximum d'effet (voir planche IT) dès qu’elle se trouve additionnée à la solution minérale dans le rapport.

—— soit 0 gr. 00083 pour 50 centimètres cubes de liquide, 64.704 ou pour 53 gr. 775 de substratum.

D'autre part, cette fraction de milligramme représente la 1/438° partie en poids des sels constitutifs du milieu et la 1/102° partie du supplément de levure que l'influence de cette matière permet d'obtenir (ou la 1/137° partie au cas de prohfération en large aérobiose).

Nous dirons de ces deux derniers chiffres-ce qu'écrivait Duclaux à propos du quantum de zinc optimum nécessaire à la culture de l'Aspergillus niger en solution de Raulin : Is mesurent l'utilité spécifique de ce corps pour la récolte.

Si l’on songe à la masse de cette matière perdue pour la

levure, puisqu'elle ne peut bénéficier, somme toute, que de la dilution qui lui est immédiatement contiguë, on est encore plus surpris de la dose infime capable de déclancher une action si considérable sur les cellules initiales au début de leur multiplication.

Connaissant en poids la fraction du composé organique utile pour qu'il y ait accélération, il nous est indifférent d'établir, comme nous avions pensé le faire, et comme l'ont tenté certains auteurs n'ayant pu isoler de substance pondérable, une sorte « d'indice de corps accélérateurs » ; la balance remplaçant ici avantageusement le concours de facteurs qui auraient pu nous servir à le constituer, et dont on ne perçoit que trop aisément la valeur relative. Le tableau de la page 92 offre quelque intérêt à cet égard.

Condition nécessaire pour que les molécules organiques accélératrices révèlent leur pouvoir

Nous avons Jusqu'à présent, cherché dans le problème qui nous occupe, les points communs, les analogies, en un mot toutes les ressemblances que pouvait présenter l’action physiologique des facteurs accessoires de la croissance chez les animaux avec les accélérations de prolifération qui viennent de nous surprendre parmi les infiniment petits.

Le parallélisme des deux actions avait été si frappant que par moment il eût été tentant de conclure à un même processus qui ne semblait varier au fond que par son caractère non obligatoire dans le monde monocellulaire, contrairement à ce qui se passe d'habitude chez les animaux supérieurs, où la question revêt alors une forme strictement nécessaire. Nous allons pourtant toucher du doigt le point sensible de ce parallélisme, peut-être un peu trop objectif, et le meitre en tous les cas momentanément en défaut,

On se rappelle qu'un des caractères essentiels des corps appelés vitamines, caractère qui, à n'en pas douter, eut une grande part dans la révélation de ces composés organiques, est leur fragilité vis-à-vis de certaines températures relativement basses, ne dépassant pas 120-123 degrés, assure la majorité des auteurs. Températures qui rendaient néanmoins les avitaminoses la plupart du temps, des cas expérimentaux

provoqués par l’homme, et ainsi fort peu rencontrées dans la nature (1).

Or, par un retour bien curieux des choses, c'est précisément l'inverse qui se passe parmi les petits êtres dont nous

nous occupons ici ; leur vie à l'abri des vitamines — terme générique que nous n'aimons pas à cause précisément du caractère obligatoire qu'il implique — serait la règle géné-

rale, le bienfait de ces corps n’apparaissant, on le verra toul à d'heure, que comme une résultante des recherches de labo: ratoire, et par définition en dehors de leur mode de vie habituel.

Voici les faits

Reprenons quelques expériences citées ici : celles de linfluence de diverses cultures bactériennes adjointes au liquide de Mayer, le tout stérilisé 5 minutes à 110 degrés avant ensemencement. Mettons en regard les résultats obtenus par des milieux semblablement constitués, mais n'étant pas passés par l’autoclave et simplement chauffés par tyndallisation (3 lois 20 minutes à 70 degrés, et à 24 heures de distance, au bain-marie)

Fait paradoxal, Les cultures microbiennes non aultoclavées ne sont pas aclivantes.

Des expériences de synbiose, bacille plus levure, ou des adjonctions de cullure simplement fillrées sur bougie Chamberland n'ayant pas donné de meilleurs résultats, aucun doute possible ne sembla .être permis à cet égard : il était dorénavant nécessaire de compter dans nos recherches sur une lempérature voisine de celle du point d'ébullition de l'eau pour que la présence et l'uülité du facteur actif soient mises en évidence (2) et ceci dit, quelle que soil l'espèce microbienne l'ayant engendré.

7 1) Les accidents provoqués par le riz décortiqué étant aussi dûs au travail de l’homme, nous les considérons également, comme des faits expérimentaux. :

(2) Résultats aussi positifs quand on se sert de cultures auloclavées avant leur adjonction au milieu minéral neuf.

CHEZ LES VÉGÉTAUX INFÉRIEURS #5 TABLEAU XIT : Cultures de S. cerevisiæ

l — LES CULTURES BACTÉRIENNES TYNDALLISÉES N'ONT PAS D'ACTION, PAR CONTRE LES CULTURES PORTÉES A L'AUTOCLAVE SONT ACTIVANTES.

Poids de végélal par 100 ce.

ns par

; rapport Acide total Alcool à l'étal au Numé en SO4H2 0/0 sec témoin ration A. Liquide de Mayer, témoin ........ o 040 02600 10 8 B. Liquide de Mayer +1 e.c. 0/0 tynd. Oo O8 02800 10 JE 14 due culture=de RP? 2 0. - auto. O 208 29368 48 90 112 C. Liquide de Mayer +1 c.c. 0/0 tynd. 0.096 0°750 15 5 15 dune culture de ME :-.::2.: auto Oo 10/4 09000 0 A9 139 D. Liquide de Mayer +1 c.c. o/o tynd. o o86 00885 10 JS 16 d'une culture de Se M. ..:., auto Oo °9/ 70404 LR) + 63 1/42 E. Liquide de Mayer +7 c.c. o/o tynd. 0 09 02900 17 ur 17 diunerculturede ee. Lree auto. O0 328 30469 61 HDI 128

Pour expliquer un tel phénomène, 3 hypothèses s'offraient immédiatement à nous

1° La chaleur pouvait volatiliser quelques corps toxiques moins résistants que la matière organique active et qui neut'alisait cette dernière par action inverse avant ébullition.

2° La chaleur pouvait encore détruire in situ un ou des corps semblable à ceux utilisés en sérologie (pro-ferment bactériolysine, ete...), destructible entre 60 et 100 degrés ordinairement, et d'action non équivoque sur le processus de certaines réactions biologiques.

3° Enfin, la Chaleur pouvait agir sur la nature chimique du composé Jui-même.

Or, ni l'emploi des premiers passages d’une distillation fractionnée, ni l’utilisation des eaux de lavages ayant servi à puriher la matière organique active ne se sont montrés nocifs où modifiés par la chaleur. La troisième hypothèse prenait donc d'autant plus de force que le corps organique aclif extrait à l'état pur et cristallisé avait besoin lui-même

d'être porté vers 85-90 degrés pour acquérir la qualité accélératrice. (1)

Ceci posé, nous renverrons, afin de ne pas trop anticiper et d'éviter certaines redites, aux pages 94 et 95, où l'on trouvera l'exposé des expériences el quelques chiffres à ce sujet.

A vrai dire, cette nécessité de chauffage est le seul point litigieux que nous ayons rencontré au cours du parallélisme tracé entre Jes effets causés par cette matière et la substance B. Nous allons à nouveau trouver toute une série de faits dans le comportement de cette substance, qui vont renforcer singulièrement l'analogie déjà esquissée. Mais une des premières déductions que doit entraîner la connaissance d'un besoin de chauffage préalable, est l'impossibilité d'auto-accélération par ce moyen de la croissance des êtres producteurs de ces corps. Ceci n'équivaut-il pas, quant au résultat, à l'absence de pareille synthèse pour les générateurs? Les animaux supérieurs en sont réduits là également.

(4) Nous verrons tout à l'heure réapparaître l'esprit de la deuxième SUPPOsillon (page 114), aussi est-il permis de conserver quelques doutes à ce sujet.

Technique permettant d'obtenir la substance accélératrice

à l'état pur et cristallisable

Qu'est-ce que ces facteurs accessoires ? De quelle nature chimique sont-ils ? Si nous consultons les principaux travaux publiés à ce sujet, les noms de tryptophane, lysine, arginine, histidine, reviennent à chaque instant aux yeux du lecteur. Ces amino-acides seraient-ils done, en définitive, les corps tant cherchés ?

Pour les uns, la question ne fait aucun doute, quoique non démontrée ; pour les autres, il ne peut s'agir de telles individualités.

Seul, Casimir Funk, en 1912, donna la formule d’une substance qu'il obtint par extraction alcoolique du son de riz, laquelle, précipitée par du nitrate d'argent et fractionnée au moyen d'acide phosphotungstique, passa un moment pour être la matière recherchée ; d’après cet auteur, il faudrait écrire sa formule de la façon suivante :

NH CO rsisos

f NH laquelle semble appartenir aux bases pyrimidiques. Malheureusement, elle ne put être maintenue à la suite de travaux postérieurs.

Nous avions, pendant un certain temps, porté nos efforts sur celte question d'acides aminés, pensant suivre le bon chemin, quand nous nous sommes aperçu

1° - Que la richesse en ces corps ne variait pas plus d'une cullure à une autre, qu'entre des milieux avant hébergé le Mucor Mucedo ou le Penicilium glaucum.

2° __ Que des extractions de culture faites à l'éther ne renfermaient pas trace d'amino-acides.

3° — Que, contrairement à toute attente, l'acide phosphotungstique donnait heu à un précipité blanc d'acides aminés lorsqu'il était employé avec de jeunes cultures de P. glaucum, inactives encore. rs

Enfin, nous étant peu à peu rendu compte, par certains autres indices, que nous faisions fausse route, 1] nous à semblé plus sûr de faire table rase des quelques données acquises antérieurement, quitte à reprendre le problème du début et sur de nouveaux plans.

Après de nombreux essais et {âtonnements, dont les détails manquent d'intérêt, nous réussîmes à extraire des cultures de mucor, exécutées en liquide de Mayer, une matière cristalhsable offrant, comme on le verra plus loin, tous les caracières de l'espèce cherchée.

Voici l'ordre dans lequel nous avons opéré.

Méthode d'extraction et de purification

du composé organique actif.

On sait que les facteurs accessoires sont solubles dans l'alcool, on sait également que ce dernier ne les détruit pas, nous nous sommes donc servi en premier lieu de ce solvant

pour les recueillir, mais l'expérience nous apprît qu'il pouvait

être avantageusement remplacé par l'éther sulfurique à 65 degrés : aussi, avons-nous employé celui-ci de préférence à

ds tnintttinn

celui-là pour une raison de technique que nous exposerons

plus loin.

Voici la marche à suivre pour oblenir ce corps à l’état pur :

L. — 250 à 300 centimètres cubes de liquide de Mayer saccharosé à 6 0/0 dans lequel végéta pendant une quinzaine de jours environ à 27 degrés C. le Mucor Mucedo, sont versés dans une capsule de porcelaine jaugeant 700 centimètres cubes, avec un peu de sable de Fontainebleau (30 grammes à peu près), le tout placé sur un bain-marie bouillant, mais en s'arrangeant pour que le hquide traité ne dépasse pas 80-82 degrés. (Ceci dit en vue du contrôle : voir à ce sujel page 9, paragraphe 5). ;

L'évaporation de celte culture doit être conduite jusqu'à état sirupeux, sans outrepasser une telle concentration.

IT. — Une fois la capsule refroidie, l'extraction proprement dite a lieu au moven de quelques décimètres cubes d’éther — 125 centimètres cubes environ et en tout pour 300 cenlimètres cubes de culture — chaque épuisement se fait à Faide d'un gros agitateur de verre, ou d'une spatule de platine agitée vigoureusement, et 10 à 15 centimètres cubes de solvant. ;

Ceci, 8 à 10 fois consécutivement.

L’extraction peut être considérée comme achevée quand les dernières fractions d'éther ne se colorent plus.

IT. —— Ces extraits éthérés sont recueillis au fur et à mesure dans un tube à essais ou un petit ballon de verre mince en se gardant :

a) de filtrer sur papier, celui-ci relenant le corps cherché :

b) de faire entrer dans le récipient autre chose que léther.

IV. — Plonger dans un bain-marie à 45 degrés environ les 213 du ballon ou du tube, et attendre que ébullition du contenu se soit arrêtée, On doit constater

a) une coloration de plus en plus foncée de l'extrait due à la concentration progressive des principes colorants dissous.

b) un arrêt d'ébullition au-dessus du point normal de l'éther, celui-ci s'en écartant d'autant plus que l'extrait est plus riche en corps cherché.

Il est même nécessaire parfois d'élever au-dessus de 50 degrés la température du bain-marie pour chasser les dernières portions d'éther et faciliter la cristallisation.

V. — Laisser refroidir complètement le bain-marie ; si la culture traitée était activante, le composé lui conférant un tel pouvoir doit commencer à se précipiter tout d'abord le long des parois du récipient puis au fond même de celui-ci, formant dépôt baignant dans un liquide d'aspect plus ou .moins huileux.