CHAPITRE III

INFLUENCE DES AGENTS PHYSIQUES SUR LES FERMENTATIONS DÉTERMINÉES PAR LES FERMENTS SOLUBLES.

Tous les ferments solubles perdent leur propriété caractéristique lorsqu'on porte leur solution aqueuse à une température élevée, mais cependant de beaucoup inférieure à la température d'ébullition de l'eau. On a essayé pour un certain nombre d'entre eux de déterminer exactement cette température qui a été appelée température de destruction du ferment. Nous avons rassemblé cidessous les chiffres qui ont été publiés sur ce sujet.

Ferments. Auteurs. Températures.

Invertine Ad. Mayer (29^ p. 22) 51°

id id (29, p. 24) 65»

id Kjeldahl (63) 70»

Émulsine Em. Bourquelot (o) 67 à 69°

Diastase Brown et Héron (54) 76»

Pepsine (en soi. physiologique). . . Ad. Mayer (29, p. 27) 55 à 60»

Trypsine Lœw (64) 69 à TO"

Présure Ad. Mayer (29, p. 28) 66»

(o) Cette détermination a été faite sur de l'émulsine préparée avec des amandes douces.

On a fait une solution aqueuse d'émulsine à 0 gr. 50 0/0 et on a réparti 120 cent. c. de cette solution dans 12 tubes à essais portant des n»' de 1 à 12 (10 cent. c. par tube). Ces tubes ont été placés, en compagnie d'un tube témoin contenant 10 cent. c. d'eau distillée et un thermomètre, dans un vase plein d'eau, lequel plongeait lui-môme dans l'eau d'un bain-marie.

Le bain-marie était chauffé de telle sorte que la température de l'eau s'élevait environ de 2" par minute. Les tubes ont été retirés successivement à partir du moment où le thermomètre du tube témoin marquait 50», et cela dans l'ordre suivant : le tube n» 1 à 50», le n« 2 à 53», le n» 3 à 56», le n» 4 à 59», le n» 5 à 61», le n» 6 à 63», le n» 7 à 650 et ainsi de suite jusqu'au n» 12 qui a été retiré à 75».

Après refroidissement, on a ajouté dans chaque tube 10 cent. c. d'une solution de sali-

A l'examen de ce tableau, on est immédiatement frappé par la différence assez notable qui existe entre les deux déterminations elfectuées par un même expérimentateur sur l'invertine. En réalité, ces températures critiques ne sont pas constantes et ne peuvent letre. Nous avons déjà insisté sur ce fait que les ferments solubles, tels qu'on les obtient, sont toujours mélangés à des matières étrangères. Nous verrons que beaucoup de substances possèdent la propriété d'amoindrir l'activité des ferments solubles, et nombre d'observations semblent démontrer, que toute substance jouissant de cette propriété vis-à-vis d'un ferment déterminé, doit abaisser la température de destruction de ce ferment.

D'ailleurs, comme l'a établi Ad. Mayerpour l'invertine, la variation de la concentration suffit à elle seule pour faire varier dans certaines limites cette température. Ces réserves faites, il est cependant intéressant de constater que les températures de destruction des ferments solubles' sont assez rapprochées des températures auxquelles se coagulent les matières albuminoïdes.

Lorsque le ferment n'est pas en dissolution, et qu'il a été convenablement desséché, sa température de destruction est alors beaucoup plus élevée. D'après Salkowski on pourrait chauffer l'invertine sèche jusqu'à 160° sans qu'elle perde ses propriétés. La trypsine sèche d'après Al. Schmidt peut être également portée à 160° et n'est détruite qu'à 170°. La pepsine supporte une température de 110° et la diastase une température de 120 à 125°.

Gomme on le voit, on n'a pas déterminé d'une façon précise les températures de destruction des ferments solubles pris à l'état sec, mais ces faits démontrent amplement que ces températures dépassent considérablement celles que nous avons données pour les solutions aqueuses.

Les températures basses ne paraissent pas avoir d'influence nui-

cine à 1 gr. 50 pour cent. c. et on a attendu 24 heures (t" 12» à 15o).

En essayant alors chacun de ces tubes avec la liqueur cupro-potassique ; on a remarqué qu'il y avait eu dédoublement de la salicine dans tous les tubes qui avaient été portés aux températures comprises entre 50° et 67«> inclus. Dans le tube n» 9 (69») il n'y avait pas trace de glucose. En dosant ensuite la proportion de glucose formée dans chacun de ces tubes, on a constaté que cette quantité était la même dans les tubes 1, 2, 3 et 4 ; elle était moindre et de plus en plus faible dans les tubes suivants.

Il résulte de là que dans les conditions de ces expériences la température de destruction de l'ômulsine est située entre 67 et 69» et en outre que ce ferment commence à s'affaiblir à partir de 60».

sible sur les ferments solubles, même lorsqu'ils sont en solution aqueuse. On a refroidi des solutions de diastase bien au-dessous du point de congélation ; la diastase avait conservé ses propriétés.

Les ferments solubles exercent déjà leur action à 0°, et de cette température jusqu'à celle de leur destruction, leur activité éprouve des variations très importantes à connaître tant au point de vue pratique qu'au point de vue théorique. Cette activité croit d'abord avec la température, atteint un maximum, puis décroît, jusqu'à s'éteindre lorsqu'on arrive à la température de destruction. Mais si l'on envisage les produits de la réaction, on est obligé, dans l'étude de cette question, d'examiner à part chacun des deux groupes de ferments que nous avons établis dans le chapitre précédent.

Voyons d'abord ce qui se passe dans l'inversion du sucre de canne par l'invertine. Nous avons sur ce sujet les expériences de Kjeldahl qui suffisent pour donner une idée du phénomène.

Le chimiste danois (63) a fait agir pendant une heure des quantités égales d'une solution d'invertine (10 cent, c.) sur des volumes égaux d'une même solution de sucre de canne à 10 0/0 (50 cent, c.) à différentes températures comprises entre 0 et 70°. Il y a eu interversion à toutes ces températures, sauf à 70°. Les proportions de de sucre interverti dans chacun des essais sont relatées dans le tableau suivant :

Température

Sucre interverti p. 0/0.

Température

Sucre interverti p. 0/0.

Si l'on construisait la courbe de ces résultats, on verrait que la température à laquelle le phénomène est le plus actif — et nous appellerons désormais cette température, température optimale — est située entre 52 et 53°. On verrait en outre que cette courbe monte d'abord assez lentement, puis descend rapidement à partir du maximum. C'est là, pour le dire en passant, une propriété de toutes les courbes représentant l'influence de la température sur les actions physiologiques. Bien que se rapportant à un phénomène unique et déterminé, cette courbe exprime, dans son allure, les changements qui peuvent survenir par suite des variations de la

température, dans Pensemble des manifestations vitales chez les êtres vivants. On le voit nettement pour les végétaux : leur maximum d'activité correspond à une température donnée ; et tandis que la vie est encore possible, un grand nombre de degrés en dessous, elle cesse quelques degrés au-dessus de cette température. Pour les animaux, le parallélisme parait moins frappant; il existe cependant, et il est surtout manifeste chez les animaux à température variable. Dans tous les cas, une chute rapide vers le haut, et par en bas une extinction lente.

Le phénomène est tout différent avec les acides qui déterminent les mêmes réactions que les ferments. Voici par exemple une série d'observations faites par Ad. Mayer (10, p. 66) sur l'inversion du sucre de canne, par l'acide chlorhydrique. Dans chaque essai, ce chimiste traitait 30 cent, cubes de solution de sucre de canne à 10 0/0 par 2 cent, cubes de HGl à 5 0/0 à une température donnée et pendant un temps déterminé. Les résultats sont réunis dans le tableau suivant :

Sucre interverti pour 0/0

Température. Durée de l'action. Total Par heure

30" 30 minutes 6.1 12

Il est clair que l'activité de l'acide a ici un caractère tout autre que celui du ferment. Elle croît rapidement aux températures élevées, et l'on sait d'ailleurs que cet accroissement s'accentue encore davantage, au-dessus du point d'ébullition de l'eau. Dans ce cas, la réaction déterminée en tube scellé, s'effectue avec une extrême rapidité.

Les expériences de Kjeldahl que nous avons rapportées plus haut, ont été faites avec de l'invertine de levûre basse. Avec de l'invertine de levûre haute, le même chimiste a trouvé comme température optimale 56°. D'autres observateurs. Ad. Mayer et Barth, en particulier, ont trouvé encore d'autres températures. On serait tenté d'en conclure qu'il existe plusieurs invertines. Il n'en est rien. La vérité est que les causes qui font varier la température de

destruction d'un ferment soluble, font varier et dans le même sens la température optimale de son action. Si le ferment se trouve en présence d'un agent nuisible, celui-ci, même à faibles doses, abaisse sa température de destruction, et abaisse également la température optimale de son action. Si donc des chiffres différents ont été trouvés pour la température optimale d^un ferment, il faut ici encore, comme pour les températures de destruction, en rapporter la cause, à ce que les produits étudiés renfermaient des proportions variables de matières étrangères. La concordance ne pourra exister que le jour où l'on obtiendra des ferments solubles à l'état de pureté. Et le chiffre donné actuellement par un auteur n'a de valeur absolue que pour la préparation dont il s'est servi.

L'examen des résultats publiés par Kjeldahl nous apprend encore — ce qui d'ailleurs a été constaté directement — qu'un ferment soluble commence à perdre de son activité bien au-dessous de sa température absolue de destruction. Pour tous les ferments du groupe de l'invertine, cet affaiblissement parait tenir à une destruction partielle du ferment. Admettons en effet — ce que nous démontrerons plus loin — qu'un ferment soluble agit proportion, nellement à sa masse ; comme avec ces ferments la réaction ne change pas qualitativement, il faut bien admettre que la masse du ferment a diminué.

Dès lors l'explication des variations d'activité dues aux changements de température est facile. On doit supposer que toute élévation de température favorise le processus fermentaire, comme il en est pour les acides. Mais à partir de 52°, dans les observations de Kjeldahl, la température joint à cette action une action de plus en plus destructive du ferment dont Tefîet est inverse de la première, en sorte que l'élévation de température devient bientôt plus nuisible qu'utile.

Avec la diastase et les ferments solubles qui appartiennent au même groupe, l'influence de la température est plus difficile à interpréter. Gela tient d'une part à ce que, comme nous l'avons dit, la fermentation se fait par phases successives, et d'autre part à ce qu'on n'a pas encore pu doser tous les produits de la réaction.

On a surtout étudié à ce point de vue, les variations de la fermentation diastasique (saccharification de l'empois d'amidon). Nous en parlerons donc avec quelque détail.

Le maltose étant de beaucoup le produit le plus important de cette fermentation, on s'est en général contenté de doser ce sucre, pour apprécier les progrès de la réaction, et on a eu recours pour cela à la liqueur cupro potassique. On l'a même dosé le plus souvent comme glucose, et lorsqu'on a voulu exprimer le travail effectué par la diastase dans un empois déterminé, on a donné la proportion en centièmes de sucre (calculé comme glucose) contenu dans la matière sèche que renfermait la solution. C'est cette grandeur qu'on a appelé, pour abréger, pouvoir réducteur. Soit par exemple un liquide renfermant 3 0/0 de matière sèche et 1 0/0 de sucre (dosé comme glucose) le pouvoir réducteur sera de 33. Comme on sait d'ailleurs que 2 gr. de glucose réduisent autant d'oxyde de cuivre que 3 gr. de maltose, il est facile de calculer ce que les chiffres trouvés comme glucose représentent de maltose.

Bien que différents chimistes {a) aient étudié l'influence de la température sur la saccharification de l'empois d'amidon par la diastase, nous ne rapporterons ici que les expériences de Kjeldahl (65) celles-ci ayant été effectuées dans le même esprit que les expériences du même auteur sur l'invertine dont nous avons parlé plus haut.

Kjeldahl a fait agir à différentes températures pendant quinze minutes 8 ce. d'extrait de malt sur 200 ce. environ d'empois provenant de 10 gr. d'amidon. Les résultats de ces recherches sont les suivants :

Température Pouvoir réducteur

On voit que la température optimale de la diastase est 63°. De la température ordinaire à 63° l'action du ferment augmente lentement ; plus haut elle décroit rapidement. La courbe qui représen-

(a) Voir Recherches sur les propriétés physiologiques du maltose, par M. Em. Bourque lot. Journ. de l'anatomie et de la physiologie, 1886^ p. 62.

terait ^ensemble de ces résultats aurait donc une apparence analogue à celle de l'invertine. Mais c'est là toute la ressemblance, car avec la diastase le processus fermentaire que l'on détermine audessus de G3° diffère de celui que l'on produit au-dessous de cette température. C'est ce que nous allons voir en suivant les progrès de la saccharification diastasique à l'aide de l'eau iodée.

Il convient d'abord de rappeler l'emploi de ce réactif. Lorsqu'on ajoute de l'eau iodée à de l'empois liquide (1 à 4 gr. de fécule de pommes de terre pour 100 c. c. d'eau) au moment où on vient de le mélanger avec une solution aqueuse de diastase, on obtient un liquide bleu, dans lequel on voit flotter de petits grains bleu foncé qui ne sont autre chose que les grains d'amidon gonflés et non encore liquéfiés. Au bout d'un temps variable, qui est d'autant moins long que le liquide renferme plus de diastase, si on répète la même opération, on constate que les grains n'existent plus, ils ont été liquéfiés, mais le liquide est toujours bleu. Un peu plus tard le liquide traité de la même façon prend une teinte bleu-violacée, on a ensuite du violet, du rouge, du jaune, après quoi l'eau iodée ne détermine plus de coloration, alors pourtant que la réaction diastasique est loin d'être terminée.

L'eau iodée peut donc renseigner sur les progrès d'une saccharification d'empois, mais seulement dans les premières phases de la réaction.

Il est d'ailleurs préférable au lieu d'observer la saccharification aux températures élevées, de diviser le phénomène, c'est-à-dire de chauffer préalablement la solution de ferment à ces températures et de la laisser ensuite refroidir pour opérer à la température ordinaire. Cornélius O'Sullivan a observé en effet (66), et je l'ai constaté moi-même, qu'un extrait de malt, une fois chauffé à 68°, par exemple, puis refroidi et ajouté à de l'empois à une température inférieure à 63°, détermine exactement les mêmes réactions que si la saccharification avait été effectuée à 68°.

Voici l'une des séries d'expériences que j'ai relatées dans un travail sur ce sujet (67).

L'empois avait été préparé avec 5 gr. de fécule pour 300 cent. c. d'eau. On en a traité 20 cent. c. d'une part, par 5 c. c. d'une solution de diastase à 0,5 0/0, et d'autre part par 5 cent. c. de cette même solution de diastase préalablement maintenue à 67° pendant 12 heures — température de la fermentation : 22 à 23°.

Nous donnons dans le tableau qui suit, la succession des réactions obtenues avec l'eau iodée pendant la première heure.

Temps écoulé. Diastase non chauffée (5 c. c). Diastase chauffée (5 c. c).

4' ... Grains intacts Grains intacts. ,. .

T ... id. i(j

^' id. Grains disparus. .

15' ... Grains disparus — violacé... Coi. violacé

24' ... Col. lie devin id.

39' ... id. plus faible id.

49' ... id. brun pâle id.

64' ... id. jaune très faible Lie de vin

A partir de la soixante-quatrième minute, le processus s'est continué pour la diastase non chauffée, tandis qu'il n'a pas tardé à s'arrêter pour la diastase chauffée. Dans le premier cas, la réaction étant terminée (au bout de 48 heures), le pouvoir réducteur du produit répondait à celui de 53 centièmes du glucose qu'on aurait pu obtenir par saccharification totale de l'amidon au moyen de l'acide sulfurique étendu. Dans le second cas le pouvoir réducteur répondait seulement à 30,1 centièmes, et l'addition d'une nouvelle proportion de diastase chauffée n'a pas accru ce pouvoir réducteur.

Il ressort de là que l'affaiblissement delà diastase déterminé par les températures supérieures à 63° a pour effet de limiter la réaction à ses premières phases : celles-ci se succédant toutefois aussi rapidement avec la diastase affaiblie qu'avec la diastase naturelle.

Dans une saccharification effectuée à une température inférieure à 63% on obtient toujours finalement du maltose et l'achroodextrine qui est inattaquable par la diastase. Au-dessus de 63° on obtient aussi du maltose et une dextrine, mais celle-ci est encore attaquable par la diastase naturelle, et elle a un poids moléculaire d'autant plus élevé et plus rapproché de celui de l'amidon que la température de chauffe est elle-même plus rapprochée de la température de destruction du ferment.

Quant à Taction de la température sur le ferment lui-même, on ne peut guère faire que des hypothèses à cet égard. Ainsi on pourrait admettre une atténuation du pouvoir hydratant de la diastase ou bien on pourrait considérer celle-ci comme composée de plusieurs ferments se détruisant successivement à partir de 63° à mesure que l'on chauffe davantage.

Les détails que nous venons de donner sur la diastase nous per-

mettront d'être bref pour les autres ferments solubles appartenant au même groupe.

Au reste l'étude de l'activité de ces ferments au point de vue qui nous occupe est assez délicate, parce qu'avec eux il n'y a pas de terme d'action facile à saisir. Lorsqu'on fait agir la pepsine sur de la fibrine ou sur de l'albumine cuite, il n'y a qu'une phase dont le terme puisse être observé à peu près rigoureusement ; c'est celle qui comporte la dissolution delà matière protéique. Et nous savons que cette dissolution ne représente pour ainsi dire que le commencement de la pep Ionisation.

Quoi qu'il en soit, l'influence de la température sur l'activité de la pepsine a été étudiée par A. Petit. Ce chimiste a constaté que la température optimale pour de la pepsine agissant dans un milieu acidulé à 3 p. 1000 de HGl, est 50°^ soit avec la fibrine soit avec l'albumine (40, p. 7 et 11).

D'autres observateurs ont trouvé des températures optimales différentes. Ce sont là des désaccords qui doivent nous étonner moins encore que ceux que nous avons rencontrés pour d'autres ferments solubles. Ici, en effet, intervient une nouvelle cause de variation qui tient à la proportion d'acide renfermée dans la liqueur digérante. Ainsi Ad. Mayer (29, p. 73) en faisant agir de la pepsine sur de Palbumine dans de l'eau acidulée à 1, 5 p. 0/0 d'acide chlorhydrique fumant, a trouvé comme température optimale 36° ; tandis que dans une autre série d'expériences — Peau étant acidulée à 0, 5 p. 0/0, cette température a monté à 55°.

La pepsine en solution aqueuse, comme la diastase, éprouve un certain affaiblissement si on la chauffe à une température voisine de celle de sa destruction. D'après Finkler (68) elle serait transformée en un nouveau corps qu'il appelle isopepsine. Cette modification de la pepsine dissoudrait l'albumine cuite aussi rapidement que la pepsine ordinaire ; mais avec l'isopepsine, le processus ne pourrait dépasser la phase syntonine. L'influence de ces températures élevées paraît donc se rapprocher de celle que nous avons décrite à propos de la diastase.

La peptonisation par la trypsine est également difficile à suivre. On y parvient cependant en mélangeant à une tnême quantité de lait des doses égales de ce ferment, en mettant ces mélanges dans des tubes à essais, et en les exposant au bain-marie, à des températures différentes : la décoloration du lait marquant le terme

de l'action. Duclaux (41, p. 163) a trouvé ainsi que la trypsine d'un microbe, qu'il a décrit sous le nom de Tyroirixtenuis, a son maximum d'action vers 30°.

Fleischmann a examiné de très près l'influence de la température sur la coagulation du lait par la présure et il a observé comme température optimale 41° (41, p. 161). Ad. Mayer a trouvé 39° environ (29, p. 77). Quelques degrés au-dessus de ces températures, à partir de 47°, par exemple, jusqu'à la température de destruction, it n'y a plus qu'une coagulation imparfaite : le coagulum est visqueux. Au-dessous la coagulation est d'autant plus lente à se produire que la température est plus basse. Aux températures inférieures à 20° Fleischmann n'a même plus réussi à la déterminer.

Cette inactivité de la présure au-dessous de 20°, méritait d'être étudiée très attentivement ; elle se présente à nous comme une exception, puisque nous savons que les autres ferments solubles peuvent exercer leur action même à 0". Aussi s'est-on demandé si en donnant à l'action le temps de se produire, elle ne finirait pas par se manifester. La question a été résolue avec une grande précision par Duclaux (27, p. 42). Ce chimiste en opérant à l'abri des infiniment petits a pu conserver pendant un mois à 15° du lait additionné de présure sans obtenir de coagulation. La présure n'agit donc pas au-dessous de 15° et par là s'explique cette pratique séculaire que suivent les fabricants de fromage en déterminant la coagulation du lait à des températures voisines de 30°.

LimÂère. La lumière ne paraît pas avoir d'influence marquée sur les processus fermentaires. Elle n'en a pas non plus sur les ferments en solution sauf sur la présure et l'invertine. D'après Ad. Mayer (29, p. 42) et aussi d'après Duclaux (27, p. 55) une solution aqueuse de présure s'affaiblit notablement lorsqu'on la laisse exposée aux rayons solaires.