CHAPITRE III

PRÉPARATION, CARACTÈRES GÉNÉRAUX ET COMPOSITION CHIMIQUE DES FERMENTS SOLUBLES.

§ ler . — Préparation des ferments solubles.

On ne connaît pas encore de procédé permettant d’obtenir les ferments solubles à l’état de pureté. Ceux que l’on emploie reposent sur ce que ces corps sont précipités par l’alcool de leur dissolution aqueuse ou sur la propriété qu’ils possèdent d’être entraînés par certains précipités dont on détermine la formation au sein des liquides qui les renferment.

Comme les ferments solubles sont toujours retirés de liquides organiques, et comme ceux-ci contiennent d’autres composés précipitables par l’alcool, des albuminoïdes ou certains hydrates de carbone par exemple, on comprend que le précipité obtenu soit un mélange de corps divers. On a

proposé de purifier le produit en le précipitant plusieurs fois à l’aide de l’alcool de ses dissolutions aqueuses. Mais on a observé qu’en opérant ainsi on finissait par aboutir à des préparations inactives. Cela tient en partie à ce que ces ferments 11e sont pas entièrement insolubles dans l’alcool, et qu’on en enlève à chaque manipulation.

Diastase. — Quoi qu’il en soif, l’emploi ménagé de l’alcool, comme précipitant des ferments solubles, donne, pour quelques-uns d’entre eux, de bons résultats. On le recommande surtout pour la préparation de la diastase.

D’après J. Linlner (1), on obtient unediastase très active en opérant ainsi qu’il suit. On fait digérer pendant 24 heures une partie de malt frais ou desséché à l’air dans 2 à 4 parties d’alcool à 20°. On exprime pour retirer le liquide et on ajoute à celuici le double de son volume d’alcool absolu. Il se formé un précipité qui se rassemble en flocons blanc jaunâtre qui ne tardent pas à tomber au fond du vase. 11 est inutile d’employer à cette précipitation une plus grande proportion d’alcool ; on n’augmenterait pas beaucoup le précipité et ce qu’011

ajouterait serait constitué uniquement par une substance gommeuse inerte.

Après un repos suffisant, on essore rapidement sur un filtre, on enlève le produit, on le triture dans un mortier avec de 1 alcool absolu et on filtre de nouveau. Finalement on lave àl éther et on dessèche dans le vide sur l’acide sulfurique. Ce dernier lavage permet d’obtenir la diastase sous la forme d’une poudre légère presque blanche ; s’il était incomplet, la préparation se foncerait sous l’action de l’air et prendrait une consistance cornée nuisible à son emploi.

On peut encore redissoudre cette poudre dans l’eau et la précipiter ensuite par l’alcool absolu comme il vient d’être dit ; on la débarrasse ainsi de quelques matières étrangères qui sont devenues insolubles pendant la première précipitation. Mais il n’y a pas profit à répéter cette manipulation, car on diminue le rendement du ferment sans augmenter son activité.

On a fait diverses tentatives pour obtenir une diastase chimiquement pure, soit en modifiant le procédé, soit en faisant subir au produit des puri-

licaüons ultérieures ; ces tentatives n’ont pas donné de bons résultats.

C’est ainsi que Payen et Persoz, avant d’ajouter l’alcool à la macération de malt, portaient celle-ci à 70°, supposant précipiter par là les matières albuminoïdes proprement dites : mais il résulte des recherches de Lintner que de la diaslase préparée par précipitation à l’aide de l’alcool, et soumise à ce traitement, donne un produit qui ne possède plus que le 1/8 environ de l’activité de la diaslase primitive. Cet affaiblissement trouvera son explication lorsque nous traiterons de l'influence des agents physiques sur les ferments solubles.

On a également proposé, pour purifier la diaslase, de la dissoudre dans l’eau et de précipiter les matières albuminoïdes par le sous-acétate de plomb. Le liquide filtré débarrassé du plomb par l’hydrogène sulfuré, puis filtré de nouveau et enfin additionné d’alcool en quantité suffisante, donnerait un produit pur. C’est en réalité le procédé qui a été employé par Wiirlz pour purifier la papaïne (2). Mais en ce qui concerne la diaslase, il doit être rejeté. Cest du moins ce qui ressort des expériences de Lintner.

PRÉPARATION DES FERMENTS SOLUBLES 6o

Présure. — Pour d’aulres ferments solubles que la diastase, il peut cependant être avantageux de modifier dans quelques détails le procédé opératoire que nous venons de décrire, surtout si l’on a seulement en vue l’obtention d’un produit commercial convenablement actif. Pour retirer la présure des caillettes de veau, on commence par les vider de tous les grumeaux qu’elles renferment et on les lave à grande eau. On les gonfle ensuite et on les fait sécher. La dessiccation a pour effet de coaguler, ou au moins de rendre insoluble, une matière muqueuse gluante qui rend visqueuses et mousseuses les macérations d’estomac frais. Cette matière gélatineuse existe surtout en abondance dans la région de l’estomac qui avoisine le pylore où la muqueuse de l’estomac présente un aspect particulier; aussi enlève-t-on souvent cette partie. Le reste constitue la matière première d’où l’on relire les solutions concentrées de présure employées dans la préparation des fromages.

Comme les caillettes desséchées sont difficilement pénétrables par l’eau, une simple macération à froid de ces organes ne suffit pas pour les épui-

ser. Il faut recourir à l’emploi d’eau à 30 ou 33°, ou mieux, selon le conseil de Soxhlet (3), se servir, à la température ordinaire, d’eau tenant en dissolution 3 à 6 pour 100 de sel marin. On emploie un litre de cette solution pour 60 à 80 grammes de caillettes coupées en petits morceaux et on agite fréquemment.

Même en opérant ainsi, l’extraction ne se fait que très lentement et n’est complète qu’au bout de 5 jours environ. Aussi arrive-t-il souvent que, pendant sa préparation, le liquide devient putride par suite de l’apparition des microorganismes de la putréfaction. Pour éviter cet inconvénient, Soxhlet recommande d’ajouter à ce liquide 4 pour 100 d’acide borique. Cela suffit pour empêcher le développement de ces microorganismes.

Le produit filtré constitue une solution de présure commerciale très active, dont on peut précipiter le ferment à l’aide de l’alcool. Toutefois il faut avoir soin de ne laisser que le moins possible le précipité au contact de l’alcool qui a servi cà le produire, car il y devient de plus en plus cohérent et insoluble dans l’eau.

Pepsine. — Dans le procédé de A. Petit pour la préparation de la pepsine, on se contente de faire macérer la muqueuse stomacale dans 4 fois son volume d’eau distillée renfermant 4 centièmes d’alcool. Après 4 heures de macération, on filtre et on évapore, à une température qui ne doit pas dépasser 40 degrés, dans des vases à large surface (4).

On voit que Petit n’a pas recours à la précipitation par l’alcool : c’est qu’il a été reconnu que le contact de l’alcool fort a\ec la pepsine l’affaiblit rapidement, comme cela arrive avec la présure.

Depuis quelques années, on trouve dans le commerce des pepsines dites en cristaux ou en paillettes. 11 est à peine utile de faire remarquer que la première de ces expressions ne correspond, nullement àla réalité. Les procédés de préparation de ces pepsines, qui sont du reste en général très actives, diffèrent certainement suivant les fabricants, toutefois il est probable qu’ils se rapprochent tous du suivant, qui a été publié récemment (5).

On se sert exclusivement de muqueuses d’estomacs de porc. On lave d’abordces muqueusesàl’eau

froide et on les débarrasse ainsi du mucus, du sang et autres impuretés dont elles sont imprégnées; on les passe ensuite à une sorte de laminoir qui les tend de façon à les aplatir. 30 kilogr. de ces muqueuses, provenant de 125 estomacs environ, sont placés dans un digesleur avec 36 litres d’eau distillée et 500 grammes d’acide chlorhydrique concentré. Le tout est mis à digérer à la température de 38° environ jusqu’à ce que les particules de la muqueuse soient dissoutes. Il faut environ 6 heures pour obtenir une dissolution complète. Les muqueuses se gonflent d’abord et forment une sorte de masse cohérente visqueuse, blanc grisâtre. En continuant la digestion et en agitant fréquemment, la masse se transforme en un magma glaireux d’une transparence homogène. Puis elle perd son homogénéité et l’on voit de fines parcelles rouges se séparer. A ce moment on suspend la digestion ; on laisse refroidir et déposer, après avoir ajouté toutefois à la mixture 60 grammes de choroforme et un peu d’acide sulfureux, afin d’empêcher toute fermentation putride. Le jour suivant, on décante le liquide vert jaunâtre qui recouvre le dépôt et on filtre. On

obtient ainsi, lorsque l’opération est bien conduite, 42 à 45 kilogrammes d’un liquide clair, de consistance un peu sirupeuse, laissant environ 15 kilogr. de dépôt.

La solution claire est alors ou concentrée dans le vide, ou placée dans des cuvettes à bords peu élevés et évaporée à une température qui ne doit pas dépasser 44° jusqu’à réduction à 15 kilogr. environ. On filtre de nouveau, on étend en coucbe mince sur des plaques de verre et on termine la dessiccation dans une étuve convenable. Lapepsine ainsi préparée est en paillettes.

Dans de bonnes conditions on peut obtenir de 2 kilogr., 5 à 3 kilogr. de pepsine avec les quantités ci-dessus.

On prépare de la même façon la pepsine en cristaux, ou pepsine peplone, avec cette différence toutefois que la solution concentrée est étendue en nappes plus épaisses sur les plaques de verre. Après dessiccation, on brise en petits morceaux.

Ces produits, pepsine en paillettes ou pepsine peptone, sont des mélanges de pepsine et de syntonine avec un peu de peptone. On a cherché à

enlever ces impuretés et par conséquent à purifier celte pepsine. Le procédé le meilleur, imaginé à cet effet, repose sur ce fait que lorsqu’on sature par du sulfate de soude une solution de pepsine acidulée, la pepsine se sépare. L’opération se fait à la température de 34° centigrades' et comme la séparation est longue à se produire, on ajoute au liquide, pour prévenir toute décomposition, de l’acide sulfureux de façon à ce qu’il en sente faiblement l’odeur. L’acide sulfureux détruit d’ailleurs plusieurs des substances animales odorantes qui se trouvent dans les solutions de pepsine, en sorte que le produit obtenu est presque inodore.

La pepsine ainsi séparée est à peu près débarrassée des peptones qui restent dans la solution de sulfate de soude. Une fois égouttée et pressée, elle est à peu près pure. On peut du reste la purifier encore en la redissolvant dans de l’eau acidulée parl’acide chlorhydrique, en ajoutant un peud’acide sulfureux et en dialysant le mélange. La pepsine dialyse très lentement, tandis que les peptones, le sulfate de soude, le chlorure de sodium et la syntonine dialysent beaucoup plus rapidement en solu-

lion acide. Lorsqu’on juge qu’une proportion suffisante de sulfate de soude est éliminée, la portion non dialysée est évaporée dans le vide, soit à sec et pulvérisée, soit jusqu’à un certain degré de concentration, puis étalée sur des plaques de verre et séchée en paillettes. Ces paillettes sont un peu opaques et présentent une saveur légèrement amère, rappelant celle du sulfate de soude.

Les trois exemples que nous venons d exposer suffisent pour donner une idée des procédés employés dans l’industrie pour la préparation des ferments solubles. Il nous reste à dire quelques mots de ceux qui ont été ou qui sont encore employés dans les laboratoires et qui, dans certains cas, pai exemple lorsqu’on veut rechercher un ferment dans une plante ou dans une portion de tissu, peuvent présenter quelques avantages.

Au lieu d’eau comme dissolvant, Wittich (6) a proposé d’employer la glycérine, qui enlève également bien aux tissus animaux et végétaux les ferments solubles qu’ils renferment, tout en donnant des solutions qui ne se putréfient pas.

Avec les moisissures que l’on peut cultiver sur

des liquides nutritifs, il n’est même pas utile de les triturer dans un dissolvant (eau ou glycérine) pour en retirer lesLerments qu’ilsproduisentetlesétudier.

L Aspergillus niger V. Tlig. est une de ces moisissures. On la cultive à l’étuve à 30° ou 34° sur du liquide de Raulin, et lorsqu’elle est arrivée à maturité complète, on retire la cuvette de l’étuve. On siphone le liquide nutritif, on le remplace par de 1 eau distillée et on abandonne à la température du laboi alon e. Au bout de 1 2 lieures, on jette cette première eau qu on remplace par une quantité à peu près égale de nouvelle eau. Le ferment excrété Par la plante se dissout dans l’eau sous-jacente, et, au bout de 2 ou 3 jours, on a une solution très active qui, apiès tiltration, est d’une limpidité parfaite.

On prépare aussi certains ferments solubles en les entraînant dans des précipités qu’on forme au sein de leur solution aqueuse. On enlève ensuite la substance inerte à 1 aide d’un dissolvant approprié. Les manipulations sont assez délicates dans ces procédés ; aussi n’ont-ils servi jusqu’à présent quepour essayer d’obtenir des ferments à l’état de pureté.

INous indiquerons seulement, parmi ces procé-

dés, celui qui a été proposé par Briicke eu 1 S6 1 (7) pour la préparation de la pepsine. On fait macérer la muqueuse de l’estomac à 38 dans de 1 eau renfermant 3/100 d’acide phosphorique. 11 se produit une véritable digestion et la muqueuse se dissout presqu’ entièrement. On filtre et on ajoute au liquide de l’eau de chaux jusqu'il neutralisation presque complète. Le précipité de phosphate de chaux qui se forme entraîne la pepsine. On le sépare et on le redissout à 1 aide d acide cliloi hydrique dilué. Pour enlever la pepsine de ce liquide acide, on l’additionne d’une solution éthéro-alcoolique de cholestérine ; le ferment se précipite avec la cholestérine. Enfin on jette ce nouveau précipité sur un filtre et, après l’avoir lavé, on le traite par l’éther qui dissout la cholestérine et laisse la pepsine sous la forme d’une solution aqueuse qui occupe le fond du vase.

§ 2. — Caractères généraux et composition chimique des ferments solubles.

Lorsque les ferments solubles ont été conve

nablement préparés, ils se présentent sous la forme d’une poudre blanche, amorphe, soluble dans l’eau. La solution se trouble plus ou moins, mais toujours faiblement, parla chaleur. Elle précipite par l’alcool.

Lorsqu’on la fait passer à travers un filtre en terre poreuse, celui-ci retient une partie du ferment.

Ce sont là les seuls caractères physiques ou chimiques qu’on peut regarder comme communs à tous les ferments solubles. La propriété de précipiter par certains réactifs généraux des albuminoïdes, le tannin, le sublimé, le sous-acétate de plomb, qu’on croyait autrefois appartenirà ces composés, n’existe plus lorsque le produit a été purifié.

Elle n’existe pas non plus pour certaines solutions fermenlaires, même très actives, telles que la solution obtenue avec YAspergillus nïger dont nous avons parlé à la page 72. Cette solution ne précipite ni par le tannin, ni par le sublimé (7 bis). Enfin nous avons même vu l’un des réactifs indiqués ci-dessus, le sous-acétate de plomb, employé pour débarrasser certains ferments des impuretés qu’ils renferment.

On ne peut pas même dire que le pouvoir de décomposer l’eau oxygénée, considéré par Schonbein (8) comme une propriété générale des ferments solubles, appartienne réellement à ces composés. Jacobson (9), en effet, a démontré que l’émulsine et la diaslase du pancréas, soumises à certaines influences, perdent cette piopriété tout en conservant leur activité fermentaire. Ainsi, une émulsion d’amandes amères et une macération du pancréas maintenues pendant une heure, la Ve à la température de 72°, la 2e à celle de 62°, puis refroidies, n’exercent plus aucune action sur l’eau oxygénée tout en conservant leur pouvoir ferment. Il en est de même si on chauffe pendant une heure de la poudre d émulsine à 130° ou de la poudre de pancréatine du commerce à 120° ; ces deux matières deviennent inertes par rapport à l’eau oxygénée et sont cependant encore capables d’agir, la première sur l’amygdaline et la seconde sur l’empois d’amidon. 11 y a plus : lorsque l’un des ferments, l’émulsine par exemple, a servi à décomposer un excès d’eau oxygénée, si on le précipite par l’alcool du

liquide dans lequel il est en solution et si, après l’avoir desséché, on le redissout dans l’eau et essaie de nouveau, on constate qu’il n’agit plus sur l’eau oxygénée et décompose pourtant encore l’amygdaline.

Il faudrait donc admettre que la propriété de décomposer l’eau oxygénée, si elle appartient réellement au ferment, est indépendante de ses propriétés fermentaires. Il paraît plus probable qu’elle est particulière à quelque impureté qui accompagne le ferment.

La vérité est, comme nous l’avons déjà dit, qu’on ne connaît pas les ferments solubles à l’état de pureté. De là les variations dans les propriétés chimiques qu’on leur attribue, propriétés qui, après tout, ne sont peut-être que celles des substances étrangères avec lesquelles ils sont mélangés. Cette proposition ressort encore davantage à l’examen du tableau suivant, dans lequel se trouvent rassemblées les principales analyses élémentaires qui ont été faites'des ferments solubles.

Carbone

Hydrogène

Azote

Soufre

Cendres

Auteurs

Diastase

Krauch.

id.

Dubrunfaul.

Invertine

Barth.

id.

Bonalh.

id.

Ad. Mayer.

Èmulsine

Buckland-Bull.

id.

Aug. Schmidt.

Papaïne

Wurtz.

Blanc d’œuf non coagulé.

Dumas etCahours

Comme on le voit, ces analyses sont loin de concorder entre elles. Le chiffre qui représente les proportions d’azote varie en particulier dans des limites très étendues. Dans le cas où il est le plus élevé, la composition élémentaire du produit se rapproche de celle des matières albuminoïdes ; dans le cas où il est le plus faible, la proportion d’azote tend vers 0. De là deux opinions diamétralement opposées sur les résultats possibles d’une purification complète des ferments solubles. Pour les uns cette purification doit conduire à des corps possédant la composition des albuminoïdes, pour les autres elle doit mener à des composés sans azote. C’est ainsi que Lintner appliquait à la diastase la première hypothèse, tandis que Hirscheld concluait de ses recherches que ce môme

ferment doit être un hydrate de carbone, une sorte de matière gommeuse (10).

Si l’on s’en rapportait uniquement à l’analyse chimique, il faudrait considérer aussi la laccase retirée par G. Bertrand du latex de l’arbre à laque, comme une matière gommeuse, car elle ne renferme presque pasd’azote, donnede l’acide mucique quand on la traite par l’acide azotique de densité 1, 2 et engendre, par hydrolyse, du galactose et de l’arabinose (11).

11 n’y a en résumé qu’une conclusion à tirer de ces faits, c’est qu’il ne faut pas chercher la caractéristique des ferments solubles dans leur composition chimique. Comme nous allons le montrer dans les chapitres suivants, elle est tout entière dans les réactions qu’ils déterminent et dans les lois qui régissent ces réactions.

BIBLIOGRAPHIE

(1) J. \Anlner, Studien iiber Diastase (Sonrn. f. prakt. Chem. XXXIV, 1886, p. 378).

(2) Würtz, Sur la papaïne (Comptes rendus, XC, 1880, p. 379, elXCI, 1880, p. 787).

(3) F. Soxhlet, D arstellung haltbarer Labflùssigkeiten (Milchzeilung, 1877, n03 37 et 48).

(4) A. Petit, Recherches sur la pepsine (Paris, 1881, p. 20).

(а) The Manufacture of Pepsin and Détermination of its proteolytic Power (Pharmaceutical journal and Transactions, janvier 1893, p. 388).

(б) Wittich, Ueber eine neue Méthode zur Darstellung kiinstlicher Verdauungs ftüssigkciten (Pflüger’s Arckiv, II, 1869, p. 193).

(7) Brücke, Beilràge zur Lehre von der Verdauung (Wien. Akadera, Sitzungsb., XLIII, Abth. 2, 1861, p 601).

(7 bis) Era. Bourquelot et Iiérissey, Arrêt de la fermentation alcoolique sous l’influence de substances sécrétées par une moisissure (Société de Biologie, séance du 27 juillet 1895).

(8) Schônbein, Ueber das Wasserstoff superoxyd als Mittel die fermentartige Besckaffenheit organischer MaLerien zu erkennen (Journ. f. prakt. Chemie, CVI, 1869, p. 257).

(9) J. Jacobson, Untersuchung en liber die lôsliche Fermente (Zeitschr. f. physiol. Chemie, XVI, 1892, p. 340).

(10) Hirscbeld, Ueber die chemische Natur der vegetabilischen Diastase (Arch. f. d.ges. Physiol., XXXIX, 1886, p. 499).

(11) G. Bertrand, Recherches sur le latex de l’arbre à laque du Tonkin (Bull, de la Soc. chimique, 3° série, t. XI, p. 718, 1894).